俞咪娜,于俊杰,曹慧娟,潘夏艷,宋天巧,劉永鋒
摘要:為明確Zn2(Ⅱ)Cys6型轉錄因子UvZC1在稻曲病病菌中的功能,利用CRISPR-Cas9結合同源片段雙交換的方法,誘導野生型菌株Jt209發(fā)生UvZC1基因缺失突變。結果顯示,與Jt209相比,UvZC1基因缺失突變體的生長速率和分生孢子量均顯著下降,且突變體中部分與稻曲病病菌其他產分生孢子相關基因表達量發(fā)生變化;此外,該基因的缺失導致突變體對十二烷基硫酸鈉(SDS)更敏感,而對氧化脅迫的耐受性增強;在稻曲病病菌接種水稻后24 h、48 h的侵染早期,UvZC1基因的表達量明顯上升,但基因缺失突變體接種水稻后形成的稻曲球數量與野生型之間沒有差異。綜上所述,UvZC1基因參與稻曲病病菌營養(yǎng)生長、分生孢子產生和侵染水稻過程,還與稻曲病病菌細胞壁的完整性和響應氧化脅迫相關。
關鍵詞:稻曲病病菌;Zn2(Ⅱ)Cys6轉錄因子UvZC1;基因敲除;基因功能;致病性
中圖分類號:S511.01文獻標識碼:A文章編號:1000-4440(2021)06-1400-09
Clone and functional research of Zn2(Ⅱ) Cys6 transcription factor UvZC1 gene in Ustilaginoidea virens
YU Mi-na,YU Jun-jie,CAO Hui-juan,PAN Xia-yan,SONG Tian-qiao,LIU Yong-feng
(Institute of Plant Protection, Jiangsu Academy of Agricultural Sciences, Nanjing 210014, China)
Abstract:In order to clarify the function of Zn2(Ⅱ) Cys6 transcription factor UvZC1 in Ustilaginoidea virens, gene deletion mutation was carried out by the CRISPR-Cas9-based homologous recombination system. Compared with the wild-type strain Jt209, the growth rate and conidia production of △UvZC1 mutants were significantly decreased, and the expression levels of genes related to the sporulation of U. virens were also changed. In addition, the UvZC1 deletion mutants showed more sensitivity to sodium dodecyl sulfate (SDS), and the tolerance to oxidative stress was enhanced. At the early stage of infection (24 h and 48 h after inoculation), the expression of UvZC1 gene increased significantly. However, no significant difference in the number of rice false smut balls between the wild type and the △UvZC1 mutants was found. Overall, UvZC1 gene has roles in regulating hyphal growth, conidiation, cell wall integrity and oxidative stress response in U. virens. Furthermore, UvZC1 gene is also involved in the infection process of U. virens.
