濕潤暴露療法/濕潤燒傷膏對大鼠慢性難愈合創(chuàng)面中RELM-α表達(dá)的影響

黃許森，蘭海生，李明尚，黃海舸，岑小寧，呂建生，唐乾利

(1. 右江民族醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院，廣西 百色 533000；2． 右江民族醫(yī)學(xué)院臨床學(xué)院，廣西 百色 533000)

慢性難愈創(chuàng)面是外科常見疾病之一，因其治療周期長、難度大以及費用高，往往造成患者巨大負(fù)擔(dān)。濕潤暴露療法/濕潤燒傷膏(MEBT/MEBO)因其療效確切、操作簡單、價格低廉等特點被廣泛應(yīng)用于各種皮膚創(chuàng)面的修復(fù)治療[1]。近年來研究表明，抵抗素樣分子α( RELM-α)具有刺激肌纖維母細(xì)胞分化以及促進(jìn)動脈平滑肌細(xì)胞增殖、遷移，收縮血管等功能，而纖維組織的重塑和新生血管的產(chǎn)生在創(chuàng)面愈合中尤為重要[2-4]?；诖耍狙芯客ㄟ^動態(tài)監(jiān)測大鼠慢性難愈合創(chuàng)面組織中RELM-α的表達(dá)情況，探討了MEBT/MEBO促進(jìn)慢性難愈合創(chuàng)面愈合的可能作用機制，旨在為該方法可靠用于臨床提供更多的理論支持。

1 實驗材料與方法

1.1實驗動物 SPF級雄性Wistar大鼠135只，12～14周，體質(zhì)量240～270 g，購于長沙市天勤生物技術(shù)有限公司，于屏障環(huán)境動物實驗室內(nèi)進(jìn)行飼養(yǎng)、造模、取標(biāo)本。本研究經(jīng)右江民族醫(yī)學(xué)院實驗動物倫理委員會批準(zhǔn),嚴(yán)格遵守實驗動物福利倫理原則。

1.2主要藥物及試劑 濕潤燒傷膏(MEBO，汕頭市美寶制藥有限公司生產(chǎn))；貝復(fù)濟(外用重組牛堿性成纖維細(xì)胞生長因子，珠海億勝生物制藥有限公司生產(chǎn))；醋酸氫化可的松注射液(上海通用藥業(yè)股份有限公司生產(chǎn))；RELM-α一抗(Bioss公司，bs-1884R)；β-Actin一抗(北京中杉，TA-09)；二抗：辣根酶標(biāo)山羊抗兔(北京中杉，ZB2301)。RELM-α和GAPDH 引物(上海生工)，RNA 提取、反轉(zhuǎn)錄、熒光試劑盒(北京天根)。

1.3實驗方法 將135只大鼠隨機分為5組，每組27只54個創(chuàng)面模型。參考文獻(xiàn)[5-6]方法，MEBO組、貝復(fù)濟組、慢創(chuàng)組、急創(chuàng)組以腹腔注射水合氯醛(0.3 mL/100 g)麻醉及背部備皮后，用直徑為l.5cm的圖章標(biāo)記，并在無菌條件下沿標(biāo)記分別于脊柱兩側(cè)各做深達(dá)筋膜層的全層皮膚缺損創(chuàng)面(每只大鼠做2個創(chuàng)面)，然后MEBO組、貝復(fù)濟組、慢創(chuàng)組立即肌肉注射醋酸氫化可的松注射液(8 mg/100 g)使其形成慢性難愈合創(chuàng)面，而急創(chuàng)組不注射醋酸氫化可的松注射液?？瞻捉M只進(jìn)行備皮而不做任何創(chuàng)面損傷處理。術(shù)后創(chuàng)面常規(guī)消毒后，慢創(chuàng)組和急創(chuàng)組創(chuàng)面局部涂生理鹽水，MEBO組局部涂MEBO，貝復(fù)濟組局部涂貝復(fù)濟，外用無菌干紗布包扎固定，每天換藥2次。

1.4觀察指標(biāo)及方法

1.4.1創(chuàng)面愈合情況 各組分別于干預(yù)后第3，7，14天肉眼觀察創(chuàng)面愈合情況，并每組隨機選取9只大鼠(共18個創(chuàng)面)，在創(chuàng)面周圍放置標(biāo)尺對創(chuàng)面拍照，同時以透明薄膜描印創(chuàng)面。采用NIH lmageJ圖像分析軟件測量創(chuàng)面面積，計算創(chuàng)面愈合率。創(chuàng)面愈合率=(初始創(chuàng)面面積-觀察日創(chuàng)面面積)/初始創(chuàng)面面積×100%[6]。

