精神分裂癥并發(fā)2型糖尿病與五羥色胺2C受體基因多態(tài)性的關(guān)聯(lián)性

郭向晴 趙 靜 易正輝 介 勇 呂欽諭 黃欣欣 朱 光徐阿紅 楊雋淵 李 君 汪曉暉

（1上海市虹口區(qū)精神衛(wèi)生中心 上海 200083；2上海市精神衛(wèi)生中心 上海 200030；3上海市徐匯區(qū)精神衛(wèi)生中心 上海 200232；4上海市青浦區(qū)精神衛(wèi)生中心 上海 201721）

精神分裂癥（schizophrenia，SCZ）是一種重度精神疾病，發(fā)病率約為1%，與普通人相比，其伴發(fā)軀體疾病的風(fēng)險(xiǎn)更高，預(yù)期壽命大大減少［1］。有證據(jù)表明，SCZ患者并發(fā)2型糖尿?。╰ype 2 diabetes mellitus，T 2DM）的遺傳風(fēng)險(xiǎn)增加，即使沒有使用抗精神病藥物，SCZ患者并發(fā)T 2DM的患病率也比普通人高2～3倍［2］。缺乏身體鍛煉、不良飲食習(xí)慣、遺傳因素和抗精神病藥物治療等是SCZ并發(fā)糖尿病的相關(guān)因素［3］。而且，SCZ患者出現(xiàn)糖尿病并發(fā)癥的風(fēng)險(xiǎn)高于單純糖尿病患者［4］，是增加SCZ死亡率的重要軀體疾病因素［5］。

五羥色胺 2C 受體（serotonin 2C receptor，5-HTR2C）屬于G蛋白偶聯(lián)受體家族，主要分布于中樞神經(jīng)系統(tǒng)［6］。5-HTR2C是SCZ治療的新靶點(diǎn)，越來越多的研究表明，5-HTR2C與第二代抗精神病藥物所致的體重增加有關(guān)［7］，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明敲除5-HT2C基因，小鼠表現(xiàn)出攝食增多和體質(zhì)量增加［8］；遺傳藥理學(xué)研究提示，5-HTR2C基因是抗精神病藥物導(dǎo)致體重增加的易感基因，且發(fā)現(xiàn)其單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphism，SNP）位點(diǎn)-759C/T 和-697G/C 與體重增加有關(guān)［9］。因此，5-HTR2C可能是抗精神病藥物導(dǎo)致的T 2DM的易感基因。目前國內(nèi)外關(guān)于5-HTR2C基因多態(tài)性的研究主要針對抗精神病藥物所致的糖尿病或代謝綜合征的遺傳易感性，未見5-HTR2C基因多態(tài)性與SCZ和糖尿病的關(guān)聯(lián)分析。本課題組前期曾開展相關(guān)研究，初步發(fā)現(xiàn)rs498177位點(diǎn)多態(tài)性與SCZ患者并發(fā)T 2DM相關(guān)［10-11］，本研究進(jìn)一步選取 5-HTR2C 基因有陽性報(bào)道的［12］SNP 位點(diǎn) rs2192371和rs5988072，通過病例對照研究探討5-HTR2C基因多態(tài)性與SCZ患者并發(fā)T 2DM的關(guān)聯(lián)性。選擇長期住院的服用氯氮平的慢性SCZ患者為研究對象，不同分組患者飲食習(xí)慣和康復(fù)鍛煉基本相仿，服用氯氮平可在一定程度上排除藥物的干擾，分析遺傳因素對SCZ和T 2DM的影響。

資料和方法

研究對象

共病組 即SCZ伴發(fā)T 2DM組，來自2014—2015年上海市精神衛(wèi)生中心的慢性住院患者。入組標(biāo)準(zhǔn)：（1）年齡為 18～65歲的中國漢族人群；（2）符合DSM-Ⅳ（美國精神障礙診斷與統(tǒng)計(jì)手冊第4版）中精神分裂癥的診斷標(biāo)準(zhǔn)；（3）總病程大于5年；氯氮平使用時(shí)間大于2年；（4）符合2013版美國糖尿病協(xié)會（American Diabetes Association，ADA）T 2DM的臨床診斷標(biāo)準(zhǔn)。