Key words:Ustilaginoidea virens;Zn2(Ⅱ)Cys6 transcription factor UvZC1;gene knocking-out;gene function;pathogenicity
稻曲?。≧ice false smut)是由稻曲病病菌[Ustilaginoidea virens (Cooke) Tak.]侵染引起的一種世界性水稻穗部病害,在世界各水稻主產區(qū)均有發(fā)生。近年來,稻曲病在中國逐漸成為水稻的主要病害之一,年平均發(fā)病面積達3.06×106hm2,造成水稻年減產1.586×108 kg,尤其在長江中下游地區(qū),稻曲病重發(fā)的水稻種植面積占水稻總種植面積的19%~40%[1]。稻曲病的發(fā)生會影響谷粒的營養(yǎng)運輸和正常發(fā)育,造成空秕率升高、千粒質量下降[2-3];而稻曲球中含有的稻曲菌素更能抑制微管蛋白的組裝,并干擾細胞骨架形成,引起人畜病變[4-5]。深入研究稻曲病病菌致病相關基因功能,對解析稻曲病病菌致病機制、選擇防治策略具有重要意義。
轉錄因子是一類調控基因轉錄起始的重要蛋白質,稻曲病病菌轉錄因子UvHOX2的基因敲除突變體菌株不產生厚垣孢子,且分生孢子產量下降,致病力減弱[6]。轉錄因子UvCmo1、UvHog1參與稻曲病病菌響應非生物脅迫、致病等多個重要生物學過程[7-8]。Zn2(Ⅱ)Cys6型轉錄因子是子囊菌中最大的一類轉錄因子,其結構中包含1個CX2CX6CX5-12-CX2CX6-8C基序,可以與2個鋅離子結合,該類蛋白質只存在于真菌界[9]。Zhang等[10]用稻曲病病菌接種水稻孕穗期的穗部,在轉錄組水平分析接種的水稻穗部發(fā)現,編碼Zn2(Ⅱ)Cys6型轉錄因子1(Ustilaginoidea virens Zn2Cys6 transcription factors 1, KDB18664)的UvZC基因在侵染早期的表達量顯著升高,據此推測,該基因與稻曲病病菌侵染相關。目前UvZC1基因在稻曲病病菌中的生物學功能尚不明確,本研究通過分析該基因敲除突變體菌株的表型,對稻曲病病菌中UvZC1基因的功能進行解析,以期為稻曲病病菌致病機制研究提供理論基礎。
1材料與方法
1.1供試材料
Jt209菌株分離自2018年從江蘇金壇田間采集的稻曲病病株標樣,經單孢純化和測序鑒定為稻曲病病菌后保存[11]。供試水稻品種為稻曲病感病品種兩優(yōu)培九。在田間用Jt209菌株接種兩優(yōu)培九后表現出強致病力。敲除載體pCas9-gRNA由南京農業(yè)大學張海峰教授惠贈,回補載體pKO1-Neo由筆者所在實驗室保存。稻曲病病菌用馬鈴薯蔗糖瓊脂(PSA)培養(yǎng)基活化和培養(yǎng),YT培養(yǎng)基用于稻曲病病菌生物學特性的觀察分析[8,12]。稻曲病病菌的培養(yǎng)條件為28 ℃、避光。
1.2稻曲病病菌UvZC1基因的克隆與分析
將新活化的Jt209菌株在YT培養(yǎng)液中搖動培養(yǎng)5 d,過濾并收集菌絲。用十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)法提取Jt209總基因組;用RNA提取試劑盒(Bioteke,PR1202)提取Jt209總RNA,用反轉錄試劑盒(TaKaRa,RR047)將RNA反轉錄成cDNA。參考稻曲病病菌Uv8b菌株的全基因組序列,設計UvZC1基因的全長擴增引物UvZC1 F、UvZC1 R,以Jt209基因組和cDNA為模板,通過PCR擴增分別獲得UvZC1基因及cDNA全長序列并測序。將序列在美國國家生物技術信息中心(NCBI)網站上進行BLAST同源比對,用CDART進行基因編碼蛋白的結構域分析,用MEGA 7構建系統(tǒng)進化樹。
