介紹一種簡(jiǎn)單易行的組織芯片制作方法

武振汝，陳夢(mèng)琳，李 麗，石毓君，步 宏,2

組織芯片技術(shù)又稱組織微陣列(tissue microarray, TMA)，是將數(shù)十至上百個(gè)小組織塊按預(yù)先設(shè)計(jì)的陣列圖排列在同一玻片上形成矩陣的微縮組織塊。由Kononen等[1]首次提出，并證實(shí)了其實(shí)用價(jià)值。組織芯片具有體積小、易操作、信息量大等特點(diǎn)，該技術(shù)被廣泛應(yīng)用到臨床和科學(xué)研究中。組織芯片有多種制作方法[2-4]，但鑒于設(shè)備昂貴，操作復(fù)雜，不易切片，掉片率高等問(wèn)題未被推廣使用。本科室在此基礎(chǔ)上進(jìn)行改進(jìn)，總結(jié)出一種操作簡(jiǎn)便，成本低廉，切片簡(jiǎn)單，不易掉片，易于推廣的組織芯片制作方法，現(xiàn)介紹如下。

1 材料與方法

1.1 材料選取四川大學(xué)華西醫(yī)院生物樣本庫(kù)肝細(xì)胞癌、肝內(nèi)膽管癌以及其對(duì)應(yīng)的癌旁冷凍新鮮組織800例。

1.2 耗材與儀器石蠟(熔點(diǎn)58 ℃)、HE染液、顯微防脫玻片、組織切片機(jī)(HM355S型)等，均購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher公司；組織芯片儀(Quick-Ray，UNITMA，中國(guó))；特尖頭長(zhǎng)嘴鑷子(深圳上河科技公司)。

1.3 組織芯片制作步驟

1.3.1制備供體蠟塊 冷凍新鮮組織用鑷子從凍存管中取出，在組織未完全融化時(shí)用取材刀修整成大小2 cm×1.5 cm×0.3 cm的組織塊，修整好的組織放入10%中性福爾馬林中固定48 h后，按照常規(guī)方法脫水、浸蠟、包埋。包埋好的蠟塊首先切片行HE染色，顯微鏡下觀察HE染色結(jié)果，并圈出所需病變的位置，對(duì)應(yīng)切片中圈出的位置，用記號(hào)筆在蠟塊上輕輕標(biāo)出穿刺點(diǎn)。

1.3.2制作工具準(zhǔn)備和組織微陣列的設(shè)計(jì) 準(zhǔn)備組織芯片制作使用的工具，骨髓穿刺針或機(jī)械組織芯片儀用于從供體蠟塊上取組織柱，刀片用于修整組織柱，長(zhǎng)尖鑷用于夾取組織柱植入微陣列包埋模具(圖1)。

圖1 微陣列蠟塊制作工具：A.骨髓穿刺針；B.組織芯片儀取樣針；C.刀片；D.長(zhǎng)尖嘴鑷

在電腦上設(shè)計(jì)出邊長(zhǎng)為2 mm的正方格排列圖，用A4紙打印，用剪刀剪裁出10×12的方格圖，使剪裁出來(lái)的方格圖剛好鋪在包埋模具的底部。

1.3.3包埋模具準(zhǔn)備 選取底面最大型號(hào)的包埋模具，包埋模具和剪裁好的10×12的方格圖在65 ℃液態(tài)石蠟中預(yù)加熱，加熱完畢后用鑷子把10×12的方格圖放置在包埋模具內(nèi)部，從蠟液中取出包埋模具并傾倒出其內(nèi)部多余的蠟液，包埋模具室溫冷卻后待用(圖2)。

