基于TGF-β1/Smad3通路和AGEs/RAGE分子研究丹蛭降糖膠囊干預(yù)糖尿病大鼠心肌纖維化的作用

汪四海,方朝暉，儲(chǔ) 俊，倪英群，趙進(jìn)東，姜 輝，霍星星，方 舟，畢 正

(1. 安徽中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，安徽 合肥 230031；2. 安徽省中醫(yī)藥科學(xué)院中醫(yī)藥防治糖尿病研究所，安徽 合肥 230031；3. 新安醫(yī)學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，安徽 合肥 230038；4. 安徽中醫(yī)藥大學(xué)，安徽 合肥 230038)

隨著社會(huì)的發(fā)展和經(jīng)濟(jì)水平的提高，糖尿病的患病率逐年增高，嚴(yán)重威脅著人類身心健康。流行病學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，糖尿病患者70%以上死于心血管系統(tǒng)疾病，是非糖尿病人群心血管系統(tǒng)疾病病死率的2～3倍[1]。糖尿病心肌病作為糖尿病的心血管并發(fā)癥之一，發(fā)病率高，危害性大，與糖尿病患者心血管疾病的高發(fā)病率和高病死率密切相關(guān)，因此成為近年來(lái)基礎(chǔ)與臨床研究的熱點(diǎn)。心肌纖維化是糖尿病心肌病的主要病理改變[2]，而心肌纖維化與轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1(TGF-β1)/Smad3信號(hào)通路密切相關(guān)[3]，當(dāng)人為敲除TGF-β1基因時(shí)，心肌纖維化進(jìn)程受到顯著抑制[4]。相關(guān)實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)，2型糖尿病模型大鼠心肌晚期糖基化終末產(chǎn)物(AGEs)/AGEs受體(RAGE)和結(jié)締組織生長(zhǎng)因子(CTGF)水平與心肌纖維化存在著正相關(guān)性[5-6]。鄭書(shū)國(guó)等[7]實(shí)驗(yàn)研究表明，丹蛭降糖膠囊能顯著抑制糖尿病血糖波動(dòng)模型大鼠心肌纖維化，其機(jī)制與增強(qiáng)心肌組織抗氧化能力、抑制心肌局部RAS激活及TGF-β1/Smad3信號(hào)通路活化、調(diào)控MMP-2/TIMP-2蛋白表達(dá)水平有關(guān)。本團(tuán)隊(duì)前期研究發(fā)現(xiàn)，丹蛭降糖膠囊可有效防治糖尿病模型大鼠誘導(dǎo)的心肌損傷，其機(jī)制可能是抑制高糖誘導(dǎo)的TLR4/MyD88/NF-κB信號(hào)通路過(guò)度表達(dá)[8]。本研究基于TGF-β1/Smad3通路和AGEs/RAGE分子研究了丹蛭降糖膠囊對(duì)糖尿病模型大鼠心肌纖維化的影響，進(jìn)一步探討該藥作用機(jī)制。

1 實(shí)驗(yàn)材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 選鼠齡為10周、體質(zhì)量180～220 g雄性清潔級(jí)SD大鼠48只，購(gòu)于安徽醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，許可證編號(hào)：SCXK-(皖)2018-002。安徽醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物房飼養(yǎng)，保持溫度22～25 ℃，相對(duì)濕度45%～60%，每天黑暗和光照交替12 h。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)過(guò)安徽中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)審查批準(zhǔn)[AHUCM(rats)2018009]。

1.2藥物 丹蛭降糖膠囊，安徽中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院院內(nèi)制劑(皖藥制字 Z20090006，專利號(hào)ZL200310112845.1，0.4 g/粒，批號(hào)：20181108)，由太子參、丹皮、生地黃、澤瀉、菟絲子、水蛭組成；鹽酸二甲雙胍片(上海信誼天平藥業(yè)有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字H31020246，0.25 g/片，批號(hào)：67190903)。

