中藥和食品中大豆異黃酮分析方法的研究進(jìn)展

徐 碩，金鵬飛，徐文峰，吳學(xué)軍，姜文清(北京醫(yī)院藥學(xué)部，國家老年醫(yī)學(xué)中心，中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院老年醫(yī)學(xué)研究院，藥物臨床風(fēng)險(xiǎn)與個(gè)體化應(yīng)用評(píng)價(jià)北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100730)

大豆異黃酮是以3-苯并吡喃酮為母核的化合物群，其中主要成分有6種，分別是大豆苷(daidzin)、黃豆黃苷(glycitin)、染料木苷(genistin)、大豆苷元(daidzein)、黃豆黃素(glycitein)和染料木素(genistein)[1-2]。大豆制品因加工方法不同，其中異黃酮含量存在差異，發(fā)酵大豆食品以不含糖苷異黃酮為主，配糖體異黃酮含量較低，而非發(fā)酵食品和大豆粉的異黃酮含量高于一般傳統(tǒng)大豆食品的2～3倍，以大豆苷和染料木苷為主[3]。大豆異黃酮的化學(xué)結(jié)構(gòu)與人體內(nèi)分泌的雌激素雌二醇(E2)很相似，能在一定條件下表現(xiàn)出類似雌激素的生物活性，對(duì)內(nèi)分泌與代謝系統(tǒng)疾病具有良好的調(diào)節(jié)改善作用[4]，可預(yù)防心血管疾病、延緩衰老、降低乳腺癌和前列腺癌等疾病的發(fā)病率、緩解更年期雌激素分泌減少而引起的停經(jīng)期綜合征和骨質(zhì)疏松癥、抗氧化和降低膽固醇等[3，5-8]。因大豆異黃酮具有重要的生物活性，有必要對(duì)其進(jìn)行深入研究。本文對(duì)近年來中藥和食品中大豆異黃酮的分析方法進(jìn)行綜述。

1 大豆異黃酮的分析方法

1.1薄層掃描法 徐艷春等[9]利用薄層掃描法，建立了紅曲及其制劑血脂康中大豆苷元的含量測(cè)定方法。樣品用體積分?jǐn)?shù)為75%的乙醇提取后過氧化鋁柱，用體積分?jǐn)?shù)為75%的乙醇洗脫，將洗脫液蒸干，用氯仿-甲醇(2∶1)定容。以環(huán)己烷-乙酸乙酯-甲醇(5∶4∶0.7)為展開劑，硅膠GF254預(yù)制板，UV 254 nm處觀察熒光淬滅斑點(diǎn)，結(jié)果大豆苷元與其他成分分離良好，可以定量。掃描條件為：測(cè)定波長λS=295 nm，參比波長λR=350 nm，雙波長反射法鋸齒掃描，線性化系數(shù)SX=7。結(jié)果顯示，大豆苷元點(diǎn)樣量在0.1～0.5 μg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，平均回收率為98.7%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為5.00%。

周曉霞[10]建立了測(cè)定中藥葛根、粉葛中大豆苷元含量的薄層掃描法。樣品用甲醇提取，以硅膠G板為薄層吸附劑，展開劑為三氯甲烷-無水乙醇(10∶1)，在激發(fā)波長λex=260 nm處掃描大豆苷元色譜峰的熒光強(qiáng)度。結(jié)果顯示，大豆苷元的點(diǎn)樣量在0.048 8～0.244 0 μg范圍內(nèi)與其薄層熒光掃描色譜峰面積呈良好的線性關(guān)系，測(cè)得葛根、粉葛樣品中大豆苷元的含量分別為0.323%，0.059 8%。

