錯(cuò)配修復(fù)蛋白MLH1、MSH2、PMS2、MSH6及p53在結(jié)直腸癌中的表達(dá)及意義

潘思瓊，陸奉科 ，李山

1.廣西醫(yī)科大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院，廣西 南寧 530021；2.廣西醫(yī)科大學(xué)第四附屬醫(yī)院病理科，廣西 柳州 545000；3.柳州市婦幼保健院輸血科，廣西 柳州 545000

結(jié)直腸癌(colorectal cancer，CRC)是消化道較為常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，發(fā)病率位居全球惡性腫瘤第三位，也是中國(guó)癌癥死亡的第二大原因[1]。在歐洲，2018 年估計(jì)有38.8 萬(wàn)例新發(fā)病例和17.4 萬(wàn)例相關(guān)死亡病例。我國(guó)每年新增病例超過(guò)25 萬(wàn)例，約14 萬(wàn)患者死于CRC[2]。研究報(bào)道，10%～20%的散發(fā)性結(jié)直腸癌與DNA 錯(cuò)配修復(fù)蛋白(mismatch repair proteins，MMRP)功能的損傷有關(guān)，錯(cuò)配修復(fù)缺陷導(dǎo)致遺傳不穩(wěn)定，即微衛(wèi)星不穩(wěn)定性(microsatellite instability，MSI)[3]。約 40%的 CRC 病例中發(fā)現(xiàn) p53 突變，p53 突變體可獲得加速惡性進(jìn)展、增加腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移功能，在CRC 發(fā)育過(guò)程中可以發(fā)揮一個(gè)非常重要的作用。本研究采用免疫組織化學(xué)方法對(duì)結(jié)直腸癌組織標(biāo)本中錯(cuò)配修復(fù)蛋白(MLH1、MSH2、PMS2、MSH6)和p53 進(jìn)行檢測(cè)，分析其與臨床病理特征之間的關(guān)系，為結(jié)直腸癌的臨床治療和預(yù)后評(píng)價(jià)提供一個(gè)有效的參考依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集廣西醫(yī)科大學(xué)第四附屬醫(yī)院2019 年1 月至2020 年6 月經(jīng)病理確診的結(jié)直腸癌標(biāo)本261例，標(biāo)本術(shù)前均未經(jīng)過(guò)化療或放療，所有患者有較完整的臨床資料。其中男性162 例，女性99 例；年齡29～92歲，中位年齡62歲。本研究受醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)認(rèn)可。

1.2 主要試劑 鼠單抗MLH1、鼠單抗MSH2、兔單抗MSH6、兔單抗PMS2及鼠單抗p53均購(gòu)自福州邁新公司，磷酸鹽緩沖液(PBS)、MaxVision-HRP 鼠/兔免疫顯色試劑、DAB顯色液均由病理科提供。

1.3 方法 所有標(biāo)本經(jīng)10%中性福爾馬林進(jìn)行固定，脫水，石蠟包埋，選取4 μm 切片，經(jīng)65℃烤片2 h，脫蠟水化，抗原修復(fù)(EDTA 緩沖溶液高壓熱修復(fù))，浸泡3%H2O2，阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化酶的活性，滴加一抗，室溫孵育1 h，PBS 緩沖液沖洗，再滴加二抗，室溫孵育20 min，PBS緩沖液沖洗，DAB顯色液顯色，蘇木素復(fù)染胞核，鹽酸分化，梯度酒精(低至高)進(jìn)行脫水，中性樹(shù)膠封片。

1.4 結(jié)果判斷 MLH1、MSH2、PMS2、MSH6 均定位于細(xì)胞核，胞核呈現(xiàn)黃色或棕黃色顆粒則判斷為陽(yáng)性表達(dá)，胞核不著色為缺失。MLH1、MSH2、PMS2、MSH6 蛋白中任意一種缺失判定為MSI。p53表達(dá)出現(xiàn)于細(xì)胞核，核呈黃色或棕黃色判斷為陽(yáng)性。所有免疫組化結(jié)果由兩位經(jīng)驗(yàn)豐富的資深病理學(xué)專家共同診斷。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS25.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)數(shù)資料采用連續(xù)校正χ2檢驗(yàn)；采用Spearman等級(jí)相關(guān)分析各指標(biāo)之間的相關(guān)性，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 MMRP、p53 在 CRC 中的表達(dá) 261 例 CRC中MMRP 陽(yáng)性者為248 例(95.0%)，表達(dá)缺失者為13例(5.0%)，其中MLH1、MSH2、PMS2、MSH6 表達(dá)缺失者分別為 7 例(2.7%)、3 例(1.1%)、8 例(3.1%)、4 例(1.5%)。 MLH1 和 PMS2 共 同 表 達(dá) 缺 失 者 為 7 例(2.7%)，MSH2 和 MSH6 共 同 表 達(dá) 缺 失 者 為 2 例(0.8%)。p53陽(yáng)性表達(dá)者為211例(80.8%)，陰性表達(dá)者50例(19.2%)，見(jiàn)圖1。

