小鼠出生后早期耳蝸柯蒂氏器巨噬細(xì)胞形態(tài)的變化

楊衛(wèi)平許陽(yáng)胡博華楊仕明

1中國(guó)人民解放軍總醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科醫(yī)學(xué)部（北京 100853）

2國(guó)家耳鼻咽喉疾病臨床醫(yī)學(xué)研究中心（北京 100853）

3聾病教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（北京 100853）

4聾病防治北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（北京 100853）

5解放軍總醫(yī)院呼吸科（北京 100853）

6美國(guó)紐約州立布法羅大學(xué)聽(tīng)力及聾病研究中心(NY 14214 USA）

耳蝸柯蒂氏器是聽(tīng)覺(jué)器官的聲電轉(zhuǎn)換器，負(fù)責(zé)聲音的感知，主要由毛細(xì)胞和支持細(xì)胞組成。毛細(xì)胞對(duì)各種損傷因素極為敏感，細(xì)胞損傷引起耳蝸的炎性和免疫反應(yīng)[1-3]。

免疫細(xì)胞是免疫系統(tǒng)的一個(gè)重要組成成分。在穩(wěn)態(tài)情況下，耳蝸的組織巨噬細(xì)胞分布于耳蝸不同區(qū)域，包括螺旋神經(jīng)節(jié)、螺旋韌帶、螺旋緣、骨螺旋板、血管紋等[4-6]。在耳蝸的感覺(jué)上皮，免疫細(xì)胞存在于耳蝸基底膜的鼓階面[7-9]。噪聲暴露后1天，循環(huán)的單核細(xì)胞浸入耳蝸基底膜鼓階面組織，3～7天浸入細(xì)胞數(shù)量達(dá)到高峰。這些細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)榫奘杉?xì)胞，參與各種炎性和免疫活動(dòng)[10]。

耳蝸柯蒂氏器表達(dá)多種免疫介質(zhì)，推論其具有較強(qiáng)的免疫功能[11]。然而在生理?xiàng)l件下，耳蝸基底膜中階面柯蒂氏器是否存在組織巨噬細(xì)胞仍不明確。O'Malley等發(fā)現(xiàn)，在耳蝸柯蒂氏器Hensen細(xì)胞下存在巨噬細(xì)胞免疫蛋白標(biāo)記物[12]。但其他研究者報(bào)道，耳蝸柯蒂氏器缺少免疫細(xì)胞[13,14]。耳蝸柯蒂氏器是聽(tīng)覺(jué)的主要器官，揭示免疫細(xì)胞對(duì)耳蝸柯蒂氏器的免疫作用具有重要的意義。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

本實(shí)驗(yàn)選用C57BL/6J小鼠，雌雄各半，出生后1～4 周齡 (出生后 6～7d，10d，14d，17d，21d，28d)每組動(dòng)物至少4～5只。種鼠購(gòu)買(mǎi)于美國(guó)緬因州巴港杰克遜實(shí)驗(yàn)室，小鼠繁殖、飼養(yǎng)于美國(guó)紐約州立布法羅大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，動(dòng)物的使用和實(shí)驗(yàn)程序得到布法羅大學(xué)動(dòng)物管理委員會(huì)的批準(zhǔn)。

1.2 CD45和F4/80免疫標(biāo)記耳蝸基底膜

CO2吸入麻醉后處死動(dòng)物，取出小鼠雙側(cè)耳蝸，于10%福爾馬林緩沖液4℃固定耳蝸過(guò)夜，在10 mM磷酸鹽緩沖液（PBS）中分離耳蝸基底膜。用0.5%Triton X-100和10%驢或山羊血清白蛋白在室溫下作用1 h后，用山羊CD45多克隆抗體（1:200，AF114，RD Inc.，USA）或大鼠抗F4/80單克隆抗體（CI:A3-1）（1:150，ab6640，Abcam Inc.，USA）孵育組織，4℃過(guò)夜。二抗孵育組織，CD45染色：Alexa-Fluor?488驢抗山羊IgG(1:200,10 mM PBS稀釋，Invitrogen），F(xiàn)4/80染色：Alexa-Fluor?488或594驢抗鼠IgG（1:100，10 mM PBS稀釋，Invitrogen)，10 mM PBS清洗組織。