1.2紫外分光光度法 張玉梅等[11]通過紫外分光光度法，建立了一種檢測(cè)食物中大豆異黃酮含量的快速分析方法。以金雀異黃素(即染料木素)為對(duì)照品，在其紫外最大吸收峰259 nm波長處測(cè)定大孔吸附樹脂法配合溶劑法提取制得的大豆異黃酮試樣的含量，結(jié)果試樣中總異黃酮的含量以金雀異黃素計(jì)算為38.7%，平均回收率為99.86%，RSD值為2.6%，適用于保健食品中大豆異黃酮的含量測(cè)定。

付鈺潔等[12]利用紫外分光光度法，建立了檢測(cè)大豆提取物中大豆異黃酮含量的快速分析方法。以葛根素為對(duì)照品，在其紫外最大吸收峰250 nm波長處測(cè)定，脫脂大豆粉樣品采用超聲波循環(huán)回流提取25 min，提取液經(jīng)高速離心，取上清液用蒸餾水稀釋后進(jìn)行分析。結(jié)果顯示，葛根素質(zhì)量濃度在2.0～60.0 mg·L-1范圍內(nèi)呈良好線性關(guān)系，樣品的平均回收率為99.87%，RSD值為1.04%。

1.3高效液相色譜(HPLC)法 Mitani K等[13]采用管內(nèi)固相微萃取結(jié)合HPLC技術(shù)(in-tube SPME-HPLC)，建立了自動(dòng)在線檢測(cè)大豆苷元、染料木素、大豆苷和染料木苷的方法。管內(nèi)固相微萃取(SPME)是一種從水溶性樣品中提取有機(jī)化合物的新技術(shù)，通過樣品溶液的重復(fù)抽吸或噴射循環(huán)，將待分析成分直接從樣品中置于開放的管狀毛細(xì)管中。采用Zorbax Eclipse XDB-C8柱，以甲醇-水為流動(dòng)相，梯度洗脫，檢測(cè)波長為255 nm，4種待測(cè)成分可在8 min內(nèi)完全分離。為優(yōu)化待測(cè)成分的提取工藝，對(duì)SPME參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化。待測(cè)成分質(zhì)量濃度在5～200 ng·mL-1范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)(r)大于0.999 9，檢測(cè)限為0.4～0.5 ng·mL-1，平均回收率高于97%。該方法可成功應(yīng)用于大豆食品的分析。

王劍波等[14]建立了測(cè)定槐角提取物中染料木素含量的HPLC法。樣品采用甲醇超聲提取，采用Luna C18柱，流動(dòng)相為甲醇-水(60∶40)，檢測(cè)波長為260 nm，結(jié)果顯示，染料木素質(zhì)量濃度在40.2～201.0 μg·mL-1范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系，平均回收率為98.93%，RSD值為0.81%。

蘇菊等[15]應(yīng)用HPLC法建立了測(cè)定保健食品中大豆苷、染料木苷、大豆苷元和染料木素含量的方法。采用Waters Spherisorb ODS-2柱，以甲醇-冰醋酸水溶液(40∶60)為流動(dòng)相，檢測(cè)波長為254 nm，結(jié)果顯示，4種成分均在1～50 μg·mL-1范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，平均回收率為85%～110%。

鄭玲等[16]建立了測(cè)定峨嵋葛根中染料木素的HPLC法。采用Kromasil C18柱，流動(dòng)相為甲醇-20 mL·L-1乙酸(47∶53)，檢測(cè)波長為254 nm，結(jié)果顯示，染料木素質(zhì)量濃度在4.07～40.72 μg·mL-1范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，平均回收率為102.3%，RSD值為0.76%。

Wang L J等[17]采用HPLC法測(cè)定了豆豉中的大豆異黃酮的含量，比較了加工過程中不同氯化鈉用量對(duì)豆豉中大豆異黃酮含量和組成的影響。樣品中加入體積分?jǐn)?shù)為80%的甲醇，以索氏提取法提取，采用Dikma Diamonsil C18柱，流動(dòng)相為1 mL·L-1乙酸-乙腈(含1 mL·L-1乙酸)，梯度洗脫，檢測(cè)波長為254 nm。結(jié)果表明，當(dāng)氯化鈉含量為100 g·L-1時(shí)，生大豆中有61%異黃酮損失，在發(fā)酵前和發(fā)酵后分別損失43%，18%。雖然在豆豉加工過程中預(yù)處理不會(huì)對(duì)總異黃酮含量產(chǎn)生影響，但異黃酮的組成會(huì)發(fā)生改變，苷元含量增加，而相應(yīng)的β-葡萄糖苷、丙二酰葡萄糖苷和乙酰葡萄糖苷含量降低，以苷元形式存在的異黃酮在發(fā)酵后超過總含量的90%。