2.2 MSI、p53 表達(dá)與 CRC 臨床病理特征的關(guān)系 MSI 與結(jié)直腸癌患者性別、腫瘤直徑、年齡、部位、分化程度、淋巴結(jié)是否轉(zhuǎn)移及腫瘤浸潤(rùn)深度均無(wú)關(guān)(P＞0.05)，p53與患者性別有關(guān)(P＜0.05)，見(jiàn)表1。

2.3 MSI 與 p53 的相關(guān)性 MSI 與 p53 表達(dá)無(wú)相關(guān)性(r=-0.111，P＞0.05)，見(jiàn)表2。

圖1 MMRP蛋白、p53在CRC中的陽(yáng)性表達(dá)(10×10)注：A，MLH1 在 CRC 中的陽(yáng)性表達(dá)；B，MSH2 在 CRC 中的陽(yáng)性表達(dá)；C，MSH6 在CRC 中的陽(yáng)性表達(dá)；D，PMS2 在 CRC 中的陽(yáng)性表達(dá)；E，p53 在CRC中的陽(yáng)性表達(dá)。

2.4 MLH1 與 PMS2、MSH2 與 MSH6 的 相 關(guān)性 MLH1 與 PMS2 表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.934，P＜0.05)，MSH2與MSH6表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.572，P＜0.05)，見(jiàn)表3。

MLH1PMS2 MSH2 rs值P值MSH6rs值P值-+-7 1+0＜0.050.072+0 0.572＜0.05 253-+-3 1 257

3 討論

CRC是胃腸道系統(tǒng)中一種異質(zhì)性惡性腫瘤，它是由多階段及多種因素發(fā)展而來(lái)的復(fù)雜性疾病，其病因可能與生活方式(吸煙、飲酒等)、個(gè)體不同的遺傳背景、環(huán)境因素以及腸道菌群與宿主免疫系統(tǒng)的動(dòng)態(tài)失衡有關(guān)[4]。錯(cuò)配修復(fù)基因是DNA 損傷反應(yīng)通路的一個(gè)重要組成部分，負(fù)責(zé)維持基因組的完整性[5]，包括MLH1、MSH2、PMS2、MSH6等。MMRP能很好地糾正微衛(wèi)星中的移碼突變和DNA復(fù)制過(guò)程中產(chǎn)生的不匹配核苷酸，其表達(dá)異常可導(dǎo)致腫瘤抑制基因、原癌基因或DNA修復(fù)基因突變，使正常結(jié)腸上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)化為腫瘤細(xì)胞[6]。而微衛(wèi)星不穩(wěn)定是指短串聯(lián)重復(fù)序列(編碼區(qū)和非編碼區(qū))普遍不穩(wěn)定，在DNA修復(fù)過(guò)程中，錯(cuò)配修復(fù)基因編碼相應(yīng)的酶，也可以識(shí)別堿基對(duì)，如果MMR缺陷或突變會(huì)損害細(xì)胞DNA能力，可能會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞死亡或基因組不穩(wěn)定[7]。因此，MMRP中的MLH1、MSH2、PMS2、MSH6在結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展過(guò)程中具有重要意義。

