獨(dú)圣活血片中8種成分的含量測(cè)定及聚類(lèi)分析、主成分分析

孫德國(guó)，梁 璇，馬靈珍(.遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院藥學(xué)部，沈陽(yáng) 0032；2.亳州職業(yè)技術(shù)學(xué)院藥學(xué)院，亳州 236800)

獨(dú)圣活血片由三七、醋延胡索、當(dāng)歸、雞血藤、大黃、香附(四炙)和甘草7味中藥材制成，主治跌打損傷、瘀血腫脹以及氣滯血瘀所致的痛經(jīng)，現(xiàn)收載于《中國(guó)藥典》2015年版一部[1]，質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)和文獻(xiàn)報(bào)道[2]僅對(duì)該制劑所含三七皂苷R1和人參皂苷Rg1進(jìn)行了定量檢測(cè)?，F(xiàn)代研究表明，獨(dú)圣活血片聯(lián)合雙氯芬酸鈉可有效改善患者臨床癥狀和機(jī)體血液流變學(xué)指標(biāo)，促進(jìn)肢體功能恢復(fù)[3]，對(duì)軟組織損傷療效顯著[4]；其聯(lián)合五子衍宗丸可增加月經(jīng)量過(guò)少患者的月經(jīng)量與持續(xù)月經(jīng)周期，對(duì)腎虛血瘀型月經(jīng)過(guò)少癥具有良好的治療效果[5]。中藥及其制劑所含成分復(fù)雜，藥材中主要成分受產(chǎn)地、采收季節(jié)以及炮制加工方法等多種因素的影響，單味藥材所含成分不能全面反映中藥及其制劑，尤其是中成藥復(fù)方制劑的整體質(zhì)量，多指標(biāo)成分評(píng)價(jià)模式已逐步應(yīng)用于其質(zhì)量控制中，同時(shí)通過(guò)聚類(lèi)分析和主成分分析等化學(xué)計(jì)量學(xué)分析方法，將多指標(biāo)成分評(píng)價(jià)模式提供的數(shù)據(jù)信息進(jìn)行充分整合，有利于揭示中藥及其制劑復(fù)雜成分間隱藏的規(guī)律，避免綜合評(píng)價(jià)時(shí)主觀加權(quán)的弊端。獨(dú)圣活血片方中三七散瘀止血、消腫定痛，醋延胡索活血、行氣、止痛，共為君藥；當(dāng)歸和雞血藤活血補(bǔ)血、調(diào)經(jīng)止痛，大黃逐瘀通經(jīng)、瀉下攻積，合為臣藥；香附(四炙)理氣寬中、調(diào)經(jīng)止痛，為佐藥；甘草緩急止痛、調(diào)和諸藥，為使藥。7味中藥所含成分相互協(xié)同、互相制約，共奏活血消腫、理氣止痛之功。為了確保產(chǎn)品質(zhì)量和臨床療效的穩(wěn)定性，本實(shí)驗(yàn)根據(jù)“君臣佐使”中醫(yī)配伍理論，采用HPLC法對(duì)獨(dú)圣活血片中君藥醋延胡索主要活性成分延胡索乙素、紫堇堿和四氫小檗堿，臣藥雞血藤代表性成分兒茶素、表兒茶素和美迪紫檀素，佐藥香附(四炙)主要活性成分香附烯酮和α-香附酮的含量進(jìn)行同時(shí)測(cè)定，建立獨(dú)圣活血片多指標(biāo)成分質(zhì)量控制模式，并采用SPSS 26.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)所測(cè)8種成分的含量進(jìn)行聚類(lèi)分析和主成分分析，有助于藥品生產(chǎn)企業(yè)和監(jiān)管部門(mén)不斷完善該制劑的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)，為控制該制劑的整體質(zhì)量提供參考。

1 儀器與試藥

1.1儀器 Waters 2695型高效液相色譜儀(美國(guó)Waters公司)；Sartorius BP211D型電子天平(德國(guó)Sartorius公司)；KQ-250E型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)。