1.3 細(xì)胞質(zhì)膜和細(xì)胞核染色

用3,3′-二十八碳雜菁高氯酸鹽（DiO，Invitrogen，Inc.）染色細(xì)胞質(zhì)膜。將DiO溶解在N，N-二甲基甲酰胺（DMF，F(xiàn)isher Scientific，D119-500）中配制DiO染色液（10 μM）。將固定后分離的耳蝸基底膜組織置于DiO溶液中，室溫孵育2 min，PBS沖洗。用碘化丙錠（PI）標(biāo)記細(xì)胞核[2]。

1.4 耳蝸基底膜組織觀察與圖像采集

按照熒光顯微鏡觀察和計(jì)算機(jī)圖像分析方法[15]，對(duì)樣本進(jìn)行拍照，處理圖像，測(cè)量耳蝸基底膜柯蒂氏器巨噬細(xì)胞直徑。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

SigmaStat Version3.5軟件(美國(guó))用于分析統(tǒng)計(jì)的數(shù)據(jù)。比較不同周齡小鼠耳蝸基底膜柯蒂氏器巨噬細(xì)胞直徑采用t檢驗(yàn)分析，各組數(shù)據(jù)以表示，P＜0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 耳蝸基底膜的中階面存在CD45陽(yáng)性反應(yīng)細(xì)胞

為確定耳蝸基底膜中階面是否存在CD45陽(yáng)性反應(yīng)細(xì)胞，及免疫細(xì)胞形態(tài)、分布特點(diǎn)，我們首先對(duì)4周齡小鼠耳蝸感覺(jué)上皮組織進(jìn)行了CD45染色。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在耳蝸基底膜的中階面存在CD45陽(yáng)性標(biāo)記細(xì)胞。這些細(xì)胞在頂回的頂部呈不規(guī)則形，細(xì)胞體積較大，約50～70 μm(圖1A，左1-2)，細(xì)胞質(zhì)伸出突起多呈鈍圓形。其它部位多數(shù)細(xì)胞細(xì)長(zhǎng)，類似E或F形（圖1A，左3-4)，其長(zhǎng)軸與耳蝸長(zhǎng)軸平行，開(kāi)口于耳蝸外側(cè)壁或蝸軸，細(xì)胞體積自耳蝸基底膜的頂回到底回逐漸減小。細(xì)胞沿耳蝸基底膜長(zhǎng)軸排列為一排，間隔約為30～40μm，細(xì)胞間隔自耳蝸基底膜的頂回到底回逐漸增大（圖1B)。

為對(duì)比耳蝸基底膜中階面與鼓階面組織巨噬細(xì)胞形態(tài)和分布的區(qū)別，我們同時(shí)觀察了耳蝸基底膜鼓階面的CD45陽(yáng)性細(xì)胞形態(tài)。這些細(xì)胞分散排列在全耳蝸基底膜，耳蝸的頂回呈樹(shù)枝狀，中回呈樹(shù)干狀，底回呈變形蟲(chóng)狀，細(xì)胞形態(tài)與分布與我們之前的報(bào)道相同[7]。

圖1 CD45陽(yáng)性標(biāo)記的4周齡小鼠耳蝸基底膜中階面細(xì)胞的形態(tài)和分布。A:典型細(xì)胞形態(tài)。B:細(xì)胞在耳蝸基底膜的分布。箭頭示CD45陽(yáng)性標(biāo)記細(xì)胞。標(biāo)尺：40μm。Fig.1 The morphology and distribution of CD45 positive cells in the scala media side of the basilar membrane of 4-week-old mice.A:Typical images of cell morphology.B:Distribution of cells in the basilar membrane of the cochlea.Arrows indicate the CD45 positive cells.Bars:40μm.