本研究發(fā)現(xiàn)，261 例 CRC 中 MSI 發(fā)生率為 5.0%，MLH1、MSH2、PMS2、MSH6表達(dá)缺失者分別為2.7%、1.1%、3.1%、1.5%。根據(jù)胡曉儒等[8]研究658例結(jié)直腸癌中錯(cuò)配修復(fù)蛋白的表達(dá)，結(jié)果顯示MSI 發(fā)生率為6.7%，MLH1、MSH2、PMS2、MSH6、表達(dá)缺失者分別為4.1%、2.3%、4.3%、2.4%，與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果相近。而另?yè)?jù)國(guó)內(nèi)外有文獻(xiàn)報(bào)道MMRP 表達(dá)缺失率在15%左右[9-10]，這一發(fā)現(xiàn)可能反映了MMRP在不同人種、不同地域間存在差異，也可能與遺傳因素和生活方式與腫瘤的特征密切相關(guān)。此外，統(tǒng)計(jì)學(xué)分析顯示，MSI的表達(dá)缺失與性別、年齡、部位、腫瘤直徑、腫瘤分化程度和細(xì)胞浸潤(rùn)深度無(wú)相關(guān)性，與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，其發(fā)生機(jī)制有待進(jìn)一步研究。PMS2的缺失與發(fā)病部位有關(guān)，發(fā)生在右半結(jié)腸較為多見(jiàn)，這可能與各種生物學(xué)和臨床差異，包括胚胎起源、生理功能和血管供應(yīng)相關(guān)[11]。右側(cè)結(jié)直腸來(lái)源于中腸，由腸系膜上動(dòng)脈供血，常表現(xiàn)為全基因組的高甲基化、MSI-H高突變。而左側(cè)結(jié)直腸來(lái)源于后腸，由腸系膜下動(dòng)脈供血，包括染色體不穩(wěn)定所導(dǎo)致。

在本次研究對(duì)象中，MLH1 和PMS2 共同缺失者有 7 例，MSH2 和 MSH6 共同缺失者有 2 例，MSH2 和MSH6、MLH1 和 PMS2 均呈正相關(guān)(r=0.934，P＜0.05；r=0.572，P＜0.05)，表 明 MLH1 和 PMS2、MSH2 和MSH6 經(jīng)常共同缺失或表達(dá)，可能與蛋白質(zhì)異源二聚體、MSH2 二聚體和 MSH6、MLH1 二聚體和 PMS2 分別形成功能復(fù)合物大腸桿菌(MutS inhibitor)和大腸桿菌(MutL inhibitor)有關(guān)，MSH2蛋白是其異源二聚體的先決條件，MSH2 突變可導(dǎo)致 MSH2 和 MSH6 蛋白同時(shí)缺失[12]。而MLH1缺失是MMRP中最常見(jiàn)的模式，其原因可能是由于MMRP缺失時(shí)，MLH1基因進(jìn)行啟動(dòng)子高甲基化，使其在DNA損傷修復(fù)中分別與其同源性MMRP形成復(fù)合體導(dǎo)致MMR蛋白表觀遺傳癥狀[13]。

p53 基因是最重要的腫瘤抑癌基因之一，位于17號(hào)染色體的短臂，參與組織細(xì)胞凋亡或細(xì)胞生命周期阻滯、DNA 損傷修復(fù)等過(guò)程[14]。p53 基因突變是導(dǎo)致腫瘤進(jìn)展的主要原因，大約50%的癌癥患者中發(fā)現(xiàn)其突變[15]。有研究顯示，突變型p53 CRC 患者比野生型p53 患者化療耐藥更嚴(yán)重，反映了p53 突變狀態(tài)在CRC 進(jìn)展及預(yù)后不良中發(fā)揮重要的作用[16]。在本次研究中p53的陽(yáng)性率為80.8%，與性別有關(guān)，與腫瘤細(xì)胞浸潤(rùn)深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無(wú)關(guān)，p53 表達(dá)與MSI 無(wú)相關(guān)性，實(shí)驗(yàn)結(jié)果與其他文獻(xiàn)的研究結(jié)果有所差異?？赡苁怯捎谟^察到的p53過(guò)表達(dá)不一定與p53基因突變有關(guān)。不同類型p53 突變引起的致癌機(jī)制不同，野生型p53 的缺失影響侵襲過(guò)程，突變型p53 獲得功能獲得(GOF)活性，也可能是由于MSS 型和MSI 型結(jié)直腸癌具有不同的致癌機(jī)制和通路，而且地域種族、其他遺傳或非遺傳、非標(biāo)準(zhǔn)化操作等因素也可導(dǎo)致結(jié)果不一致。

綜上所述，結(jié)直腸癌中錯(cuò)配修復(fù)蛋白表達(dá)的部分缺失，與其臨床病理特征關(guān)系密切。p53 表達(dá)與MSI是否存在聯(lián)系，尚需要多中心大量的標(biāo)本進(jìn)行進(jìn)一步的研究證實(shí)。而通過(guò)檢測(cè)MMRP及p53指標(biāo)，對(duì)CRC的早期進(jìn)行診斷、風(fēng)險(xiǎn)管理評(píng)估及預(yù)后評(píng)價(jià)具有一定的參考意義。