1.4.2RELM-α蛋白表達(dá)水平 采用Western blot法檢測：分別于創(chuàng)面處理后第3，7，14天，從每組隨機選取9只大鼠(共18個創(chuàng)面)，取創(chuàng)面組織100 mg，提取組織蛋白，檢測蛋白含量，并將蛋白變性后保存?zhèn)溆茫粚⑻崛〉牡鞍咨蠘又糜?0 V恒壓下進(jìn)行電泳，在300 mA恒流下，轉(zhuǎn)膜至PVDF膜，室溫?fù)u床封閉1 h，用PBST洗膜3次，每次5 min，4 ℃搖床內(nèi)孵育一抗過夜，用PBST洗膜3次，每次5 min，二抗室溫孵育1.5 h；用PBST洗膜3次，每次5 min，發(fā)光顯影；最后用Image J圖像分析軟件對檢測結(jié)果進(jìn)行灰度分析，樣本蛋白含量=目的條帶積分吸光度值/內(nèi)參條帶積分吸光度值。

1.4.3RELM-α mRNA表達(dá)水平 采用qRT-PCR技術(shù)檢測：分別于創(chuàng)面處理后第3，7，14天，每組隨機選取9只大鼠(共18個創(chuàng)面)，取創(chuàng)面組織，用Trizol法提取樣本組織中的總RNA；RNA電泳以檢測RNA的完整性；TIANScript RT KIT進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄；用熒光定量PCR儀，采用2-△△CT法進(jìn)行數(shù)據(jù)的相對定量分析。RELM-α上游引物序列：5’-TGGGAAGAAAAAGGTCAAGGA-3’，下游引物序列：5’-GCCACAAGAACAACCAGTAGC；β-actin上游引物序列：5’-CCTAGACTTCGAGCAAGAGA-3’，下游引物序列：5’-GGAAGGAAGGCTGGAAGA-3’。

2 結(jié) 果

2.1各組大鼠肉眼觀察創(chuàng)面愈合情況 干預(yù)后第3天，急創(chuàng)組創(chuàng)面局部可見肉芽組織，且肉芽組織鮮紅；MEBO組創(chuàng)面邊緣可見少許肉芽組織爬行；貝復(fù)濟組局部見痂皮覆蓋，局部干燥；慢創(chuàng)組肉芽局部水腫，顏色相對灰暗。 干預(yù)后第7天，急創(chuàng)組、MEBO組、貝復(fù)濟組局部見明顯鮮紅肉芽組織爬行，而慢創(chuàng)組肉芽灰暗。干預(yù)后第14天，急創(chuàng)組、MEBO組和貝復(fù)濟組創(chuàng)面均可見表皮及毛發(fā)覆蓋，局部干燥；慢創(chuàng)組局部肉芽灰暗、水腫，局部可見滲出液。見圖1。

圖1 各組大鼠干預(yù)后不同時間肉眼觀察創(chuàng)面愈合情況

2.2各組大鼠創(chuàng)面愈合率比較 干預(yù)后第3天，各組大鼠創(chuàng)面愈合率比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；干預(yù)后第7天和第14天，急創(chuàng)組、MEBO組、貝復(fù)濟組大鼠創(chuàng)面愈合率均明顯高于慢創(chuàng)組(P均<0.05)，且急創(chuàng)組明顯高于MEBO組、貝復(fù)濟組(P均<0.05)，MEBO組與貝復(fù)濟組比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P均>0.05)。見表1。

表1 各組大鼠干預(yù)后不同時間點創(chuàng)面愈合率比較

2.3各組大鼠創(chuàng)面組織中RELM-α蛋白表達(dá)水平比較 空白組大鼠各時間點皮膚組織中RELM-α蛋白表達(dá)水平未見明顯變化(P>0.05)；干預(yù)后第3天開始，除空白組外，其余組大鼠創(chuàng)面組織中RELM-α蛋白表達(dá)水平均逐漸升高(P均<0.05)，但MEBO組、貝復(fù)濟組RELM-α蛋白表達(dá)水平均明顯低于同期慢創(chuàng)組(P均<0.05)，MEBO組與貝復(fù)濟組比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P均>0.05)。見圖2及表2。

1為MEBO組；2為貝復(fù)濟組；3為慢創(chuàng)組；4為急創(chuàng)組；5為空白組圖2 各組大鼠干預(yù)后不同時間點創(chuàng)面組織中RELM-α蛋白表達(dá)條帶圖

表2 各組大鼠創(chuàng)面組織中RELM-α蛋白表達(dá)水平比較

2.4各組大鼠創(chuàng)面組織中RELM-α mRNA表達(dá)水平比較 空白組大鼠各時間點皮膚組織中RELM-α mRNA表達(dá)水平無明顯變化(P>0.05)；干預(yù)后第3天開始，除空白組外，其余組創(chuàng)面組織中RELM-α mRNA表達(dá)水平均逐漸升高(P均<0.05)，但MEBO組、貝復(fù)濟組RELM-α mRNA表達(dá)水平均明顯低于同期慢創(chuàng)組(P均<0.05)，MEBO組與貝復(fù)濟組比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P均>0.05)。見表3。

表3 各組大鼠創(chuàng)面組織中RELM-α mRNA表達(dá)水平比較

3 討 論

慢性難愈合創(chuàng)面具有病程長、花費高、發(fā)病機制復(fù)雜等特點，是外科長期難以解決的治療難題。隨著壓瘡、下肢靜脈性潰瘍、糖尿病潰瘍等疾病在老年人群中發(fā)病率逐年增高，揭示慢性難愈合創(chuàng)面發(fā)病機制，尋找有效治療藥物成為臨床亟待解決的問題。