2.2 耳蝸基底膜中階面CD45陽(yáng)性細(xì)胞為巨噬細(xì)胞

為鑒別耳蝸基底膜中階面CD45陽(yáng)性細(xì)胞，揭示CD45陽(yáng)性細(xì)胞是否表達(dá)巨噬細(xì)胞專有蛋白，我們對(duì)部分耳蝸基底膜組織進(jìn)行了CD45和F4/80雙重染色。發(fā)現(xiàn)CD45陽(yáng)性細(xì)胞存在F4/80免疫反應(yīng)（圖2A-C)，表明CD45陽(yáng)性細(xì)胞為巨噬細(xì)胞表型；為證明CD45陽(yáng)性細(xì)胞是否存在質(zhì)膜，我們采用CD45和DiO(一種親脂的示蹤劑）雙重染色部分耳蝸基底膜。發(fā)現(xiàn)DiO免疫熒光反應(yīng)定位于CD45陽(yáng)性細(xì)胞（圖2D-F)，表明CD45陽(yáng)性細(xì)胞具有膜結(jié)構(gòu)；為鑒定CD45陽(yáng)性細(xì)胞是否存在細(xì)胞核，我們對(duì)部分耳蝸基底膜進(jìn)行了CD45和PI雙重染色。發(fā)現(xiàn)CD45陽(yáng)性細(xì)胞PI染色陰性（圖2G-I)，證明這些細(xì)胞缺少細(xì)胞核。以上結(jié)果表明，4周齡小鼠耳蝸基底膜中階面存在無(wú)核的巨噬細(xì)胞。

圖2 耳蝸基底膜中階面CD45陽(yáng)性細(xì)胞的鑒別。A：CD45染色，B：F4/80染色，C：CD45與F4/80雙重染色；D：CD45染色，E：DIO染色，F(xiàn)：CD45與DIO雙重染色；G：CD45染色，H：PI染色，I：CD45與PI雙重染色。箭頭示耳蝸基底膜中階面巨噬細(xì)胞。標(biāo)尺:10 μm。Fig.2 Identification of CD45 positive structures in the scala media side of the basilar membrane of cochlea.A:CD45 immunolabeling.B:F4/80 immunoreactivity.C:Merged image of CD45 and F4/80 immunolabeling.D:CD45 immunolabeling.E:DiO immunoreactivity.F:Merged image of CD45 and DiO immunolabeling.G:CD45 immunolabeling.H:PI staining.I:Merged image of CD45 and PI staining.Arrows indicate the CD45 positive structures.Bars:10μm.

2.3 柯蒂氏器巨噬細(xì)胞定位于耳蝸基底膜的Hensen與Claudius細(xì)胞之間

耳蝸柯蒂氏器細(xì)胞具有獨(dú)特的形狀和位置，為揭示CD45陽(yáng)性細(xì)胞與耳蝸柯蒂氏器細(xì)胞的空間分布關(guān)系，我們用CD45和DiO雙重標(biāo)記耳蝸基底膜細(xì)胞。熒光顯微鏡下觀察到Hensen細(xì)胞呈大而無(wú)規(guī)律形，Claudius細(xì)胞呈多邊形，CD45陽(yáng)性細(xì)胞定位于Hensen細(xì)胞與Claudius細(xì)胞連接處（圖3)。

圖3 CD45和DiO雙重染色定位耳蝸基底膜中階面巨噬細(xì)胞。箭頭示巨噬細(xì)胞。標(biāo)尺:10 μm。Fig.3 Double staining with CD45 and DiO for location of macrophages in the scala media side of cochlear basilar membrane.Arrow indicates macrophage.Bar:10 μm.

2.4 耳蝸基底膜中階面巨噬細(xì)胞與鼓階面巨噬細(xì)胞定位無(wú)相關(guān)性

為揭示耳蝸基底膜中階面巨噬細(xì)胞與鼓階面巨噬細(xì)胞的定位關(guān)系，我們對(duì)耳蝸基底膜CD45染色發(fā)現(xiàn)，定位于耳蝸基底膜中階面無(wú)核的CD45陽(yáng)性巨噬細(xì)胞（圖4箭頭所示)與定位于耳蝸基底膜鼓階面CD45陽(yáng)性巨噬細(xì)胞（圖4三角所示)的分布不相關(guān)。

圖4 CD45染色的耳蝸基底膜中階面和鼓階面巨噬細(xì)胞的分布。箭頭示中階面柯蒂氏器巨噬細(xì)胞，三角示鼓階面巨噬細(xì)胞。標(biāo)尺:40 μm。Fig.4 The distribution of macrophages in the scala media side and scala tympani side of the basilar membrane of cochlea stained by CD45.Arrows indicate macrophages in the scala media side,and triangles indicate macrophages in the scala tympani side.Bar:40 μm.