吳向陽等[18]建立了能同時(shí)測(cè)定野葛的根、莖及葉中葛根素、大豆苷和大豆苷元的HPLC法。樣品用體積分?jǐn)?shù)為70%的乙醇超聲提取，采用Hypersil ODS-2色譜柱，流動(dòng)相為甲醇-水，梯度洗脫，檢測(cè)波長為250 nm。葛根素、大豆苷和大豆苷元質(zhì)量濃度分別在11.87～73.91，1.00～6.48，0.28～1.53 μg·mL-1范圍內(nèi)呈良好線性關(guān)系，最低檢出限分別為0.43，0.24，0.18 μg·mL-1，平均回收率分別為99.78%，102.61%，105.57%。該方法測(cè)得葛根中葛根素、大豆苷和大豆苷元含量分別為3.98%，0.36%，0.039%，高于藥典中提取方法的提取率。葛莖中葛根素、大豆苷和大豆苷元含量分別為0.004%，0.003 2%,0.000 7%，葛葉中葛根素、大豆苷和大豆苷元含量分別為0.001 6%，0.005%，0.001 2%。

李艷艷等[19]建立了能同時(shí)測(cè)定豆類中大豆苷、大豆苷元、染料木苷和染料木素4種大豆異黃酮成分含量的HPLC法。樣品用體積分?jǐn)?shù)為70%的乙醇超聲提取，采用Phenomenex C18柱，流動(dòng)相為乙腈-2 mL·L-1甲酸，梯度洗脫，檢測(cè)波長為260 nm。結(jié)果4種成分的線性范圍為0.167～33.300 μg，平均回收率在98.95%～100.02%范圍內(nèi)，RSD值在0.89%～1.58%范圍內(nèi)。

蔣明哲等[20]利用HPLC法測(cè)定大豆制品類保健食品中染料木素和大豆苷元的含量。樣品用體積分?jǐn)?shù)為80%的乙醇提取，采用ODS-C18柱，流動(dòng)相為甲醇-水(45∶55)，檢測(cè)波長為260 nm，染料木素和大豆苷元分別在8.0～100.0，1.0～80.0 μg·mL-1范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，平均回收率分別為98.5%,98.1%。

王曉娟等[21]建立了能同時(shí)測(cè)定大豆提取物中6種大豆異黃酮即大豆苷、黃豆黃苷、染料木苷、大豆苷元、黃豆黃素和染料木素含量HPLC法，采用Welchrom C18柱，以甲醇-水-乙腈(35∶65∶8)(磷酸調(diào)節(jié)pH值至2.6～3.0)為流動(dòng)相，檢測(cè)波長為254 nm。結(jié)果顯示，各成分的線性關(guān)系良好，平均回收率在100.45%～102.75%范圍內(nèi)，RSD值在1.10%～1.89%范圍內(nèi)。

李艷等[7]建立了能同時(shí)測(cè)定河北黃豆、豆腐、豆豉等7種豆類及豆制品中染料木苷、染料木素和大豆黃素含量的HPLC法。采用Platisil ODS柱，以甲醇-水(5.5∶4.5)為流動(dòng)相，檢測(cè)波長為260 nm。結(jié)果顯示，染料木苷、大豆黃素和染料木素分別在11.47～172，5.33～80，8.26～124 μg·mL-1范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，平均回收率分別為98.9%，98.7%，99.4%，RSD值分別為0.3%，1.8%，2.9%。