1.3稻曲病病菌UvZC1基因敲除和回補突變體的獲得
通過1F/1R引物對、2F/2R引物對對Jt209基因組進行擴增,分別獲得964 bp UvZC1基因上游片段和998 bp下游片段;用引物對hyg1.4F/hyg1.4R從質粒pSK044中擴增獲得潮霉素抗性基因(HPH)片段,通過多片段重組酶(C113-02)連接獲得基因敲除載體pMD19T-HPH-UvZC1。CRISPR載體構建和稻曲病病菌原生質體轉化參考Liang等[13]的方法。經潮霉素抗性初篩獲得轉化子,通過RT-UvZC1 F/RT-UvZC1 R、hyg1.4F/yzR和hyg1.4R/yzF特異性引物對擴增轉化子基因組進行再次擴增,并對擴增片段進行測序和序列比對。利用地高辛標記的Southern雜交方法對UvZC1基因敲除突變體菌株的基因組DNA進行分析,Jt209和突變體基因組DNA的提取參照方法1.2進行;探針的制備采用hyg1.4F/hyg1.4R引物對經PCR擴增獲得的HPH基因片段;利用Xho I單酶切基因組DNA,按照Roche DIG-High Prime DNA Labeling and Detection Starter Kit I試劑盒的說明書進行Southern雜交,明確UvZC1基因敲除突變體菌株中HPH基因的插入拷貝數。
為了獲得基因回補突變體,用引物對CF/CR擴增Jt209基因組,獲得包含基因上游1.9 kb的片段、基因全長和基因下游0.5 kb的片段,連接獲得回補載體pKO1-Neo-UvZC1,測序正確后,用農桿菌介導的稻曲病病菌轉化方法將目的基因轉化至UvZC1基因敲除突變體菌株上[11],用遺傳霉素G418篩選轉化子,再用RT-UvZC1 F/RT-UvZC1 R引物對進行轉化子中UvZC1基因表達量的測定,篩選回補菌株。所用引物序列見表1。
1.4稻曲病病菌生物學表型的測定
將稻曲病病菌菌株在PSA培養(yǎng)基上培養(yǎng)15 d后,在菌落生長邊緣處取菌碟(直徑為5 mm),用于生物學表型的測定。每個菌設3個重復,每個試驗重復3次。
1.4.1菌絲生長速率的測定將菌碟接種至YTA培養(yǎng)基上,于28 ℃避光培養(yǎng)12 d后觀察菌落形態(tài),測量菌落直徑。
1.4.2菌絲對非生物脅迫的響應試驗分別將菌碟接種至含0.3 mol/L NaCl、0.3 mol/L KCl、0.8 mol/L D-山梨醇(Sorbitol)、70 μg/ml 剛果紅(Congo Red)、0.005% 十二烷基硫酸鈉(SDS)和3 mmol/L H2O2的YTA培養(yǎng)基上,28 ℃避光培養(yǎng)12 d后測量菌落直徑。
1.4.3分生孢子產生量的測定取菌碟后將其接至含有50 ml YTS培養(yǎng)液的100 ml三角瓶中,每瓶接種5粒菌碟,于28 ℃、160 r/min搖動培養(yǎng)7 d,用血球計數板統(tǒng)計分生孢子數量。
1.5致病力的測定
稻曲病病菌致病力的檢測參考張君成等[13]的方法,將搖動培養(yǎng)7 d的培養(yǎng)液作為接種體(分生孢子含量為1 ml 1×106個)。在兩優(yōu)培九孕穗期(破口前5~7 d),用注射器將菌液注入穗苞,每個菌株接種12穗,每穗接種1 ml接種體。接種28 d后調查每穗稻曲球數,重復3次。
1.6UvZC1基因表達的測定
1.6.1分生孢子不同萌發(fā)階段UvZC1基因的表達用單層Miracloth(Calbiochem,La Jolla CA,USA)過濾搖動培養(yǎng)5 d的稻曲病病菌YT培養(yǎng)液,收集分生孢子。分生孢子用無菌水洗滌后,稀釋至終含量為1 ml 1×106個,取40 μl孢子液并將其涂布于鋪在YTA培養(yǎng)基上的玻璃紙上,于28 ℃避光培養(yǎng),分別于涂布培養(yǎng)后12 h、18 h、24 h、48 h和72 h取樣,以收集的未涂布的分生孢子作為對照。提取樣品RNA,用于測定UvZC1基因在孢子不同萌發(fā)階段的表達量,基因的相對表達量通過熒光定量反應(qPCR)分析獲得(TaKaRa,RR820)。qPCR反應在QuantStudio 3熒光定量PCR儀(Thermo Fisher)中完成。以α-tubulin-1作為內參基因,基因表達量的計算參照2-△△Ct方法。3次重復。
