Kristen鼠肉瘤致癌基因突變對非小細胞肺癌患者病情發(fā)生發(fā)展和程序性死亡受體 1及其配體表達的影響

陳曲，王嵬，何玉男，遲新楠

錦州市中心醫(yī)院腫瘤科，遼寧 錦州 121000

肺癌在與惡性腫瘤相關的病死率中居首位，其中非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）是最重要的病理類型，占所有肺癌的80%～85%[1]。大多數(shù)患者在被診斷出NSCLC時是局部晚期或存在遠處轉移。近年來，基于驅動基因的分子檢測以及小分子酪氨酸激酶抑制劑的發(fā)展使晚期NSCLC的臨床治療不再局限于細胞毒性藥物[2]。Kristen鼠肉瘤致癌基因（KRAS proto-oncogene，KRAS）突變是最常見的肺癌驅動基因突變之一[3]。KRAS基因編碼腫瘤發(fā)生和發(fā)展中的關鍵信號蛋白，并且是促進腫瘤細胞生長、存活、轉移和擴散的重要培養(yǎng)基[4]。但是，迄今為止，還沒有有效的針對KRAS突變的靶向治療藥物。程序性死亡受體1（programmed cell death 1，PDCD1，也稱PD-1）/程序性死亡受體配體1（programmed cell death 1 ligand 1，PDCD1LG1，也稱PD-L1）可以作為免疫檢查點預測晚期腫瘤患者的生存預后[5]。為了探討KRAS在NSCLC組織中的表達及與PD-1、PD-L1表達的關系，本研究選取88例NSCLC組織標本進行研究，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集2017年1月至2019年12月錦州市中心醫(yī)院收治的NSCLC患者的病歷資料。納入標準：①均經(jīng)病理學確診；②術前未行放化療等治療；③臨床資料保存完整。排除標準：①合并其他系統(tǒng)惡性腫瘤；②合并免疫系統(tǒng)疾病、血液系統(tǒng)疾病等。根據(jù)納入、排除標準，共納入88例NSCLC患者，其中男性45例，女性43例；年齡32～75歲，中位年齡51歲；病理類型：腺癌50例，鱗狀細胞癌38例。收集NSCLC患者的NSCLC組織標本88例。

1.2 免疫組織化學檢測方法

將收集的石蠟包埋組織標本切片經(jīng)10%甲醛固定24～48 h，之后行石蠟包埋。將石蠟標本切成厚度約為4 mm的連續(xù)組織切片4張，60℃烘烤3 h，常規(guī)脫蠟，加3% H2O210 min，在室溫下孵育，磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）洗滌3次，每次3 min，檸檬酸溶液修復，PBS洗滌3次，每次3 min，加上一抗孵育過夜，PBS洗滌3次，每次3 min，添加聚合物增強劑，在室溫下孵育20 min，PBS洗滌3次，每次3 min，室溫下添加酶標記的抗小鼠聚合物（二抗，在室溫下孵育30 min），用PBS洗滌3次，每次3 min，二氨基聯(lián)苯胺（diaminobenzidine，DAB）顯色，用水沖洗，用蘇木精復染，常規(guī)脫水封片。試劑盒均購自北京中山生物制品有限公司。

1.3 實時熒光定量聚合酶鏈反應（real-timequantitative polymerase chain reaction ，qRT-PCR）檢測方法

總RNA提?。簩⒀寮尤霟oRNA酶的離心管中，加入裂解液，充分混合并裂解，按照試劑盒的說明進行操作，按照分光光度法檢測濃度和純度，RNA純度高，不降解，不污染DNA用于cDNA合成。逆轉錄合成反應系統(tǒng)：RNA模板2 μl，RT引物2 μl，5×RT緩沖液 5 μl，dNTP（2.5 mmol/L）2 μl，40 U/μl RNase inhibitor 0.5 μl，20 U/μl RT 酶 0.5 μl，ddH2O 24 μl。按照逆轉錄試劑盒中的步驟將RNA逆轉錄為cDNA。qRT-PCR檢測：以β-actin為內參，以cDNA為模板進行逆轉錄。反應系統(tǒng)：cDNA 2 μl，2×SYBR Green qPCR混合物10 μl，正向引物 1 μl，反向引物 1 μl，焦碳酸二乙酯（diethyl pyrocarbonate，DEPC）水 6 μl，總反應量 20 μl。每個靶基因重復3次。反應條件：95℃10min，95℃15min，60℃1 min，40個循環(huán)；72℃ 30 s。啟動qRT-PCR儀器進行PCR擴增，并使用Bio-Rad CFX Manager軟件分析KRAS基因狀態(tài)。KRAS引物：內引物，上游引物（2-F）GGCCTGCTGAAAATGACTG，下游引物（2-R）Biotin-GCTGTATCGTCAAGGCACTCTT；外引物，上游引物（1-F）GACATGTTCTAATATAGTCAC，下游引物（1-R）GTCCTGCACCAGTAATATGCA。 測 序 引 物（PS-K）：CTTGTGGTAGTTGGAGCT。