2.5 耳蝸柯蒂氏器的無(wú)核巨噬細(xì)胞自出生后有核巨噬細(xì)胞轉(zhuǎn)變而來(lái)

為揭示耳蝸基底膜中階面柯蒂氏器無(wú)核巨噬細(xì)胞的來(lái)源，我們檢查了出生后1～2周的小鼠耳蝸。在這個(gè)發(fā)育階段，CD45染色的耳蝸基底膜頂部、中部和底部都能夠檢測(cè)到巨噬細(xì)胞。CD45與PI雙重染色發(fā)現(xiàn)，出生后1～2周的小鼠柯蒂氏器巨噬細(xì)胞存在細(xì)胞核（圖5A)。

為揭示有核巨噬細(xì)胞在耳蝸的存在時(shí)間，我們檢查了出生后2～3周小鼠耳蝸。發(fā)現(xiàn)出生后第17天小鼠耳蝸柯蒂氏器巨噬細(xì)胞部分存在細(xì)胞核，而另一部分細(xì)胞的細(xì)胞核消失（圖5B)。表明小鼠耳蝸柯蒂氏器無(wú)核巨噬細(xì)胞源自出生后有核巨噬細(xì)胞,出生2周后開(kāi)始出現(xiàn)細(xì)胞核消失。

圖5 CD45與PI雙重標(biāo)記的小鼠出生后早期耳蝸基底膜柯蒂氏器巨噬細(xì)胞。A：出生后10 d柯蒂氏器巨噬細(xì)胞，B:出生后17 d柯蒂氏器巨噬細(xì)胞，單箭頭示耳蝸柯蒂氏器無(wú)核的巨噬細(xì)胞，雙箭頭示耳蝸柯蒂氏器有核的巨噬細(xì)胞。標(biāo)尺:20 μm。Fig.5 Macrophages in the organ of Corti of cochleae during early postnatal mice staining with CD45 and PI.A:Macrophages at postnatal day 10.B:Macrophages at postnatal day 17.Arrow indicates an anucleated macrophage.Double arrows indicate ucleated macrophages.Bar:20 μm.

2.6 小鼠出生后早期耳蝸柯蒂氏器巨噬細(xì)胞形態(tài)和分布的變化

顯微鏡下觀察CD45染色的耳蝸基底膜中階面柯蒂氏器巨噬細(xì)胞發(fā)現(xiàn)，出生后6 d小鼠巨噬細(xì)胞輪廓清晰，1～2周齡巨噬細(xì)胞形態(tài)多樣，細(xì)胞體積較大，多個(gè)指狀或錐形突起，細(xì)胞核呈卵圓形，耳蝸基底膜頂回的柯蒂氏器巨噬細(xì)胞稍大于中回和底回。細(xì)胞自耳蝸基底膜頂回到底回分布均一（圖6A-F）。

3周齡小鼠耳蝸基底膜頂回柯蒂氏器巨噬細(xì)胞呈不規(guī)則形，其體積、形態(tài)與1～2周齡小鼠中回細(xì)胞相似。中回和底回柯蒂氏器巨噬細(xì)胞多數(shù)呈細(xì)長(zhǎng)形，偽足較1～2周齡小鼠細(xì)胞數(shù)量少，突起細(xì)而短（圖6G-I）；4周齡小鼠耳蝸柯蒂氏器巨噬細(xì)胞體積存在差異，耳蝸基底膜頂回頂部細(xì)胞比較大，突起短。中回細(xì)胞細(xì)長(zhǎng)，底回細(xì)胞變細(xì)、變短,或者消失（圖6J-L）。

不同周齡小鼠耳蝸基底膜柯蒂氏器巨噬細(xì)胞長(zhǎng)軸平均直徑比較發(fā)現(xiàn)，3～4周齡小鼠柯蒂氏器巨噬細(xì)胞自耳蝸基底膜的頂回、中回到底回逐漸變小(58.7±10.7 μm,48.2±8.9 μm,42.6±5.6 μm)，其細(xì)胞直徑均小于出生后1～2周小鼠(69.8±7.3 μm,59.2±13.2 μm,57.8±11.2 μm)，兩者存在明顯差異P＜0.05（P=0.006,P=0.043,P=0.001，t檢驗(yàn)，圖6M）。