張嘯環(huán)等[22]考察了用不同輔料炮制淡豆豉對(duì)其大豆異黃酮含量的影響。淡豆豉樣品利用發(fā)酵法進(jìn)行制備，色譜柱為Hanbo C18柱，流動(dòng)相為甲醇∶水∶冰醋酸(40∶60∶0.5)，檢測(cè)波長為260 nm。結(jié)果顯示，大豆苷與染料木苷分別在0.03～0.17，5.22～31.32 μg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，平均加樣回收率分別為99.4%，99.3%，RSD值分別為0.81%，0.96%。以大豆苷為考察指標(biāo)，輔料為青蒿、桑葉、人參和淫羊藿時(shí)，3種樣品含量差異較小，與青蒿、桑葉比較，淫羊藿和人參為輔料發(fā)酵的淡豆豉含量略低；以染料木苷為考察指標(biāo)，與青蒿、桑葉比較，淫羊藿為輔料發(fā)酵的淡豆豉含量略有升高，人參為輔料發(fā)酵的淡豆豉含量明顯升高。

楊艷等[23]建立了能同時(shí)測(cè)定納豆中大豆苷、大豆黃苷、染料木苷、大豆素、大豆黃素和染料木素6種大豆異黃酮含量的HPLC法。通過考察不同的樣品前處理方法，用正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)確定最佳提取條件為：乙醇體積分?jǐn)?shù)為70%，提取時(shí)間為60 min，提取溫度為60 ℃,料液比為1∶50 g·mL-1。采用Agilent Eclipse plus-C18柱，以甲醇-5 mL·L-1乙酸為流動(dòng)相，梯度洗脫，檢測(cè)波長為254 nm。結(jié)果顯示，6種成分的線性關(guān)系良好，大豆苷、大豆黃苷、染料木苷、大豆素、大豆黃素和染料木素的檢出限分別為0.037，0.034，0.028，0.019，0.026，0.025 μg·mL-1，平均回收率在95.5%～102.8%范圍內(nèi)。

曹明艦等[24]建立了測(cè)定豆?jié){中的大豆苷、染料木苷和大豆苷元3種大豆異黃酮含量的HPLC法，對(duì)不同豆水比的豆?jié){前處理?xiàng)l件進(jìn)行優(yōu)化，將干豆?jié){粉用體積分?jǐn)?shù)為80%的甲醇在50 ℃條件下超聲提取30 min，采用C18柱，流動(dòng)相為甲醇-2 mL·L-1醋酸(1∶1)，檢測(cè)波長為260 nm。結(jié)果顯示，3種成分線性關(guān)系良好，大豆苷、染料木苷和大豆苷元的平均回收率分別在98.98%～104.44%，99.16%～104.42%，102.01%～106.65%范圍內(nèi)。

張鵬等[25]建立了能測(cè)定千斤拔藥材中染料木苷和染料木素含量的HPLC法。樣品用體積分?jǐn)?shù)為50%的乙醇加熱回流提取，色譜柱為Kromasil 100-5 C18柱，以乙腈-1 mL·L-1磷酸為流動(dòng)相，梯度洗脫，檢測(cè)波長為260 nm。結(jié)果顯示，染料木苷和染料木素質(zhì)量濃度分別在17.483～279.720,4.088～65.406 μg·mL-1范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好，平均回收率分別為104.27%，97.16%，RSD值分別為2.61%,5.54%。不同產(chǎn)地千斤拔藥材中染料木苷和染料木素的含量有明顯差異，所建立的方法為千斤拔藥材的質(zhì)量評(píng)價(jià)與開發(fā)利用提供了科學(xué)依據(jù)。