單純SCZ組 即SCZ不伴發(fā)T 2DM組，來自2014—2015年上海市精神衛(wèi)生中心、虹口區(qū)精神衛(wèi)生中心、徐匯區(qū)精神衛(wèi)生中心、青浦區(qū)精神衛(wèi)生中心的慢性住院患者。入組標(biāo)準(zhǔn)：（1）年齡為18～65歲的中國漢族人群；（2）符合DSM-Ⅳ精神分裂癥的診斷標(biāo)準(zhǔn)；（3）總病程大于5年；氯氮平使用時(shí)間大于2年；（4）排除符合2013版ADA中T 2DM的臨床診斷者。

單純T2DM組 即不伴發(fā)精神疾病的T 2DM組，來自2014—2015年上海市青浦區(qū)中心醫(yī)院內(nèi)分泌科的患者。入組標(biāo)準(zhǔn)：（1）年齡為18～65歲的中國漢族人群，男女不限；（2）符合2013版ADA中2型糖尿病的臨床診斷標(biāo)準(zhǔn)；（3）患者本人對該研究知情同意且簽署知情同意書。排除標(biāo)準(zhǔn)：符合DSM-Ⅳ診斷的有神經(jīng)系統(tǒng)疾病病史或其他重大軀體疾病病史者，以及精神疾病或精神疾病家族史者。

對照組 來自2014—2015年上海市青浦區(qū)中心醫(yī)院和2017—2018年虹口區(qū)中心醫(yī)院體檢的正常人群。入組標(biāo)準(zhǔn)：年齡為18～65歲的中國漢族人群；男女不限。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）符合DSM-Ⅳ精神疾病的臨床診斷標(biāo)準(zhǔn)者；（2）符合2013版ADA 2型糖尿病的臨床診斷標(biāo)準(zhǔn)者；（3）有神經(jīng)系統(tǒng)疾病病史及其他重大軀體疾病病史者。

本研究獲上海市精神衛(wèi)生中心倫理審查委員會批準(zhǔn)（SHMC-IRB）。入組對象或其監(jiān)護(hù)人均對本研究知情同意，且簽署書面知情同意書。

研究方法

一般人口學(xué)資料 收集共病組及單純SCZ組的性別、年齡、總病程、總住院時(shí)間及氯氮平服用的時(shí)間和劑量等信息。

SNP位點(diǎn)的選擇 根據(jù)Hap Map數(shù)據(jù)庫（release#20c.1，www.hapmap.org）中的CHB（中國北京漢族人群，Chinese Han origin in Beijing）數(shù)據(jù)進(jìn)行選擇，針對5-HTR2C基因及其上游的10 kb序列，通過連鎖不平衡系數(shù)＞0.8，微小等位基因頻率＞20%，并結(jié)合現(xiàn)有文獻(xiàn)的陽性結(jié)果進(jìn)行挑選，最后挑選出2個(gè)SNP位點(diǎn)，即rs2192371和rs5988072。

DNA提取 采集4組研究對象靜脈血各2 mL，2%乙二胺四乙酸（2%EDTA）抗凝，分離白細(xì)胞，用血液基因組DNA提取試劑盒提取DNA保存于-80℃的冰箱備用。

