HPLC法同時(shí)測(cè)定萹蓄藥材中8種活性成分的含量*

李 磊

新汶礦業(yè)集團(tuán)有限責(zé)任公司中心醫(yī)院藥學(xué)部，山東 泰安 271233

萹蓄為蓼科植物(polygonumaviculareL.)的干燥地上部分，全國(guó)大部分地區(qū)均有種植，夏季葉茂盛時(shí)采收，去除根和雜質(zhì)，曬干即可用于臨床。萹蓄藥材始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，現(xiàn)2015年版《中國(guó)藥典》收錄，是一味常用中草藥，常用于熱淋澀痛，小便赤短，蟲積腹痛，皮膚濕疹等癥[1-2]。萹蓄的主要化學(xué)成分有黃酮類、酚酸類、苯丙素類、生物堿類、萜類等，目前對(duì)萹蓄的質(zhì)量控制研究主要集中在黃酮類和酚酸類化合物中，但同時(shí)測(cè)定萹蓄中理化性質(zhì)相差較大的幾種活性組分含量的研究報(bào)道較少[3-10]。為了全面控制萹蓄的質(zhì)量，本研究采用HPLC法，首次建立了一次進(jìn)樣同時(shí)測(cè)定萹蓄藥材中綠原酸、咖啡酸、楊梅苷、金絲桃苷、木犀草苷、槲皮苷、槲皮素、山奈素等8種成分含量的方法，以期為萹蓄藥材的合理質(zhì)量控制提供相關(guān)科學(xué)依據(jù)。

1 儀器和試藥

1.1 儀器

Agilent 1100 高效液相色譜儀(美國(guó)Agilent公司)；GR-202 型電子分析天平(日本And公司，精確到0.1 mg)；移液器(德國(guó)Eppendorf公司)；KQ-500型數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；HH 恒溫水浴鍋(江蘇金壇國(guó)勝實(shí)驗(yàn)儀器廠)；Ultimate XB-C18色譜柱(上海月旭Welch)。

1.2 試藥

槲皮素(批號(hào)AB17051802)、綠原酸(批號(hào)AB7070302)購(gòu)自成都埃法生物科技有限公司；槲皮苷(批號(hào)wkq17081106)、楊梅苷(批號(hào)wkq17090808)、木犀草苷(批號(hào)wkq17070401)購(gòu)自四川維克奇生物科技有限公司；咖啡酸(批號(hào)110885-200102)、金絲桃苷(批號(hào)111521-201205)、山奈素(批號(hào)11861-200606)購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院；甲醇為色譜純，乙醇、磷酸為分析純，超純水。

三個(gè)批次萹蓄藥材產(chǎn)自河北保定，購(gòu)自泰安市漱玉平民大藥房，由山東第一醫(yī)科大學(xué)(山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院)孫立彥教授鑒定為蓼科植物萹蓄(polygonumaviculareL.)的干燥地上部分。

2 方法與結(jié)果

2.1 標(biāo)準(zhǔn)品溶液制備

精密稱取各標(biāo)準(zhǔn)品適量，純甲醇溶解制成含槲皮素2 mg/mL、金絲桃苷1 mg/mL、木犀草苷100 μg/mL、綠原酸1 mg/mL、山奈素 1 mg/mL、咖啡酸1.55 mg/mL、槲皮苷2 mg/mL、楊梅苷2 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)品貯備液，然后都用純甲醇稀釋配制6個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品系列質(zhì)量濃度。8種標(biāo)準(zhǔn)品貯備液各取50 μL，用純甲醇稀釋至1 mL，即得混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液。

2.2 樣品溶液制備[2-5]

3批藥材樣品磨碎、過四號(hào)篩，各精密稱取0.5 g置于50 mL具塞錐形瓶中，分別加入60%乙醇25 mL，稱定質(zhì)量，冷浸 6 h，超聲30 min，60%乙醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，0.22 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得樣品溶液。

2.3 色譜條件

Ultimate XB-C18色譜柱(4.6 mm× 250 mm，5 μm)；流動(dòng)相乙腈(A)-0.5%磷酸(B)，梯度洗脫(程序見表 1)；柱溫45 ℃；體積流量 1.0 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)360 nm；進(jìn)樣量10 μL。HPLC色譜圖見圖1。