1.6.2H2O2脅迫下UvZC1基因的表達收集分生孢子,按照終含量為1ml 1×106個接種至YT培養(yǎng)液中,避光搖動培養(yǎng)2 d后,加入終濃度為3 mmol/L的H2O2繼續(xù)搖動培養(yǎng),分別于處理后0.5 h、1.0 h收集菌絲,以處理前收集的菌絲為對照。按照方法1.6.1的基因表達量檢測方法分析菌絲用H2O2處理后的UvZC1基因表達情況。
1.6.3接種水稻后侵染初期UvZC1基因的表達參照方法1.5用Jt209菌株接種兩優(yōu)培九,分別于接種后24 h、48 h取接種的稻穗,以接種前收集的菌絲為對照。參照方法1.6.1提取接種稻穗的RNA,用熒光定量方法分析UvZC1在2個侵染時間點的表達情況。
1.7其他產分生孢子相關基因在UvZC1基因敲除突變體菌株中表達量的測定
各取5粒Jt209和UvZC1敲除突變體菌碟,分別接種至含有50 ml YTS培養(yǎng)液的100 ml三角瓶中,28 ℃、160 r/min避光搖動培養(yǎng)5 d后,收集菌絲用于RNA提取。按照1.6.1的方法分析其他產分生孢子相關基因在UvZC1基因敲除突變體菌株中的表達情況。每個反應設3個重復,同時本試驗重復3次。被檢測的其他產分生孢子相關基因及其引物見表2。
2結果與分析
2.1UvZC1基因在稻曲病病菌侵染早期的表達模式
由圖1可以看出,UvZC1基因在Jt209接種兩優(yōu)培九24 h和48 h后均有表達,且基因表達量在接種后隨著接種時間的延長顯著上升,接種24 h、48 h時分別為接種起始階段的9.1倍、16.2倍,表明該基因參與稻曲病病菌早期侵染水稻的過程。
2.2稻曲病病菌UvZC1基因的克隆與序列分析
序列分析結果顯示,UvZC1基因全長1 458 bp,不含內含子,編碼485個氨基酸。UvZC1的預測編碼蛋白質含有1個GAL4(smart00066)基序和1個Fungal_TF_MHR(cl23766)基序,與其他Zn(Ⅱ)2Cys6型轉錄因子相似。蛋白質同源性比較結果顯示,UvZC1與金龜子綠僵菌(Metarhizium anisopliae)、大孢綠僵菌(Metarhizium majus)等子囊菌的Zn(Ⅱ)2Cys6型轉錄因子的相似度超過65%,與其他絲狀真菌Zn(Ⅱ)2Cys6蛋白的相似度也為50%左右(圖2)。因此確定UvZC1基因編碼的蛋白質屬于Zn(Ⅱ)2Cys6型轉錄因子。
A:UvZC1與其他真菌中Zn(Ⅱ)2Cys6轉錄因子(括號內數值表示UvZC1與其他蛋白質同源比較的identity值)的系統(tǒng)發(fā)育樹分析;B:UvZC1與其他真菌中Zn(Ⅱ)2Cys6轉錄因子的蛋白質結構分析。
2.3UvZC1基因敲除和回補突變體的獲得
以野生型菌株Jt209為對照,經抗性篩選、特異性引物PCR鑒定和Southern雜交分析,共獲得2個基因敲除突變體菌株(△UvZC1-19和△UvZC1-20)。再以敲除突變體菌株△UvZC1-19為初始菌株,回補UvZC1基因,獲得2個基因回補菌株(UvZC1 c-1和UvZC1 c-2)。用RT-UvZC1 F/RT-UvZC1 R擴增Jt209、敲除突變體和回補菌株的cDNA,發(fā)現UvZC1在Jt209和回補菌株中表達,而在敲除突變體菌株中不表達。用HPH基因特異性引物hyg1.4 R/hyg1.4 F只能從敲除突變體和回補菌株的基因組中擴增到目的片段,而在Jt209基因組中不能擴增到目的片段(圖3)。上述結果表明,敲除突變體菌株中的UvZC1基因已經被潮霉素抗性基因成功替換,回補菌株中的UvZC1基因得到了回補。