1.2試藥 延胡索乙素(質(zhì)量分?jǐn)?shù)為99.8%，批號(hào)110726-201819)、兒茶素(質(zhì)量分?jǐn)?shù)為99.2%，批號(hào)110877-201604)、表兒茶素(質(zhì)量分?jǐn)?shù)為99.7%，批號(hào)110878-201703)和α-香附酮對(duì)照品(質(zhì)量分?jǐn)?shù)為99.4%，批號(hào)110748-202016)，均購(gòu)于中國(guó)食品藥品檢定研究院；紫堇堿(質(zhì)量分?jǐn)?shù)為99.9%，批號(hào)PRF10022126)和四氫小檗堿對(duì)照品(質(zhì)量分?jǐn)?shù)為98.8%，批號(hào) PRF8050941)，購(gòu)于成都普瑞法科技開(kāi)發(fā)有限公司；美迪紫檀素(質(zhì)量分?jǐn)?shù)為100.0%，批號(hào)18040322)和香附烯酮對(duì)照品(質(zhì)量分?jǐn)?shù)為95.5%，批號(hào)18051522)，購(gòu)于上海同田生物技術(shù)股份有限公司；乙腈為色譜純，其他試劑為分析純。獨(dú)圣活血片(薄膜衣片，批號(hào)：1904003，1905004，1905005，1906006，1909009，1909010，2003001，編號(hào)分別為S1～S7；糖衣片，批號(hào)：1908012，1910014，1911018，編號(hào)分別為S8～S10)，均購(gòu)于太極集團(tuán)四川綿陽(yáng)制藥有限公司。

2 方法與結(jié)果

2.1溶液的制備

2.1.1混合對(duì)照品溶液 精密稱(chēng)取8種成分對(duì)照品各適量，用體積分?jǐn)?shù)為70%的乙醇制成質(zhì)量濃度分別為0.592，0.484，0.356，1.094，1.258，0.116，1.452，0.716 mg·mL-1的混合對(duì)照品儲(chǔ)備液。精密吸取上述混合對(duì)照品儲(chǔ)備液0.1，0.2，0.5，1.0，1.5，2.0 mL，分別用體積分?jǐn)?shù)為70%的乙醇稀釋至20 mL，制成系列質(zhì)量濃度的線性混合對(duì)照品溶液Ⅰ～Ⅵ；取線性混合對(duì)照品溶液Ⅳ作為混合對(duì)照品溶液(8種成分質(zhì)量濃度分別為29.6，24.2，17.8，54.7，62.9，5.8，72.6，35.8 μg·mL-1)。

2.3線性關(guān)系考察 精密吸取2.1.1項(xiàng)下制備的線性混合對(duì)照品溶液Ⅰ～Ⅵ各10 μL，按照2.2項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定獨(dú)圣活血片中8種成分的峰面積，分別以8種成分質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(x)、峰面積為縱坐標(biāo)(y)進(jìn)行線性回歸，得8種成分的回歸方程及線性范圍，見(jiàn)表1。

2.1.3陰性樣品溶液 按照獨(dú)圣活血片質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)[1]項(xiàng)下處方工藝，分別制備缺香附(四炙)、雞血藤和醋延胡索的陰性樣品，再按照2.1.2項(xiàng)下方法制成陰性樣品溶液。

2.10主成分分析 以表3中8種成分的含量測(cè)定結(jié)果為變量，采用SPSS 26.0軟件對(duì)10批獨(dú)圣活血片的含量數(shù)據(jù)進(jìn)行主成分分析，計(jì)算相關(guān)系數(shù)的特征值和方差貢獻(xiàn)率，結(jié)果見(jiàn)表4。依據(jù)累積方差貢獻(xiàn)率大于85.000%的原則，以初始特征值大于1為提取標(biāo)準(zhǔn)，由表4可知，前3個(gè)主成分初始特征值為3.281，1.882，1.794，均大于1，對(duì)應(yīng)的方差貢獻(xiàn)率分別為41.009%，23.528%，22.426%，累積方差貢獻(xiàn)率為86.962%，大于85.000%，表明提取前3個(gè)主成分即可代表獨(dú)圣活血片8種成分86.962%的信息，可用于獨(dú)圣活血片的質(zhì)量評(píng)價(jià)。