創(chuàng)面愈合主要包括組織細(xì)胞遷移和增殖、炎癥反應(yīng)、基質(zhì)沉積、肉芽組織形成以及血管和上皮的再生等過程，當(dāng)創(chuàng)面形成后，在趨化因子的作用下成纖維細(xì)胞開始增殖，并與浸潤的炎性細(xì)胞和毛細(xì)血管構(gòu)成肉芽組織，其中成纖維細(xì)胞是主要的修復(fù)細(xì)胞[7]。RELM-α是一種與炎癥相關(guān)的缺氧誘導(dǎo)分泌型蛋白，具有調(diào)節(jié)炎癥、刺激細(xì)胞增殖、促進(jìn)纖維化和血管再生等作用[2，8-9]。本實驗結(jié)果顯示，隨著創(chuàng)面形成，RELM-α表達(dá)量開始增高，隨著時間延長，其表達(dá)量逐漸增高，在同一時間點，RELM-α表達(dá)量慢創(chuàng)組>MEBO組=貝復(fù)濟組>急創(chuàng)組>空白組。筆者分析：RELM-α正常情況下微弱表達(dá)于嚙齒動物的肺、心臟和上皮組織中，故空白組表達(dá)量最低，在創(chuàng)面形成后，機體開始誘發(fā)炎癥反應(yīng)，而急創(chuàng)組局部炎癥較輕，且沉積成纖維細(xì)胞較為疏松，故該組RELM-α表達(dá)量低于慢創(chuàng)組；慢性難愈合創(chuàng)面在機體誘發(fā)炎癥反應(yīng)后，往往在修復(fù)過程中出現(xiàn)了修復(fù)停滯，不能順利進(jìn)入增殖與重塑階段，局部呈慢性炎癥狀態(tài)，從而上調(diào)RELM-α的表達(dá)，此外慢性難愈合創(chuàng)面因不能有效促進(jìn)創(chuàng)面再生，且沉積的細(xì)胞外基質(zhì)主要以致密成纖維細(xì)胞為主，從而進(jìn)一步刺激RELM-α的表達(dá)[10-12]，故慢性創(chuàng)面組織中RELM-α表達(dá)量明顯高于急性創(chuàng)面，最終結(jié)局表現(xiàn)出慢創(chuàng)組的愈合率最低。而給予MEBO和貝復(fù)濟干預(yù)后，RELM-α表達(dá)量下調(diào)，考慮可能與MEBO和貝復(fù)濟能有效抑制局部創(chuàng)面過度纖維化，促進(jìn)創(chuàng)面再生有關(guān)，該結(jié)果與課題組前期研究在一定程度上相契合[13]。

在正常創(chuàng)傷修復(fù)過程完成后，成纖維細(xì)胞及其分泌的因子應(yīng)當(dāng)基本消失，理論上RELM-α表達(dá)量應(yīng)當(dāng)下調(diào)，但在本研究中，RELM-α變化趨勢是持續(xù)性升高，并非是先增高后降低。有研究發(fā)現(xiàn)，RELM-α能通過PI3K/Akt等多條信號通路刺激血管平滑肌細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移，明顯促進(jìn)組織血管新生[2，8-9]。李利青等[6]研究表明，MEBT/MEBO干預(yù)慢性創(chuàng)面第3天及第7天后，創(chuàng)面組織中P13k、AKT表達(dá)量明顯高于對照組；葛斌等[14]研究表明，MEBT/MEBO能上調(diào)慢性難愈合創(chuàng)面組織中VEGFR-2的表達(dá)水平，從而促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞增生，誘導(dǎo)創(chuàng)面血管生成，增加創(chuàng)面局部血供，從而促進(jìn)創(chuàng)面愈合。故筆者猜測，RELM-α在創(chuàng)面中的表達(dá)不僅僅與炎癥反應(yīng)和成纖維細(xì)胞沉積有關(guān)，還可能與創(chuàng)面新生血管發(fā)生側(cè)支生芽有關(guān)。此外，RELM-α可激發(fā)Th2型免疫應(yīng)答，同時又被Th2型細(xì)胞因子調(diào)控，而Th1 /Th2細(xì)胞因子失衡是影響損傷組織局部炎癥形成、纖維化和新生血管形成的重要因素，而Th2細(xì)胞因子的過度表達(dá)往往導(dǎo)致組織纖維化[15-17]，故RELM-α動態(tài)調(diào)控Th1 /Th2細(xì)胞因子的特點也可能影響其在創(chuàng)面修復(fù)中的表達(dá)。

綜上所述，RELM-α的表達(dá)與創(chuàng)面愈合密切相關(guān)，其在促進(jìn)血管新生和慢性難愈合創(chuàng)面修復(fù)中可能起到積極作用，為揭示創(chuàng)面愈合機制提供了一定依據(jù)，但創(chuàng)面修復(fù)機制錯綜復(fù)雜，各通路和因子之間具體是如何相互影響和相互平衡仍未明確，故仍需進(jìn)一步研究證實。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突。