鄧青等[26]利用HPLC法對(duì)黑豆汁制何首烏、生何首烏、清蒸制何首烏中的大豆苷元進(jìn)行定量分析。采用Diamonsil C18柱，流動(dòng)相為甲醇-2 mL·L-1磷酸-乙腈(2∶6∶2)，測(cè)定波長為254 nm。結(jié)果顯示，大豆苷元在1.65～16.56 μg范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系，平均回收率為 98.72%，RSD值為1.54%。黑豆汁制何首烏大豆苷元含量為12.34±1.26 mg·g-1，在生何首烏、清蒸制何首烏中未檢測(cè)出大豆苷元。該方法可有效區(qū)分黑豆制何首烏與其他炮制品，從而對(duì)制何首烏進(jìn)行質(zhì)量評(píng)價(jià)與鑒別。

1.4超高效液相色譜(UPLC)法 王華林[27]建立了能快速測(cè)定大豆中染料木素、大豆苷元、大豆苷和染料木苷含量的UPLC法。樣品中加入體積分?jǐn)?shù)為70%的乙醇超聲提取，提取液經(jīng)濃縮后，用乙腈-2 mL·L-1乙酸溶解，用UPLC法分析。采用Acquity BEH C18色譜柱，流動(dòng)相為乙腈-2 mL·L-1乙酸，梯度洗脫。結(jié)果顯示，4種大豆異黃酮的線性范圍均在1.0～9.0 μg·mL-1范圍內(nèi)，平均回收率在97.8%～98.7%范圍內(nèi)，RSD值在1.3%～2.1%范圍內(nèi)。

柴川等[28]建立了能同時(shí)測(cè)定淡豆豉中大豆苷元、黃豆黃素和染料木素3種異黃酮苷元的UPLC法。采用Acquity BEH C18色譜柱，流動(dòng)相為乙腈-1 mL·L-1甲酸(24∶76)，樣品經(jīng)體積分?jǐn)?shù)為80%的甲醇提取后，用UPLC-UV分析，檢測(cè)波長為260 nm。結(jié)果顯示，3種成分均可在5 min內(nèi)完全分離并實(shí)現(xiàn)定量分析，大豆苷元、黃豆黃素和染料木素在相應(yīng)的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，平均回收率分別為 100.5%，99.06%,97.84%。

1.5液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(LC-MS)法 陳岑等[29]建立了以加速溶劑萃取-高效液相色譜-電噴霧-離子阱質(zhì)譜(ASE-HPLC-ESI-IT/MS)聯(lián)用技術(shù)分析淡豆豉中大豆異黃酮類化合物的方法。采用加速溶劑萃取儀，淡豆豉用體積分?jǐn)?shù)為70%的乙醇提取，色譜柱為XAqua C18柱，以乙腈-1 mL·L-1甲酸為流動(dòng)相，梯度洗脫。離子阱質(zhì)譜分別采用正、負(fù)離子模式下掃描，鑒定淡豆豉中的大豆異黃酮類成分，結(jié)果共鑒定出9種結(jié)合型糖苷類大豆異黃酮化合物。

Lee M J等[30]建立了能快速分離、鑒定和定量分析大豆和大豆制品中12種異黃酮成分的高效液相色譜-電噴霧-飛行時(shí)間-質(zhì)譜(LC-ESI-TOF-MS)法。根據(jù)各化合物的準(zhǔn)分子離子、鈉或鉀加合物離子、碎片離子、同位素離子的準(zhǔn)確質(zhì)量數(shù)據(jù)，對(duì)大豆異黃酮進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定。采用Symmetry C18柱，以甲醇-0.5 mL·L-1甲酸為流動(dòng)相，梯度洗脫，正離子模式掃描，結(jié)果大豆制品中的12種不同異黃酮可在12 min內(nèi)實(shí)現(xiàn)完全分離、鑒定和定量分析。結(jié)果顯示,測(cè)定成分在0.01～20.00 mg·mL-1范圍內(nèi)線性關(guān)系良好(r2> 0.992)，檢測(cè)限為10～40 ng·mL-1，定量限為3～132 ng·mL-1。所建立的方法無明顯的基質(zhì)效應(yīng)，能夠作為同時(shí)測(cè)定大豆異黃酮的有效分析方法。