1.3試劑與儀器 鏈脲佐菌素溶液(STZ，Sigma)；山羊抗兔IgG、山羊抗小鼠IgG(Zs-BIO)；Revert AidTM first Strand cDNA Synthesis Kit(Thermo Scientific)；Novostart SYBR qPCR SuperMix Plus(Novoprotein)；AGEs、CTGF和RAGE試劑盒(美國(guó)Raybiotech公司)；RT-6000酶標(biāo)儀(雷杜公司)；DNP-9052BS-III電熱恒溫箱(上海三發(fā)公司)；LX300低速離心機(jī)(江蘇省海門市其林貝爾儀器制造有限公司)；JW3021HR臺(tái)式高速離心機(jī)(安徽嘉文公司)；StepOne TM熒光定量PCR儀(Thermo Scientific)；TS-1000水平搖床(江蘇省海門市其林貝爾儀器制造有限公司)；JS-1070P自動(dòng)曝光儀(上海培清科技有限公司)。

1.4分組、模型制備及干預(yù) 將48只SD大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，隨機(jī)選取10只作為空白組，其余38只大鼠連續(xù)3 d腹腔注射STZ溶液35 mg/kg，3 d后尾靜脈法測(cè)隨機(jī)血糖≥16.7 mmol/L即為糖尿病模型造模成功。根據(jù)文獻(xiàn)[9]研究，繼續(xù)飼養(yǎng)6周，見(jiàn)大鼠心臟組織凸顯出心肌纖維化的病理改變后，將造模成功的30只大鼠隨機(jī)分為模型組、二甲雙胍組、丹蛭降糖組，每組10只。參照《藥理實(shí)驗(yàn)方法學(xué)》[10]中人與大鼠劑量換算方法，二甲雙胍組給予二甲雙胍150 mg/(kg·d)灌胃，丹蛭降糖組予以丹蛭降糖膠囊按成人6 g/d的等效劑量540 mg/(kg·d)灌胃，空白組和模型組給予等體積蒸餾水灌胃，均連續(xù)灌胃8周。

1.5檢測(cè)指標(biāo)及方法 灌胃結(jié)束后，用3%戊巴比妥鈉30 mg/kg腹腔注射麻醉各組大鼠，取心肌組織備用。

1.5.1心肌組織病理學(xué)觀察 取心臟組織，于4%多聚甲醛溶液固定，常規(guī)石蠟包埋切片(厚度為4 μm)，伊紅-蘇木素復(fù)染，梯度脫水后二甲苯通透，中性樹(shù)脂膠封片，光學(xué)顯微鏡下觀察心肌的形態(tài)學(xué)改變。

1.5.2心肌組織中AGEs、CTGF及RAGE表達(dá)檢測(cè) 分離出左心室心肌組織約100 mg，與10倍量的磷酸鹽緩沖液(50 mmol/L，pH 7.4)充分勻漿，收集勻漿上清產(chǎn)物，根據(jù)ELISA試劑盒廠家說(shuō)明書(shū)以分光光度計(jì)法測(cè)定AGEs、CTGF、RAGE表達(dá)水平。

1.5.3心肌組織中TGF-β1、Smad3和p-Smad3蛋白表達(dá)檢測(cè) 采用Western blot法檢測(cè)：每組取心肌組織100 mg，加入RIPA細(xì)胞裂解液1 mL(每1 mL RIPA包含1 μL蛋白酶抑制劑和4 μL磷酸酶抑制劑)，離心后提取蛋白；上樣后，恒流轉(zhuǎn)膜(TGF-β1轉(zhuǎn)膜55 min，Smad3轉(zhuǎn)膜50 min，p-Smad3轉(zhuǎn)膜50 min)；轉(zhuǎn)膜結(jié)束后用5%脫脂奶粉室溫封閉2 h；參考一抗的說(shuō)明書(shū)：TGF-β1、Smad3和p-Smad3抗體屬性為兔抗按照1∶1 000稀釋(10%分離膠)，4 ℃緩慢搖動(dòng)孵育過(guò)夜；洗3次，參考二抗的說(shuō)明書(shū)，按照1∶10 000用二抗稀釋液稀釋過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗，室溫孵育2 h；最后用JS-1070P自動(dòng)曝光儀來(lái)檢測(cè)TGF-β1、Smad3和p-Smad3的蛋白表達(dá)情況。