2.6穩(wěn)定性考察 按照2.1.2項(xiàng)下方法臨用新配1份供試品溶液，于0，3，6，12，18，24 h進(jìn)樣檢測(cè)8種成分的峰面積，結(jié)果8種成分峰面積的RSD值分別為0.69%，0.93%，1.05%，0.57%，0.71%，1.12%，0.60%，1.02%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.1.2供試品溶液 取獨(dú)圣活血片，除去包衣后研成細(xì)粉，精密稱(chēng)取1.0 g，加入體積分?jǐn)?shù)為70%的乙醇25 mL，稱(chēng)定質(zhì)量，超聲提取30 min，放冷后用體積分?jǐn)?shù)為70%的乙醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，0.45 μm微孔濾膜濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

表1 8種成分的回歸方程和線性范圍

圖1 HPLC圖

2.8樣品的含量測(cè)定 取10個(gè)批次(編號(hào)S1～S10)獨(dú)圣活血片，按照2.1.2項(xiàng)下方法制成供試品溶液，各批次平行制備3份，按照2.2項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣檢測(cè)8種成分的峰面積并計(jì)算含量，結(jié)果見(jiàn)表3。

2.7回收率實(shí)驗(yàn) 取8種成分含量均已知的獨(dú)圣活血片適量，除去包衣，研成細(xì)粉，精密稱(chēng)取0.5 g，共9份，每3份為1組，依據(jù)《中國(guó)藥典》2015年版四部規(guī)定(對(duì)照品加入量為樣品原有量的50%，100%，150%)，分別精密加入混合對(duì)照品溶液(已知樣品含量，根據(jù)2.1.1項(xiàng)下方法另行配制，8種成分質(zhì)量濃度分別為0.326，0.258，0.192，0.622，0.754，0.068，0.892，0.406 mg·mL-1)0.5，1.0，1.5 mL，再按照2.1.2項(xiàng)下方法制成加樣供試品溶液，按照2.2項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定8種成分的峰面積并計(jì)算含量，平均回收率及RSD值見(jiàn)表2。

2.2色譜條件 采用Waters SunFire C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)色譜柱，柱溫：30 ℃。流動(dòng)相：乙腈(A)-1 mL·L-1冰醋酸(B)，梯度洗脫(0～14.0 min，18.0%A；14.0～26.0 min，18.0%A～23.0%A；26.0～40.0 min，23.0%A～54.0%A；40.0～57.0 min，54.0%A～81.0%A；57.0～65.0 min，81.0%A～14.0%A)。流速：0.9 mL·min-1；進(jìn)樣量：10 μL；檢測(cè)波長(zhǎng)分別為242 nm (0～26.0 min檢測(cè)香附烯酮和α-香附酮)[6-9]，280 nm(26.5～65.0 min檢測(cè)兒茶素、表兒茶素、美迪紫檀素、延胡索乙素、紫堇堿和四氫小檗堿)[10-17]。精密吸取2.1項(xiàng)下制備的混合對(duì)照品溶液、供試品溶液和陰性樣品溶液各10 μL，進(jìn)樣檢測(cè)，結(jié)果供試品溶液色譜圖中8種成分色譜峰峰形對(duì)稱(chēng)，分離度均大于1.5，理論板數(shù)按照各成分色譜峰計(jì)算均≥4 500，陰性樣品對(duì)8種成分的含量測(cè)定無(wú)干擾，見(jiàn)圖1。

基于STM32的嵌入式遠(yuǎn)程視頻監(jiān)控系統(tǒng)設(shè)計(jì)………………………………馬躍輝, 冀保峰, 程一淼,等(52)