圖6 出生后早期小鼠耳蝸柯蒂氏器巨噬細(xì)胞形態(tài)變化。A-L：CD45染色的柯蒂氏器巨噬細(xì)胞，箭頭示典型的細(xì)胞形態(tài)，標(biāo)尺:50μm。M：出生后不同周齡小鼠耳蝸基底膜柯蒂氏器巨噬細(xì)胞長(zhǎng)軸直徑比較。*:P＜0.05,**:P＜0.01,***:P＜0.001。每組8個(gè)耳蝸。Fig.6 Changes of morphology of macrophages in the organ of Corti of cochleae during early postnatal mice.A-L:Macrophages staining with CD45.Arrows indicate typical images of macrophages.Bar:50μm.M:Comparison of the average length of the long-axis of macrophages in the organ of Corti in different weeks of early postnatal mice.*:P＜0.05,**:P＜0.01,***:P＜0.001.n=8 cochleae for each group.

3 討論

本研究主要發(fā)現(xiàn)：1）出生后早期小鼠耳蝸基底膜的中階面柯蒂氏器存在形態(tài)多樣的組織巨噬細(xì)胞。2）當(dāng)柯蒂氏器發(fā)育成熟時(shí)，這些巨噬細(xì)胞出現(xiàn)發(fā)育性死亡，遺留下無(wú)核的巨噬細(xì)胞殘?bào)w。3）小鼠耳蝸基底膜柯蒂氏器巨噬細(xì)胞的形態(tài)和分布特點(diǎn)與耳蝸基底膜鼓階面巨噬細(xì)胞不同。

本實(shí)驗(yàn)觀察到出生后早期小鼠耳蝸基底膜柯蒂氏器下Hensen與Claudius細(xì)胞之間存在巨噬細(xì)胞，這些細(xì)胞出生時(shí)已經(jīng)發(fā)育成熟，但其壽命很短，伴隨感覺(jué)上皮的成熟出現(xiàn)發(fā)育性退化。O'Malley等曾采用免疫組織化學(xué)方法在52～88歲無(wú)增齡相關(guān)耳蝸病變?nèi)说幕鹈弈z包埋顳骨組織切片中觀察到，耳蝸柯蒂氏器Hensen細(xì)胞下存在巨噬細(xì)胞標(biāo)記物[12]，我們的發(fā)現(xiàn)與O'Malley關(guān)于柯蒂氏器巨噬細(xì)胞定位相同。不同的是我們觀察到小鼠出生后17天開(kāi)始出現(xiàn)柯蒂氏器巨噬細(xì)胞核消失，而O'Malley等發(fā)現(xiàn)，老年人耳蝸存在柯蒂氏器巨噬細(xì)胞。該研究結(jié)果不一致的解釋：1）被收集的個(gè)體組織存在差別，我們的實(shí)驗(yàn)對(duì)象為出生后早期小鼠耳蝸，O'Malley等觀察的是52～88歲人類顳骨。2）研究方法不同，我們采用的是巨噬細(xì)胞蛋白標(biāo)記物和細(xì)胞核DNA染料雙重染色耳蝸基底膜，O'Malley等僅采用巨噬細(xì)胞蛋白標(biāo)記物染色耳蝸基底膜，不能觀察到細(xì)胞核的變化。