基因分型檢測 采用Taqman探針SNP基因分型技術(shù)對rs2192371和rs5988072位點(diǎn)進(jìn)行分型。實(shí)驗(yàn)所需SNP Genotyping Product試劑盒（包括探針和引物）和TaqMan SNP Genotyping MasterMix試劑盒（含有AmpliTaq Gold DNA聚合酶、dNTP和PCR緩沖液）均購自美國ABI公司。PCR反應(yīng)體系為 5 μL，包括模板 DNA 20 ng，40×SNP Assay（包括引物和FAM/VIC探針）0.05μL，TaqMan PCR Master mix 2.0μL。PCR反應(yīng)條件為：95℃10 min預(yù)變性；92 ℃ 15 s，60 ℃ 1.5 min，40個(gè)循環(huán)，25℃保存。PCR反應(yīng)及熒光信號讀取均在7900實(shí)時(shí)定量熒光PCR儀（美國ABI公司）上進(jìn)行。使用序列檢測系統(tǒng)（SDS 2.2）圖像分析軟件Allelic Discrimination程序進(jìn)行基因型分析。通過檢測不同等位基因所帶的報(bào)告熒光VIC和淬滅熒光FAM熒光強(qiáng)度，判斷各待測樣本為純合子或雜合子。如果只有VIC或FAM熒光增強(qiáng)的樣本，其SNP分型為純合子；如果VIC和FAM同時(shí)增強(qiáng)，則為雜合子。

統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采取SPSS 12.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，驗(yàn)證數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布及方差齊性后，計(jì)數(shù)資料應(yīng)用χ2檢驗(yàn)；年齡等計(jì)量資料采用t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。本研究運(yùn)用SHEsis（http：//analysis.bio-x.cn/myAnalysis.php）統(tǒng)計(jì)軟件對SNP位點(diǎn)（rs2192371、rs5988072）的等位基因和基因型及單體型數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，通過計(jì)算比值比（odds ratio，OR）與 95% 置信區(qū)間（95%CI）以了解等位基因和疾病的關(guān)聯(lián)強(qiáng)度（OR值＞1表示該因素是一個(gè)危險(xiǎn)因素；OR值＜1表示該因素是一個(gè)保護(hù)因素），并對各組間基因型頻率分布進(jìn)行Hardy-Weinberg平衡吻合度檢驗(yàn)。

使用Quanto軟件進(jìn)行樣本量統(tǒng)計(jì)效能檢驗(yàn)，兩個(gè)SNPs當(dāng)中rs2192371的最小等位基因頻率（MAF=0.358）最小，假設(shè)OR=1.5、加性模式、疾病一般人群患病率為1%，計(jì)算得出統(tǒng)計(jì)效能為0.99。

結(jié) 果

一般人口學(xué)資料及臨床特征的比較共病組257例，其中男性130例，女性127例；平均年齡（55.01±7.41）歲；平均病程（23.01±4.31）年。單純SCZ組288例，其中男性143例，女性145例；平均年齡（54.22±8.39）歲；平均病程（22.71±5.12）年。單純T 2DM組264例，其中男性133例，女性131例；平均年齡（52.53±11.59）歲。正常對照組625例，其中男性 318人，女性 307人；平均年齡（39.82±12.18）歲。共病組（t=-24.80，P＜0.001）、單純SCZ組（t=-21.33，P＜0.001）、單純 T 2DM 組（t=-14.42，P＜0.001）與對照組比較，年齡差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；共病組與單純SCZ組比較，年齡差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=4.18，P＜0.001）。4組研究對象之間性別差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。共病組和單純SCZ組中患者的總病程、總住院時(shí)間、氯氮平使用時(shí)間以及服用氯氮平劑量之間的差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（表1）。

表1 4組研究對象的一般人口學(xué)資料及臨床特征Tab 1 General demographic data and clinical characteristics of the four groups （n or x±s）

Hardy-Weinberg平衡吻合度檢驗(yàn)共病組、單純T 2DM組、單純SCZ組及對照組的基因型分布均符合Hardy-Weinberg平衡（P＞0.05）。