A:UvZC1基因敲除載體構建;B:Jt209菌株、UvZC1基因敲除突變體和回補菌株中UvZC1和HPH基因PCR檢測;C:Southern雜交檢測基因敲除突變體菌株中HPH基因拷貝數。a:Jt209;b:△UvZC1;c:△UvZC1c;d:△UvZC1-19;e:△UvZC1-20;f:△UvZC1-66;M:Marker。
2.4UvZC1基因對稻曲病病菌生長的影響
由圖4A、圖4B可以看出,在YTA培養(yǎng)基上,△UvZC1-19、△UvZC1-20的菌落直徑分別為(33.44±0.25) mm、(33.75±0.27) mm,與Jt209的(35.55±0.46) mm和回補菌株的(35.77±0.32) mm相比顯著下降,但各菌落間的形態(tài)沒有明顯差異,表明UvZC1基因敲除會影響稻曲病病菌的生長速率,但不影響菌落形態(tài)。
由圖4C可以看出,在0.3 mol/L NaCl、0.3 mol/L KCl、0.8 mol/L D-山梨醇和70 μg/ml 剛果紅等非生物脅迫下,Jt209、UvZC1基因敲除突變體菌株和回補菌株在生長抑制效果上沒有顯著差異,然而0.005% SDS對UvZC1基因敲除突變體菌株的抑制率明顯高于Jt209菌株和回補菌株,表明UvZC1基因參與調節(jié)稻曲病病菌細胞壁的完整性。
2.5UvZC1基因對稻曲病病菌響應氧化脅迫的影響
分析Jt209、UvZC1基因敲除突變體菌株和回補菌株在含3 mmol/L H2O2培養(yǎng)基上的生長抑制率發(fā)現,UvZC1基因敲除突變體對氧化脅迫的耐受性高于Jt209菌株和回補菌株(圖4A、圖4C);而Jt209菌株中UvZC1基因的表達量在3 mmol/L H2O2處理1.0 h時顯著上升(圖5),表明UvZC1可能參與調控稻曲病病菌響應氧化脅迫的過程。
2.6UvZC1基因對稻曲病病菌產分生孢子的影響
由圖6A可以看出,Jt209、UvZC1基因敲除突變體菌株和回補菌株搖動培養(yǎng)產生的分生孢子在形態(tài)、大小、萌發(fā)率等方面沒有顯著差異,但UvZC1基因敲除突變體菌株△UvZC1-19和△UvZC1-20產分生孢子數量較Jt209分別減少91.1%和89.4%。
由圖6B可以看出,進一步分析UvZC1在稻曲病病菌分生孢子萌發(fā)和菌絲生長、分生孢子產生等不同階段的基因表達情況發(fā)現,UvZC1在孢子萌發(fā)產生芽管及芽管伸長(萌發(fā)時間18 h)、菌絲伸長(萌發(fā)時間24 h)階段的表達量與分生孢子時期沒有顯著差異;隨著萌發(fā)的菌絲頂端新分生孢子的產生(萌發(fā)時間48 h、72 h),UvZC1相對表達量與分生孢子時期相比逐漸上升,表明UvZC1參與了稻曲病病菌產分生孢子的過程。
此外,檢測已報道的稻曲病病菌產分生孢子其他相關基因的表達量發(fā)現,與Jt209相比,UvZC1基因敲除突變體菌株中UvAC1、UvSLT2基因的相對表達量顯著上升,UvCDC2、UvCom1和UvHog1基因的相對表達量顯著下降,UvBI-1基因的相對表達量變化不顯著(圖6C)。上述結果表明,UvZC1可能通過調節(jié)稻曲病病菌多個產分子孢子相關基因,從而參與調控稻曲病病菌分生孢子的產生。
A:Jt209菌株、UvZC1基因敲除突變體菌株和回補菌株在不同非生物脅迫下的菌落形態(tài);B:在YTA培養(yǎng)基上的菌落直徑;C:在YTA培養(yǎng)基上不同非生物脅迫對菌株生長的抑制率。
2.7UvZC1基因對稻曲病病菌致病性的影響
田間接種試驗結果顯示,Jt209、UvZC1基因敲除突變體菌株和回補菌株在接種稻穗上產生的稻曲球數量無顯著差異,稻曲球形態(tài)也無明顯差異(圖7),表明UvZC1基因不影響稻曲球的產生。
3討論