我們前期報(bào)道了小鼠耳蝸基底膜鼓階面巨噬細(xì)胞的形態(tài)、分布特點(diǎn)[7]，本研究觀察了小鼠耳蝸基底膜中階面巨噬細(xì)胞的形態(tài)、分布特點(diǎn)，及出生后早期形態(tài)學(xué)變化。發(fā)現(xiàn)耳蝸基底膜柯蒂氏器巨噬細(xì)胞與耳蝸基底膜鼓階面巨噬細(xì)胞存在以下異同點(diǎn)：1）兩者都屬于耳蝸基底膜組織巨噬細(xì)胞，中階面柯蒂氏器巨噬細(xì)胞存在于毛細(xì)胞下的支持細(xì)胞間隙，鼓階面巨噬細(xì)胞存在于基底膜鼓階面的表層[7]。2）柯蒂氏器巨噬細(xì)胞源自耳蝸基底膜胚胎衍生的細(xì)胞，出生后一周細(xì)胞輪廓清晰；基底膜鼓階面巨噬細(xì)胞源自耳蝸基底膜胚胎衍生的細(xì)胞及耳蝸血管內(nèi)單核細(xì)胞的滲入[7]。3）柯蒂氏器巨噬細(xì)胞伴隨耳蝸發(fā)育成熟而死亡，基底膜鼓階面巨噬細(xì)胞終生存在[15]。4）柯蒂氏器巨噬細(xì)胞出生后1～2周，體積大，突起長(zhǎng)，形狀多樣性。生后3～4周細(xì)胞殘?bào)w除耳蝸基底膜頂回頂部細(xì)胞呈不規(guī)則形狀外，其余部分形似E和F形；耳蝸基底膜鼓階面的巨噬細(xì)胞出生時(shí)呈現(xiàn)單核細(xì)胞形狀，這些細(xì)胞在生后發(fā)育中歷經(jīng)了專一位點(diǎn)分化，并將其形態(tài)保持至成年。頂回巨噬細(xì)胞呈樹(shù)枝狀，中回細(xì)胞呈短突起的樹(shù)干狀，底回細(xì)胞進(jìn)一步分化為變形蟲(chóng)形[7]。5）柯蒂氏器巨噬細(xì)胞與鼓階面巨噬細(xì)胞定位不相關(guān)?？碌偈掀骶奘杉?xì)胞自耳蝸基底膜頂回到底回單行排列，基底膜鼓階面巨噬細(xì)胞分散排列。6）噪聲暴露后滲入的單核細(xì)胞僅存在于基底膜鼓階面[7]。鑒于以上比較分析，推論耳蝸基底膜中階面柯蒂氏器巨噬細(xì)胞與鼓階面巨噬細(xì)胞可能存在不同的生物學(xué)功能。

耳蝸組織巨噬細(xì)胞除產(chǎn)生炎性因子[16]，抗原的呈遞外[10]，吞噬作用是巨噬細(xì)胞的重要功能之一，耳蝸組織巨噬細(xì)胞吞噬和清除衰老、損傷細(xì)胞碎片[17]。小鼠出生時(shí)耳蝸膜迷路的大部分結(jié)構(gòu)已經(jīng)形成，但發(fā)育并未成熟，其發(fā)育過(guò)程延續(xù)至出生后2周[18]。在這一階段，感覺(jué)上皮歷經(jīng)幾個(gè)重要的結(jié)構(gòu)修飾，包括除去感覺(jué)上皮多余的細(xì)胞，螺旋血管的重建，柯蒂淋巴腔的形成，及感覺(jué)細(xì)胞與神經(jīng)元連接的細(xì)微變化，這些結(jié)構(gòu)的重塑需要從耳蝸清除多余的細(xì)胞。耳蝸感覺(jué)上皮的成熟過(guò)程自耳蝸基底膜底回到頂回發(fā)展，與耳蝸功能的成熟過(guò)程相一致。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，出生后6天柯蒂氏器巨噬細(xì)胞分化形態(tài)成熟，可能存在功能。此外，柯蒂氏器巨噬細(xì)胞臨近的組織歷經(jīng)了發(fā)育結(jié)構(gòu)的變化，而柯蒂氏器巨噬細(xì)胞保持自身活力直到感覺(jué)上皮發(fā)育結(jié)束，柯蒂氏器發(fā)育成熟后，這些巨噬細(xì)胞出現(xiàn)發(fā)育性死亡。值得注意的是柯蒂氏器巨噬細(xì)胞發(fā)育性退變過(guò)程從底回到頂回，其與耳蝸基底膜感覺(jué)上皮的成熟從底回到頂回的發(fā)展過(guò)程相一致。這些發(fā)現(xiàn)提示，柯蒂氏器巨噬細(xì)胞可能參與了耳蝸基底膜感覺(jué)上皮的發(fā)育過(guò)程。