2.4 線性關(guān)系考察

將標(biāo)準(zhǔn)品溶液在“2.3”項(xiàng)色譜條件下測(cè)定，記錄色譜圖。以標(biāo)準(zhǔn)品溶液質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(X)，峰面積為縱坐標(biāo)(Y)進(jìn)行回歸，將標(biāo)準(zhǔn)品溶液逐級(jí)稀釋，以 3倍信噪比確定檢測(cè)限，計(jì)算綠原酸、咖啡酸、楊梅苷、金絲桃苷、木犀草苷、槲皮苷、槲皮素、山奈素等8種化合物的回歸方程，結(jié)果表明各化合物的峰面積和質(zhì)量濃度之間均呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。見表2。

2.5 精密度試驗(yàn)

取同一批標(biāo)準(zhǔn)品溶液，在“2.3”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣6次，測(cè)得綠原酸、咖啡酸、楊梅苷、金絲桃苷、木犀草苷、槲皮苷、槲皮素、山奈素等峰面積RSD分別為0.58%、0.75%、0.36%、0.84%、0.64%、0.81%、0.43%、0.56%，表明儀器精密度良好。

2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn)

將樣品溶液在室溫下于 0、1、2、4、6、8、12、24 h進(jìn)樣測(cè)定，測(cè)得綠原酸、咖啡酸、楊梅苷、金絲桃苷、木犀草苷、槲皮苷、槲皮素、山奈素峰面積RSD分別為0.46%、0.35%、0.56%、0.73%、0.62%、0.72%、0.85%、0.51%，表明樣品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.7 重復(fù)性試驗(yàn)

分別取同一批萹蓄，按“2.2”項(xiàng)下方法制備 6份樣品溶液，測(cè)得綠原酸、咖啡酸、楊梅苷、金絲桃苷、木犀草苷、槲皮苷、槲皮素、山奈素等峰面積RSD分別為1.24%、2.08%、1.76%、1.21%、2.59%、2.81%、3.26%、2.67%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.8 加樣回收率試驗(yàn)

精密稱取已知含量的萹蓄粉末6份，每份約 0.5 g，置于具塞錐形瓶中，精密加入適量標(biāo)準(zhǔn)品溶液，按“2.2”項(xiàng)下方法制備樣品溶液，測(cè)定加樣回收率。結(jié)果見表3，符合分析要求。

2.9 樣品含量測(cè)定

用“2.2”制備的樣品溶液，按“2.3”條件進(jìn)行HPLC分析，測(cè)定各指標(biāo)成分的峰面積并計(jì)算含量，有關(guān)數(shù)據(jù)見表4。

表1 梯度洗脫程序

圖1 混合標(biāo)準(zhǔn)品和樣品的HPLC譜圖

表2 回歸方程及相關(guān)系數(shù)

表3 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果(n=6)

續(xù)表

表4 萹蓄中8種成分含有量檢測(cè)結(jié)果(%)

3 討 論

本研究對(duì)萹蓄藥材中的8種藥效成分進(jìn)行了分析檢測(cè)，其中包括黃酮類化合物和酚酸類化合物，是首次對(duì)萹蓄中理化性質(zhì)相差較大的幾種活性組分含量的研究。對(duì)不同流動(dòng)相進(jìn)行了考察，包括甲醇-0.2%磷酸水和乙腈-0.5%磷酸水，最后確定乙腈-0.5%磷酸水及梯度洗脫條件。

2015年《中國(guó)藥典》萹蓄藥材的質(zhì)控指標(biāo)僅規(guī)定了楊梅苷，本研究也證明楊梅苷是萹蓄中含量最高的有效成分之一，河北保定產(chǎn)3批次萹蓄中楊梅苷含量均高于藥典0.03%的要求[1]。除楊梅苷外，本研究還同時(shí)檢測(cè)了萹蓄中其他7種有效成分，為全面評(píng)價(jià)和研究萹蓄藥材質(zhì)量、保障臨床用藥安全有效提高了有力支撐。

3批次萹蓄藥材中8種有效成分含量比重有差異，但基本一致的是含量最高的為楊梅苷，其次是咖啡酸、槲皮苷和槲皮素，較少的是綠原酸和山奈素，金絲桃苷和木犀草苷微量或者檢測(cè)不出。原因可能是藥材采收期、生長(zhǎng)年限、存放條件和時(shí)間、取樣量部位的不同導(dǎo)致有效成分含量有差異。本次選取的萹蓄都是產(chǎn)自河北保定，產(chǎn)地不同也會(huì)導(dǎo)致有效成分含量的差異。而其中某些有效成分檢測(cè)不出可能因?yàn)槿恿可俨灰讬z測(cè)或者在溶媒中溶解性不好。