Rs2192371位點(diǎn)、rs5988072位點(diǎn)基因型、等位基因分布比較共病組與對照組比較，rs2192371（χ2=19.799，df=2，P＜0.001；χ2=7.437，df=1，P=0.006）和rs5988072（χ2=28.682，df=2，P＜0.001；χ2=24.127，df=1，P＜0.001）基因型頻率和等位基因頻率分布差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；單純T 2DM組與對照組比較，rs2192371基因型頻率分布差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=13.715，df=2，P=0.001），而等位基因頻率分布差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=0.774，df=1，P=0.379），rs5988072等位基因和基因型頻率分布差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=11.378，df=2，P=0.003；χ2=7.142，df=1，P=0.007）。單純SCZ組與對照組相比，rs2192371基因型頻率及等位基因頻率分布差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=1.881，df=2，P=0.39；χ2=0.313，df=1，P=0.575），rs5988072組間基因型頻率分布差異為邊緣性（χ2=6.026，df=2，P=0.049），而等位基因頻率分布雖然有差異（χ2=4.964，df=1，P=0.025），但經(jīng)過 Bonforrnie校正后無差異。在SCZ患者中，共病組與單純SCZ組 相 比rs2192371（χ2=11.279，df=2，P=0.003；χ2=8.061，df=1，P=0.004）和rs5988072（χ2=7.013，df=2，P=0.030；χ2=5.931，df=1，P=0.014）基因型頻率和等位基因頻率分布差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（表2）。

表2 4組研究對象間的單個(gè)位點(diǎn)多態(tài)性分析Tab 2 Analysis of single site polymorphism among the four groups ［n（%）］

連鎖不平衡分析及單體型遺傳關(guān)聯(lián)分析為了解5-HTR2C基因2個(gè)遺傳標(biāo)記位點(diǎn)間的連鎖不平衡情況，我們運(yùn)用Haploview軟件對2個(gè)SNP位點(diǎn)（rs2192371、rs5988072）進(jìn)行連鎖不平衡（linkage disequilibrium，LD）分析。用D’值或r2值來度量各位點(diǎn)間連鎖不平衡的程度。結(jié)果顯示：在共病組、單純SCZ組、單純T 2DM組有2個(gè)位點(diǎn)顯示強(qiáng)連鎖不平衡，考慮形成單體型。單體型分析顯示：共病組和單純SCZ組之間，由rs2192371-rs5988072組成的單體型AC（OR=1.351，χ2=5.841，P=0.015）和GT（OR=0.692，χ2=7.592，P=0.004）差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，單體型AT差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（OR=1.111，χ2=0.237，P=0.626）。共病組和單純T 2DM組比較，兩組間單體型 AC（OR=1.281，χ2=3.8，P=0.051）、GT（OR=0.808，χ2=2.497，P=0.114）和 AT（OR=0.854，χ2=0.568，P=0.451）差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（表3）。