本研究從稻曲病病菌中克隆到UvZC1基因,其編碼蛋白質與其他真菌中的Zn(Ⅱ)2Cys6型轉錄因子在序列和結構域上有很高的相似性,均具有包含6個半胱氨酸的GAL4基序,可以結合2個鋅離子,表明UvZC1蛋白是典型的Zn(Ⅱ)2Cys6型轉錄因子[9]。Zn(Ⅱ)2Cys6轉錄因子為僅存于真菌中的鋅簇蛋白,在釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)中,含Zn(Ⅱ)2Cys6基序的Moc3蛋白可以與其他蛋白質互作,參與調控酵母有性生殖和DNA完整性[17-18]。在絲狀真菌中,這類蛋白質參與真菌菌絲生長、產分生孢子、致病力及對不良環(huán)境的響應等過程,具有多種調節(jié)功能,但在不同真菌中的功能存在差異[19-24]。
A:不同菌株的產孢量;B:UvZC1基因在分生孢子不同萌發(fā)階段的表達量;C:UvZC1基因敲除突變體菌株中稻曲病病菌其他產分生孢子相關基因表達量。*表示在突變體菌株與野生型菌株間存在顯著差異(P<0.05)。
A:接種后稻穗產稻曲球癥狀;B:每穗平均稻曲球數。
稻曲病病菌UvZC1基因敲除突變體菌株與野生型菌株相比,菌絲生長速度減慢,產分生孢子量減少,表明UvZC1基因參與了稻曲病病菌生長和產分生孢子過程。真菌產分生孢子是多基因參與的過程,在稻曲病病菌中,已有報道顯示,編碼腺苷酸環(huán)化酶(UvAc1)、蛋白激酶(UvSLT2和UvCDC2)、轉錄因子(UvCOM1和UvHOG1)、效應因子(UvBI-1)等蛋白質的基因敲除均導致稻曲病病菌的產分生孢子量下降[7-8,13-14,16]。本研究發(fā)現,UvZC1基因正調控基因UvAc1和UvSLT2的表達,負調控基因UvCDC2、UvCom1和UvHog1的表達,可見稻曲病病菌產分生孢子也是多基因參與的過程,UvZC1作為轉錄因子參與調節(jié)多個稻曲病病菌產分生孢子相關基因的表達。此外,UvZC1基因敲除突變體菌株對由NaCl、KCl和Sorbitol等引起的鹽脅迫和滲透壓脅迫的響應與野生型沒有顯著差異,表明UvZC1不參與調節(jié)稻曲病病菌對鹽脅迫和滲透壓脅迫的響應[11]。剛果紅通過阻止細胞壁葡聚糖鏈之間的橫向作用來影響細胞壁的完整性,而SDS能使細胞壁變脆弱,從而裂解細胞。UvZC1基因敲除突變體菌株對SDS的耐受性降低,表明UvZC1參與調控稻曲病病菌細胞壁的完整性,但不影響稻曲病病菌細胞壁葡聚糖鏈之間的互作。
病原菌侵染寄主植物時會誘導其產生一系列防衛(wèi)反應來抵御病原菌的侵染[25-26],活性氧是侵染早期寄主的重要防衛(wèi)反應物質之一[27]。本研究中,H2O2可以誘導稻曲病病菌UvZC1基因的表達,同時UvZC1敲除突變體菌株對H2O2的耐受性較野生型增強,表明UvZC1蛋白參與稻曲病病菌響應氧化脅迫的過程。通過檢測侵染階段UvZC1基因的表達量發(fā)現,UvZC1基因表達量在接種后24 h和48 h即侵染早期顯著上升。然而Jt209、UvZC1敲除突變體菌株和回補菌株在水稻上產生的稻曲球數量和形態(tài)沒有明顯差異,說明該基因不影響稻曲病病菌稻曲球的產生。可能由于從稻曲病病菌基因組中已經預測到90多個C6轉錄因子[1],它們之間存在功能冗余現象,即在UvZC1缺失時,稻曲病病菌的其他C6轉錄因子基因能夠部分替代UvZC1行使功能,導致最終表現為致病力無明顯改變[28-29]。綜上所述,UvZC1參與了稻曲病病菌生長、分生孢子產生、響應氧化脅迫和細胞壁完整性建成、侵染水稻等過程,這對認識稻曲病病菌Zn(Ⅱ)2Cys6型轉錄因子功能具有重要意義。
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(責任編輯:徐艷)
收稿日期:2021-02-18
基金項目:江蘇省自然科學基金項目(BK20180296);國家自然科學基金項目(31401700)
作者簡介:俞咪娜(1985-),女,浙江杭州人,碩士,副研究員,主要研究方向為水稻真菌病害致病機制等。(E-mail)zjpsyu@163.com
通訊作者:劉永鋒,(E-mail)liuyf@jaas.ac.cn