1.4 統(tǒng)計學分析

采用SPSS 22.0軟件進行數(shù)據(jù)分析，計數(shù)資料以例數(shù)及率（%）表示，組間比較采用χ2檢驗；采用Kaplan-Meier法繪制生存曲線，生存情況的比較采用Log-rank檢驗；以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 KRAS基因突變情況

88例NSCLC患者中，檢測出12例患者出現(xiàn)KRAS基因突變，突變率為13.64%，均為第2外顯子的12位密碼子突變。

2.2 不同臨床特征的NSCLC患者NSCLC組織中KRAS基因突變情況的比較

腺癌患者NSCLC組織中KRAS基因突變率明顯高于鱗狀細胞癌患者，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）；不同性別、年齡、TNM分期、腫瘤直徑、分化程度和是否吸煙的NSCLC患者的NSCLC組織中KRAS基因突變率比較，差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。（表 1）

表1 不同臨床特征的NSCLC患者NSCLC組織中KRAS基因突變情況的比較（ n=88）

2.3 KRAS基因突變與預后的關系

截至2020年5月，KRAS基因突變患者的中位總生存時間為12個月（95%CI：10.33～13.67），明顯少于KRAS基因未突變患者的23個月（95%CI：21.94～24.06），差異有統(tǒng)計學意義（χ2=54.912，P＜0.01）。（圖1）

圖1 KRAS基因突變（ n=12）與KRAS基因未突變（ n=76）患者的生存曲線

2.4 KRAS基因突變與PD- 1、PD-L 1表達的關系

KRAS基因突變與未突變NSCLC組織中PD-1、PD-L1陽性表達率比較，差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。（表2）

表2 NSCLC組織中KRAS基因突變與PD- 1、PD-L 1表達的關系[ n（%）]

3 討論

NSCLC包括鱗狀細胞癌、腺癌和大細胞癌，與小細胞癌相比，其腫瘤細胞的生長和分裂較慢，擴散和轉移相對較晚。表皮生長因子（epidermal growth factor，EGF）信號轉導途徑是NSCLC形成和發(fā)展的重要途徑，其受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）的激活抑制腫瘤細胞的凋亡，促進腫瘤細胞的增殖和腫瘤組織的血管生成轉移[6-8]。免疫系統(tǒng)的腫瘤免疫監(jiān)視功能可以識別和控制腫瘤細胞的生長。在T細胞免疫機制中，PD-1是公認的免疫檢查位點的負性調節(jié)T細胞功能的抑制受體[9]。人PD-1基因位于2q37.3染色體上，編碼免疫球蛋白超家族的Ⅰ型跨膜糖蛋白，主要在活化的T細胞中表達[10]。PD-L1是PD-1的主要配體，在正常人體中，PD-1與PD-L1相互作用在細胞碳末端磷酸化ITSM，募集Src同源蛋白酪氨酸磷酸酶2（Src homologue tyrosine phosphatase 2，SHP2）磷酸分子、下游脾酪氨酸激酶（Spleen tyrosine kinase，Syen）和磷脂酰肌醇3-激酶（phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K）被去磷酸化，然后發(fā)出抑制信號以發(fā)揮負調節(jié)功能[11-12]?，F(xiàn)在普遍認為，PD-L1在腫瘤細胞中的表達是NSCLC預后不良的一個因素，主要由于PD-L1對機體免疫功能的負調節(jié)作用導致腫瘤細胞更容易生長和擴散。PD-L1在疾病的進展中起著重要作用，因此檢測PD-L1在肺癌組織中的表達可以幫助評估患者的預后。