2.5重復(fù)性考察 取獨(dú)圣活血片，按照2.1.2項(xiàng)下方法制成6份供試品溶液，按照2.2項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，記錄8種成分的峰面積并計(jì)算含量，結(jié)果8種成分含量的RSD值分別為1.46%，0.62%，1.76%，1.01%，0.93%，1.85%，0.87%，1.36%，表明實(shí)驗(yàn)重復(fù)性良好。

傳統(tǒng)運(yùn)維管理中，資料缺失和查詢(xún)不便的情況時(shí)有發(fā)生，而資料中也普遍存在信息多處表達(dá)不一致的情況（圖紙與圖紙之間、圖紙與表單之間等），BIM技術(shù)的出現(xiàn)很好地解決了這一問(wèn)題。BIM信息具有完備性、一致性和可協(xié)調(diào)性的特點(diǎn)，可將建筑全過(guò)程信息進(jìn)行存儲(chǔ)和分析，同時(shí)實(shí)現(xiàn)一處改變處處更新，保證信息的一致性。通過(guò)建立基于構(gòu)件的數(shù)據(jù)庫(kù)（某設(shè)備的所有參數(shù)，如型號(hào)、廠家、日期和維護(hù)信息等，都儲(chǔ)存在設(shè)備名下），存儲(chǔ)和查詢(xún)大量的建筑信息，直觀方便，并與人們習(xí)慣相符合，如圖3所示。

表2 回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果 (n=9)

2.4精密度考察 取2.1.1項(xiàng)下制備的混合對(duì)照品溶液，按照2.2項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，測(cè)得8種成分峰面積的RSD值分別為0.74%，0.82%，1.01%，0.63%，0.59%，1.06%，0.55%，0.98%，表明儀器精密度良好。

表3 獨(dú)圣活血片中8種成分的含量測(cè)定結(jié)果

2.9聚類(lèi)分析 為考察不同批次獨(dú)圣活血片中8種成分的含量差異，本實(shí)驗(yàn)采用SPSS 26.0軟件系統(tǒng)聚類(lèi)分析法(聚類(lèi)方法：組間連接；測(cè)量區(qū)間：歐氏距離)對(duì)10個(gè)批次的獨(dú)圣活血片進(jìn)行聚類(lèi)分析，結(jié)果見(jiàn)圖2。由圖2可知，當(dāng)類(lèi)間距離為20時(shí)，10批樣品可聚為2類(lèi)，樣品S1、S3、S2、S5、S7、S6和S4聚為第一類(lèi)，樣品S8、S10和S9聚為第二類(lèi)。從分類(lèi)結(jié)果可知，獨(dú)圣活血片薄膜衣片聚為一類(lèi)，糖衣片聚為一類(lèi)，同一類(lèi)型獨(dú)圣活血片質(zhì)量相對(duì)穩(wěn)定，可能與不同類(lèi)型片劑的生產(chǎn)工藝控制參數(shù)差異以及不同批次間產(chǎn)品所用原藥材的批間差異有關(guān)。

圖2 聚類(lèi)分析樹(shù)狀圖

黨建工作可以提升職工對(duì)熱力公司企業(yè)精神內(nèi)涵的理解，具體表現(xiàn)為以下幾個(gè)方面：第一，黨建工作具有政治優(yōu)勢(shì)，是熱力公司形成具有我國(guó)特色的企業(yè)精神的基石。第二，黨建工作可以促使優(yōu)秀企業(yè)文化的形成，使得職工產(chǎn)生歸屬感，進(jìn)而使得熱力公司健康發(fā)展。第三，在熱力公司的健康發(fā)展以及深化改革中，基層黨組織具有十分重要的作用，例如宣傳企業(yè)文化、弘揚(yáng)工匠精神和培訓(xùn)管理人才等。