1.5.4心肌組織中TGF-β1、Smad3基因表達(dá)檢測(cè)采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)，每組取心肌組織100 mg，液氮研磨成粉末加入1 mL Trizol，冰浴勻漿，提取RNA并測(cè)量其濃度和純度；每組取質(zhì)量為1 μg RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA；以β-actin為內(nèi)參，按照實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)書(shū)進(jìn)行基因表達(dá)水平的檢測(cè)。引物TGF-β1序列:正義5’-TGAGTGGCTGTCTTTTGACG-3’，反義5’-ACTGAAGCGAAAGCCCTGTA-3’，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為96 bp；引物Smad3序列：正義5’-CTTGGTGCAGAGACCTGTCA-3’，反義5’-TTCTCTGTGATTGCCACTGC-3’，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為74 bp。PCR的反應(yīng)條件：預(yù)變性溫度95 ℃，時(shí)間60 s；變性溫度為95 ℃，時(shí)間20 s，退火溫度為60 ℃，時(shí)間60 s，40個(gè)循環(huán)。分析方法為Relative Quantification Study，計(jì)算方法為2-ΔΔCT。

2 結(jié) 果

2.1各組大鼠心肌組織形態(tài) HE染色光鏡下觀察，空白組大鼠心肌纖維走行正常，排列有序，胞漿鮮紅豐富，胞核卵圓形，位于細(xì)胞中央；模型組大鼠心肌纖維走行較為紊亂，部分溶解，斷裂，胞核位置不一，細(xì)胞間界限不清，間質(zhì)出現(xiàn)纖維細(xì)胞增生；與模型組比較，二甲雙胍組和丹蛭降糖組心肌細(xì)胞的病變明顯減輕。見(jiàn)圖1～4。

2.2各組大鼠心肌組織中AGEs、RAGE、CTGF表達(dá)水平 與空白組比較，模型組大鼠心肌組織中AGEs、RAGE、CTGF表達(dá)水平均顯著升高(P均<0.05)；與模型組比較，二甲雙胍組和丹蛭降糖組大鼠心肌組織中AGEs、RAGE、CTGF表達(dá)水平均顯著下降(P均<0.05)，且丹蛭降糖組均顯著低于二甲雙胍組(P均<0.05 )。見(jiàn)表1。

圖1 空白組心肌組織HE染色表現(xiàn)(×400)

圖2 模型組心肌組織HE染色表現(xiàn)(×400)

圖3 二甲雙胍組心肌組織HE染色表現(xiàn)(×400)

圖4 丹蛭降糖組心肌組織HE染色表現(xiàn)(×400)

表1 各組大鼠心肌組織中AGEs、RAGE和CTGF水平比較

2.3各組大鼠心肌組織中TGF-β1、Smad3和p-Smad3蛋白表達(dá)水平 與空白組比較，模型組大鼠心肌組織中TGF-β1、Smad3和p-Smad3蛋白表達(dá)水平均顯著上調(diào)(P均<0.05)；與模型組比較，二甲雙胍組和丹蛭降糖組大鼠心肌組織中TGF-β1、Smad3和p-Smad3蛋白表達(dá)水平均顯著下調(diào)(P均<0.05)，且丹蛭降糖組均顯著低于二甲雙胍組(P均<0.05 )。見(jiàn)圖5及表2。

圖5 各組大鼠心肌組織中TGF-β1、Smad3和p-Smad3蛋白表達(dá)情況

表2 各組大鼠心肌組織中TGF-β1、Smad3和p-Smad3蛋白表達(dá)水平比較

2.4各組大鼠心肌組織中TGF-β1、Smad3基因表達(dá)水平 與空白組比較，模型組大鼠心肌組織中TGF-β1、Smad3基因表達(dá)水平均顯著上調(diào)(P均<0.05)；與模型組比較，二甲雙胍組和丹蛭降糖組大鼠心肌組織中TGF-β1、Smad3基因表達(dá)水平均顯著下調(diào)(P均<0.05)，且丹蛭降糖組均顯著低于二甲雙胍組(P均<0.05 )。見(jiàn)表3。