RAS途徑是EGFR下游信號轉導途徑中的主要調節(jié)途徑之一，RAS途徑的激活在細胞增殖過程中起著至關重要的作用。KRAS是RAS家族的成員，其位于人類12號染色體上，編碼一種分子量為21 kD的蛋白質，因此被稱為p21蛋白。KRAS分布在細胞膜內，可以與三磷酸鳥苷（green fluorescein protein，GTP）和二磷酸鳥嘌呤核糖核苷（guanine diphosphate nucleoside，GDP）結合，并具有GTPase的生物學功能[13]。在正常細胞中，KRAS蛋白與GDP結合不傳輸生物信號。當細胞受到外界刺激時，GDP從K-RAS蛋白中解離出來，然后GTP與KRAS結合起來使K-RAS恢復其信號轉導功能[14]。KRAS蛋白可以通過多種信號途徑將有絲分裂和生長信號從細胞質傳遞至細胞核。KRAS的激活狀態(tài)由其固有的GTP酶活性終止，從而水解GTP[15]。KRAS基因突變后，由其編碼的蛋白質的GTPase活性降低，并在細胞中連續(xù)傳遞信號，刺激細胞生長和增殖，最終可能導致細胞惡變。KRAS突變存在于大約30%的人類惡性腫瘤中[16]。NSCLC中的KRAS突變也是當前分子病理學研究的熱點，特別是在肺腺癌中，肺鱗狀細胞癌RAS突變中的KRAS突變相對較少。KRAS突變可能是腫瘤發(fā)生的驅動基因。

第2外顯子的12和13號密碼子是KRAS基因突變的常見突變位點，12號密碼子的突變率（92%）顯著高于13號密碼子的突變率[17]，與本次研究結果一致。在選擇肺腺癌的靶向療法之前，有必要同時檢測EGFR和KRAS基因的突變狀態(tài)，這不僅有助于指導靶向藥物的篩選，而且有助于判斷靶向藥物的療效。KRAS基因突變與性別、年齡、TNM分期、腫瘤直徑、分化程度和是否吸煙無關。亞洲人群中肺癌的突變率很低，研究結果差異可能與人群之間KRAS突變率不一致和樣本量不足導致的抽樣誤差有關。此外，各種研究中使用的基因檢測方法也不同，不同檢測方法的敏感性和特異性也會影響結果。相信隨著實驗方法的進一步完善和臨床數(shù)據(jù)的不斷積累，KRAS突變與NSCLC臨床特征之間的相關性有助于篩查高危人群的臨床工作，有利于進行KRAS突變位點的靶向治療研究。KRAS基因突變患者總體生存時間為12個月，明顯少于KRAS基因未突變患者，更進一步地證實了KRAS突變作為NSCLC預后負性預測因子的價值。有研究發(fā)現(xiàn)，阻斷KRAS的下游途徑可以減少PD-L1在腫瘤細胞表面的表達，KRAS所在的促分裂原活化的蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）途徑在細胞表面PD-L1的表達中起著主導作用[18]，但是其分子機制尚未確定。本研究對NSCLC中二者的相關性進行分析，KRAS基因突變和未突變NSCLC組織中PD-1、PD-L1陽性表達率比較差異均無統(tǒng)計學意義。因此，MAPK途徑可能不是PD-L1表達的調控途徑。

已有研究發(fā)現(xiàn)，KRAS突變與多種腫瘤密切相關[19-20]，但其與PD-1和PD-L1表達之間的相關性存在爭議。原因可能是NSCLC中KRAS突變率低，臨床數(shù)據(jù)有限。另外，免疫組織化學方法檢測PD-1和PD-L1蛋白的表達尚無統(tǒng)一的陽性標準，這也導致統(tǒng)計學結果與表達調控研究中所選擇的細胞系之間存在差異。KRAS突變與PD-1和PD-L1表達的相關性有待進一步研究。本研究進一步探討了KRAS在NSCLC組織中的表達及與PD-1、PD-L1表達的關系。

綜上所述，KRAS基因突變與NSCLC患者病理組織類型、預后有一定關系，與PD-1及其配體表達無明顯關系。