表3 3組患者間的單體型分析Tab 3 Haplotype analysis among the three groups

討 論

本研究納入的共病組、單純SCZ組、單純T 2DM組以及對照組均符合Hardy-Weinberg平衡，因此可以進(jìn)行相關(guān)數(shù)據(jù)的比較。研究顯示單純SCZ組和共病組在年齡、病程、使用氯氮平劑量和時(shí)間以及住院時(shí)間等方面差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明匹配性良好?；蚍中徒Y(jié)果單位點(diǎn)分析顯示：共病組與對照組比較，rs2192371和rs5988072等位基因和基因型頻率分布差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；單純T 2DM與對照組比較，rs2192371基因型頻率分布差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，rs5988072等位基因和基因型頻率分布差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。單純SCZ與正常對照相比，rs2192371組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，rs5988072組間基因型頻率分布差異有邊緣性統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。而在SCZ患者中，共病組與單純SCZ組相比，rs2192371和rs5988072差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。單體型分析顯示：共病組與單純SCZ組比較，AC單體型能增加SCZ共病糖尿病的風(fēng)險(xiǎn)（OR=1.351）。而GT單體型能降低SCZ共病糖尿病的風(fēng)險(xiǎn)（OR=0.692）。結(jié)果表明：5-HTR2C基因rs2192371和rs5988072可能既是糖尿病的易感基因，又是糖尿病伴發(fā)SCZ的易感基因。rs2192371和rs5988072位點(diǎn)位于5-HTR2C基因的內(nèi)含子區(qū)域（來自http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/site/），研究表明內(nèi)含子是正常發(fā)育過程中基因表達(dá)程序的核心組成部分，也是對壓力和疾病的反應(yīng)［13］。作為內(nèi)含子的rs2192371和rs5988072可能通過調(diào)控mRNA的轉(zhuǎn)錄和蛋白質(zhì)的表達(dá)間接地影響基因的表達(dá)，從而對SCZ或T 2DM產(chǎn)生影響；這2個(gè)SNP位點(diǎn)存在強(qiáng)連鎖不平衡，通過對其形成的單倍體分析顯示：AC單體型能增加共病風(fēng)險(xiǎn)，GT單體型降低共病風(fēng)險(xiǎn)，進(jìn)一步驗(yàn)證了rs2192371和rs5988072可能是SCZ和糖尿病的易感基因，從而間接影響基因表達(dá)。我們前期的研究［10］也證明，5-HTR2C基因的內(nèi)含子rs498177位點(diǎn)可能也是SCZ和糖尿病的易感基因。由此可見，5-HTR2C基因的內(nèi)含子可能間接調(diào)控基因表達(dá)，從而對糖代謝產(chǎn)生影響。

最近一項(xiàng)國內(nèi)的 Meta分析［14］發(fā)現(xiàn)，5-HTR2C啟動(dòng)子區(qū)的功能多態(tài)性-759C/T（rs3813929）與抗精神病藥物所致體重增加存在顯著的遺傳相關(guān)性，T等位基因的患者發(fā)生抗精神病藥物所致體重增加的可能性較小。類似的研究［15］也發(fā)現(xiàn)，5-HTR2C基因-759位點(diǎn)T等位基因?qū)Φ诙咕癫∷幬锼碌呐跃穹至寻Y患者體重增加具有保護(hù)作用。Bai等［16］的研究也發(fā)現(xiàn)-759C/T多態(tài)性與精神分裂癥患者抗精神病藥物所致肥胖無關(guān)。精神分裂癥本身被認(rèn)為是糖尿病的致病因素，因?yàn)樵谑装l(fā)精神分裂癥且未服用抗精神病藥物的患者中，糖尿病患病率較高［17］。這些證據(jù)都從側(cè)面印證了SCZ患者存在糖尿病的易感基因。Hackinger等［18］對希臘人群中單純SCZ患者924例、單純T 2DM患者822例、共病組患者505例以及正常對照人群1 125名進(jìn)行全基因組關(guān)聯(lián)研究（GWAS），結(jié)果表明SCZ和T 2DM共病部分存在著共同的遺傳機(jī)制，與我們的研究結(jié)果基本一致。

本研究局限性在于：（1）樣本量有限。SCZ是多基因疾病，由于微效效應(yīng)（minor effect）的原因，其單一基因的分析需要進(jìn)行大樣本分析。（2）本研究是單一基因的分析，未檢測其他功能相關(guān)基因。最好同時(shí)檢測其他可能的功能相關(guān)基因，否則可能會由于所研究的單一基因的作用效應(yīng)微小而被忽略。（3）未設(shè)SCZ患者合并T 2DM但未用藥組。今后有待進(jìn)一步完善研究。

作者貢獻(xiàn)聲明郭向晴 論文構(gòu)思，數(shù)據(jù)采集，基因分型，論文撰寫和修訂。趙靜，易正輝，呂欽瑜 基因分型實(shí)驗(yàn)，論文構(gòu)思和修訂。趙靜，黃欣欣 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)和分析，論文修訂。介勇，朱光，徐阿紅，楊雋淵，李君，汪曉輝 病例收集及論文修訂。

利益沖突聲明所有作者均聲明不存在利益沖突。