表3 各組大鼠心肌組織中TGF-β1、Smad3基因表達(dá)水平比較

3 討 論

糖尿病心肌病屬于一種不依賴于高血壓病、擴(kuò)張型心肌病、心臟瓣膜病、冠狀動(dòng)脈疾病及其他已知心臟疾病的獨(dú)特的心肌病理狀態(tài)，是在糖脂代謝紊亂及微血管病變基礎(chǔ)上誘發(fā)的心肌損傷和心肌纖維化，出現(xiàn)左心室肥厚、舒縮功能障礙，并最終導(dǎo)致心力衰竭[11-12]。心肌纖維化是糖尿病心肌病的主要病理改變，也是發(fā)展為終末期心臟病的必然過(guò)程，同時(shí)也是糖尿病患者死亡的主要原因。

糖尿病心肌病及由此引發(fā)的心肌纖維化尚缺乏特效治療藥物，目前西醫(yī)治療以控制血糖、降脂降壓、改善心肌供血為主，長(zhǎng)期服用藥物引起的不良反應(yīng)眾多，患者依從性較差。糖尿病心肌病屬于中醫(yī)學(xué)“消渴病心病”的范疇，多呈現(xiàn)本虛標(biāo)實(shí)之候，本虛多為氣陰虧虛，標(biāo)實(shí)多為痰濁、瘀血[13-14]?！鹅`樞·邪氣臟腑病形篇》云：“心脈微小為消癉。”脾居中焦，為氣機(jī)升降之樞紐，脾氣虛弱，氣機(jī)升降失調(diào)或血液生化不足均可導(dǎo)致血瘀；津虧血少，血行不暢或艱澀亦可致血瘀；氣為血之帥，氣虛運(yùn)血無(wú)力，也可致瘀。瘀血阻滯胸中，進(jìn)而出現(xiàn)心悸、胸痛。張會(huì)超等[15]實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，具有益氣活血功效的抗纖益心方能夠抑制糖尿病大鼠心肌纖維化，改善心功能。石銳等[16]發(fā)現(xiàn)具有豁痰解毒、化瘀通絡(luò)作用的豁痰解毒通絡(luò)飲能有效改善糖尿病心肌病患者心功能，抑制心室重構(gòu)，可能是通過(guò)調(diào)節(jié)游離脂肪酸、抑制炎癥反應(yīng)、緩解氧化應(yīng)激失衡實(shí)現(xiàn)的。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，益氣養(yǎng)陰、活血通絡(luò)之丹蛭降糖膠囊可以有效促進(jìn)糖尿病心肌病大鼠血管新生[17]。