12月7日，海爾廚電以“廚道天下·萬(wàn)象生”為主題在青島舉辦發(fā)布會(huì)。會(huì)中，海爾以智慧家電、安全防護(hù)、技術(shù)升級(jí)為主題，為消費(fèi)者呈現(xiàn)了一系列尖端家電產(chǎn)品。其中海爾擁有專(zhuān)利的“防干燒”技術(shù)成為在場(chǎng)消費(fèi)者與媒體最關(guān)注的話題之一。

表4 特征值和方差貢獻(xiàn)率

3 討論

3.1流動(dòng)相的選擇 本實(shí)驗(yàn)在選擇流動(dòng)相時(shí)，分別考察了甲醇-水[7，10-11，18]、乙腈-1 mL·L-1磷酸[12]、乙腈-1 mL·L-1甲酸[13-14]和乙腈-1 mL·L-1冰醋酸[19-20]4個(gè)流動(dòng)相體系。結(jié)果顯示，以乙腈-1 mL·L-1冰醋酸為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫時(shí)基線平穩(wěn)，8種成分色譜峰的分離度及對(duì)稱(chēng)度最佳，通過(guò)對(duì)流動(dòng)相比例的不斷優(yōu)化，最終采用2.2項(xiàng)下的流動(dòng)相及梯度洗脫程序?qū)Κ?dú)圣活血片中8種成分的含量進(jìn)行同時(shí)檢測(cè)。

3.2供試品處理方法的選擇 本實(shí)驗(yàn)分別考察了不同提取溶劑(甲醇[6-7，10，18]、體積分?jǐn)?shù)為95%的乙醇、體積分?jǐn)?shù)為70%的乙醇[12，19]和體積分?jǐn)?shù)為50%的乙醇[20-21])、不同提取方法(超聲提取[6-7，10，18]和加熱回流提取[12-13，19])對(duì)獨(dú)圣活血片中8種成分綜合提取率的影響，結(jié)果顯示，以體積分?jǐn)?shù)為70%的乙醇超聲提取時(shí)，8種成分的綜合提取率較高，雜質(zhì)成分干擾較小。同時(shí)對(duì)提取時(shí)間不斷摸索，最終確定采用體積分?jǐn)?shù)為70%的乙醇超聲提取30 min制備供試品溶液。

一方面，傳統(tǒng)的數(shù)據(jù)庫(kù)實(shí)驗(yàn)教學(xué)，一般采用教師先行講授理論知識(shí)，學(xué)生再上機(jī)練習(xí)的模式。理論與實(shí)驗(yàn)學(xué)時(shí)分開(kāi)進(jìn)行，表面上看是理論與實(shí)踐相結(jié)合的形式，但是學(xué)生在學(xué)習(xí)理論知識(shí)后，沒(méi)能及時(shí)地進(jìn)行上機(jī)操作，在一定程度上弱化了對(duì)理論知識(shí)的理解，而且會(huì)為后續(xù)的上機(jī)操作制造困難，降低整體的學(xué)習(xí)效率。因此，在教學(xué)過(guò)程中，需要實(shí)驗(yàn)內(nèi)容與理論內(nèi)容同時(shí)進(jìn)行，每節(jié)課都要留出適當(dāng)?shù)臅r(shí)間，讓同學(xué)們進(jìn)行實(shí)踐操作。

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)對(duì)獨(dú)圣活血片中主要藥效成分延胡索乙素、紫堇堿、四氫小檗堿、兒茶素、表兒茶素、美迪紫檀素、香附烯酮和α-香附酮含量的同時(shí)測(cè)定，建立了該制劑的多指標(biāo)成分質(zhì)量控制模式，同時(shí)采用聚類(lèi)分析、主成分分析等化學(xué)計(jì)量學(xué)手段對(duì)不同企業(yè)生產(chǎn)的10批復(fù)方獨(dú)圣活血片質(zhì)量進(jìn)行了綜合評(píng)價(jià)。所建立的方法操作簡(jiǎn)便、結(jié)果準(zhǔn)確，為全面、科學(xué)地評(píng)價(jià)獨(dú)圣活血片整體質(zhì)量提供了參考。