馮薇等[31]采用MTT比色(MTT)法對(duì)淡豆豉和黑豆乙醇提取物進(jìn)行促大鼠顱骨成骨細(xì)胞增殖活性研究，并通過高效液相色譜-二極管陣列檢測(cè)-電噴霧-串聯(lián)質(zhì)譜(HPLC-DAD-ESI-MS/MS)技術(shù)分析兩者的化學(xué)成分。采用Agilent Eclipse Plus-C18柱，流動(dòng)相為乙腈-5 mL·L-1甲酸，梯度洗脫，檢測(cè)波長為261 nm，電離源為電噴霧離子源(ESI)，正離子方式檢測(cè)。結(jié)果顯示，淡豆豉和黑豆乙醇提取物對(duì)大鼠成骨細(xì)胞的促增殖率分別為 36.5%，28.2%，主要有效成分為異黃酮類化合物，經(jīng)LC-MS分析，鑒定出15個(gè)黃酮類成分。黑豆發(fā)酵成淡豆豉后的成分變化主要體現(xiàn)在由苷類成分脫糖轉(zhuǎn)化為苷元，含量顯著增加的大豆苷元和染料木素2種苷元主要是由丙二酰大豆苷和丙二酰染料木苷脫丙二?；推咸烟寝D(zhuǎn)化而來。

2 結(jié)語

目前中藥和食品中大豆異黃酮的分析測(cè)定方法包括薄層掃描法、紫外分光光度法、HPLC法、UPLC法和LC-MS法，主要以定量分析為主，其中HPLC法是大豆異黃酮定量分析中使用最為廣泛的技術(shù)，具有分離性能高、分析長度快和定量準(zhǔn)確的優(yōu)勢(shì)。薄層掃描法具有分離效能高、快速、簡便等特點(diǎn)，但其精密度、準(zhǔn)確度和重復(fù)性不如HPLC法。紫外分光光度法的優(yōu)點(diǎn)是儀器設(shè)備簡單、操作簡便、靈敏度高，但其準(zhǔn)確度相對(duì)不高。

HPLC的常用檢測(cè)器為二極管陣列檢測(cè)器(DAD)，色譜柱采用C18柱，流動(dòng)相多采用甲醇-水、甲醇或乙腈-乙酸溶液系統(tǒng)，也有少部分采用甲醇-水-乙腈、甲醇-磷酸溶液-乙腈三相系統(tǒng)，檢測(cè)波長通常選擇250～260 nm，樣品多采用體積分?jǐn)?shù)為70%或80%的甲醇或乙醇提取。與HPLC法相比，UPLC法具有分析時(shí)間短、實(shí)驗(yàn)效率高等特點(diǎn)，但在大豆異黃酮的定量分析中應(yīng)用相對(duì)較少。LC-MS法將色譜對(duì)復(fù)雜樣品的高分離能力與質(zhì)譜具有高選擇性、高靈敏度及能提供相對(duì)分子質(zhì)量與結(jié)構(gòu)信息的優(yōu)點(diǎn)結(jié)合起來，可在短時(shí)間內(nèi)對(duì)樣品中的大豆異黃酮進(jìn)行定性和定量分析。雖然大豆異黃酮的分析方法取得了一定進(jìn)展，但也存在一些問題?，F(xiàn)有研究大多數(shù)是對(duì)中藥和食品中的1～6種大豆異黃酮進(jìn)行定量，不能全面評(píng)價(jià)藥材質(zhì)量，需要加強(qiáng)同時(shí)對(duì)更多種指標(biāo)成分進(jìn)行定量分析的研究，實(shí)現(xiàn)對(duì)樣品中主要大豆異黃酮成分和微量成分的同時(shí)定量分析。對(duì)大豆異黃酮成分的分析方法進(jìn)一步深入研究，對(duì)中藥和食品的質(zhì)量控制具有重要意義。