目前，TGF-β1及其下游信號(hào)分子Smad3被公認(rèn)為是糖尿病心肌纖維化的關(guān)鍵調(diào)控因素[18-19]。心肌成纖維細(xì)胞主要對(duì)心肌細(xì)胞起結(jié)構(gòu)支持作用并負(fù)責(zé)細(xì)胞外基質(zhì)的合成，除了產(chǎn)生細(xì)胞外基質(zhì)外，還可分泌多種生長(zhǎng)因子以介導(dǎo)其與心肌細(xì)胞之間的相互作用并影響后者的功能，當(dāng)心肌損傷時(shí)能產(chǎn)生旁分泌生長(zhǎng)因子，如TGF-β1[20]、CTGF[21]。糖尿病心肌病存在著心肌組織中TGFβ1的異常升高，并且與心肌擴(kuò)張程度呈正相關(guān)[22-23]。TGFβ1通過(guò)下調(diào)細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)中的金屬蛋白酶(MMPs)活性，增加基質(zhì)蛋白酶組織抑制物(TIMMPs)的合成，抑制基質(zhì)降解，導(dǎo)致心肌纖維化，因此阻斷TGF-β1信號(hào)通路可以延緩心肌纖維化的進(jìn)程[24]。Smads是TGF-β下游的主要效應(yīng)蛋白，當(dāng) TGF-β受體被激活時(shí)，磷酸化的Smad2和Smad3可與Smad4結(jié)合，形成復(fù)合體轉(zhuǎn)移入細(xì)胞核，調(diào)控下游基因轉(zhuǎn)錄，其中Smad3是大家公認(rèn)的介導(dǎo)TGF-β1誘導(dǎo)心、腦、肺、肝、腎等臟器纖維化的信號(hào)分子，可直接結(jié)合膠原的啟動(dòng)子區(qū)域，參與ECM的生成和降解[25-29]。生理狀態(tài)下，CTGF在人類的多種組織器官中廣泛表達(dá) ；病理狀態(tài)下，CTGF可以刺激成纖維細(xì)胞的分裂增殖，促進(jìn)膠原合成，促使心肌發(fā)生纖維化，它作為TGF-β1/Smad信號(hào)通路的下游因子，可在TGF-β1誘導(dǎo)下加重心室重構(gòu)[30-31]。AGEs是非酶糖基化反應(yīng)的終末產(chǎn)物，長(zhǎng)期高糖條件下，AGEs快速形成并大量累積，因此RAGE與AGEs結(jié)合增多或活性增強(qiáng)，可以誘導(dǎo)NF-κB的活化，并由胞質(zhì)轉(zhuǎn)移到胞核中，啟動(dòng)多種靶基因的轉(zhuǎn)錄，引起一系列炎性因子上調(diào)，誘發(fā)血管內(nèi)皮損傷，最終導(dǎo)致動(dòng)脈粥樣硬化[32]。邱惠等[33]研究表明，糖尿病繼發(fā)的急性ST段抬高型心肌梗死患者直接接受經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈介入治療后血清 AGEs水平明顯升高，且其與心肌損傷標(biāo)志物CK-MB峰值和NT-proBNP呈正相關(guān)，很可能成為該病患者新的影響預(yù)后的生物標(biāo)志物。另外實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，2型糖尿病大鼠出現(xiàn)心功能改變、心肌肥大和心肌纖維化機(jī)制可能與心肌組織AGEs/RAGE軸及CTGF表達(dá)增強(qiáng)有關(guān)[5-6，34]，故通過(guò)觀察心肌AGEs/RAGE及CTGF表達(dá)水平能夠很好地反映心肌纖維化程度和預(yù)后。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，模型組大鼠心肌纖維走行較為紊亂，部分溶解、斷裂，胞核位置不一，細(xì)胞間界限不清，間質(zhì)出現(xiàn)纖維細(xì)胞增生；而采用二甲雙胍以及丹蛭降糖膠囊干預(yù)后，心肌組織形態(tài)學(xué)均有明顯改善，說(shuō)明二甲雙胍和丹蛭降糖膠囊均對(duì)糖尿病大鼠心肌纖維化有一定防治作用。從左心室AGEs/RAGE分子角度來(lái)看，模型組大鼠心肌組織中AGEs、RAGE、CTGF表達(dá)水平顯著升高，而二甲雙胍組和丹蛭降糖組大鼠心肌組織中AGEs、RAGE、CTGF表達(dá)水平顯著低于模型組，且丹蛭降糖組顯著低于二甲雙胍組，說(shuō)明丹蛭降糖膠囊能夠通過(guò)抑制糖尿病大鼠心肌AGEs/RAGE分子，從而減輕心肌纖維化；從TGF-β1/Smad3信號(hào)通路指標(biāo)來(lái)看，模型組大鼠心肌組織中TGF-β1、Smad3、p-Smad3蛋白表達(dá)水平和TGF-β1、Smad3基因表達(dá)水平均顯著上調(diào)，而二甲雙胍組和丹蛭降糖組大鼠心肌組織中TGF-β1、Smad3、p-Smad3蛋白表達(dá)水平和TGF-β1、Smad3基因表達(dá)水平均顯著低于模型組，且丹蛭降糖組均顯著低于二甲雙胍組，說(shuō)明丹蛭降糖膠囊干預(yù)TGF-β1/Smad3信號(hào)通路的作用明顯，結(jié)果與心臟形態(tài)學(xué)變化吻合。

綜上所述， 丹蛭降糖膠囊可以延緩糖尿病大鼠心肌纖維化進(jìn)程，有心臟保護(hù)作用，且效果優(yōu)于二甲雙胍，其作用機(jī)制可能與抑制心肌TGF-β1/Smad3信號(hào)通路和AGEs/RAGE分子表達(dá)有關(guān)，這為中醫(yī)藥干預(yù)糖尿病心肌病提供了新的防治思路和實(shí)驗(yàn)根據(jù)。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突。