1.3.4制作微陣列蠟塊 制作微陣列蠟塊前應(yīng)先將供體蠟塊在37 ℃烤箱中預(yù)熱20 min或65 ℃烤箱中預(yù)熱3 min，再將受體蠟塊置于平整工作臺(tái)，用機(jī)械穿刺針或骨髓穿刺針打孔。打孔前先將穿刺針針芯抽出，對(duì)準(zhǔn)欲穿刺陣點(diǎn)垂直向下均勻用力使針套穿透供體蠟塊，再將穿刺針套拔出，用穿刺針針芯把針帽套內(nèi)組織柱輕輕推出置于潔凈平板上，用切片刀片把穿刺好的組織柱兩端修平，再用長(zhǎng)嘴尖鑷把修好的組織塊按照預(yù)先設(shè)定的位置面朝下擺在包埋模具內(nèi)，此為打好1個(gè)孔。穿刺供體蠟塊前應(yīng)制作10×12表格寫(xiě)入供體蠟塊編號(hào)，穿刺時(shí)按此順序進(jìn)行。待包埋模具全部點(diǎn)陣(一般最后2或4個(gè)點(diǎn)不用穿刺以便定位)后(圖3)，將擺有組織柱的微陣列包埋模具小心移動(dòng)到65 ℃包埋臺(tái)上。等待微陣列包埋模具底部原有石蠟融化，在此期間可以用鑷子蘸取一滴蠟液從包埋模具邊緣滴入包埋模具里面，待組織柱中的石蠟徹底融化，把微陣列包埋模具輕輕轉(zhuǎn)移到平整的冷臺(tái)上，這時(shí)微陣列包埋模具底部蠟液會(huì)很快變白凝固，同時(shí)組織柱也會(huì)被微陣列包埋模具底部的蠟液黏住，與此同時(shí)迅速用鑷子引流將蠟液灌注到微陣列包埋模具中，灌注完畢后在模具頂部加蓋包埋盒。為防止組織柱被蠟液沖倒，在灌注蠟液時(shí)需從微陣列模具的邊緣灌注并且動(dòng)作要輕柔，另外需要用鑷子引流。防止芯片蠟塊底部產(chǎn)生空洞，微陣列模具擺上冷臺(tái)后要立馬灌注，并且最好是選取微陣列模具的兩個(gè)對(duì)角，沿著兩個(gè)對(duì)角同時(shí)灌注，最上層蓋上包埋盒，等蠟塊冷卻后從微陣列模具中取出包埋好的蠟塊，微陣列蠟塊制作完畢(圖4)。

②③④

1.3.5切片 芯片蠟塊最好用新刀片在切片機(jī)上切片，避免產(chǎn)生刀痕，為提高切片得片率，盡量根據(jù)蠟塊平面調(diào)整切片角度，做到少修片和連續(xù)切片。裱片操作時(shí)，要輕，速度掌握適宜，否則容易造成組織陣列偏移。另外，還要注意控制水溫在45～50 ℃。

1.3.6HE和免疫組化染色 制作完畢的組織芯片切片在65 ℃干燥箱中烤片1 h，二甲苯脫蠟，梯度乙醇脫水，行HE染色或EDTA微波熱修復(fù)15 min，滴加PD-L1抗體(1 ∶100稀釋)，室溫孵育1 h，PBS充分洗3次，滴加免疫組化二抗，室溫孵育30 min，DAB顯色，蘇木精復(fù)染，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹(shù)膠封固，數(shù)字病理掃片儀采圖。

2 結(jié)果

2.1 芯片制作用該方法共制作肝癌和癌旁組織37個(gè)芯片蠟塊，合計(jì)2 200個(gè)組織位點(diǎn)，圓形芯片組織以規(guī)則的點(diǎn)陣方式整齊排列，芯片完整，無(wú)點(diǎn)陣移位現(xiàn)象。芯片中的組織芯點(diǎn)為所需要的組織形態(tài)學(xué)區(qū)域。所有列陣蠟塊均未見(jiàn)裂開(kāi)，蠟塊表層也沒(méi)有產(chǎn)生空洞，組織位點(diǎn)排列整齊，位點(diǎn)無(wú)丟失。組織柱與周?chē)d體蠟結(jié)合緊密形成完整蠟塊，芯片蠟塊上的組織芯點(diǎn)排列整齊在同一平面上。芯片蠟塊易切片，通過(guò)多次驗(yàn)證每個(gè)蠟塊均能切出至少300張完整的芯片切片。

2.2 芯片HE和免疫組化染色制備完畢抽取一套完整切片進(jìn)行HE和免疫組化染色。HE染色結(jié)果顯示：無(wú)刀痕和脫片現(xiàn)象，位點(diǎn)組織形態(tài)及細(xì)胞結(jié)構(gòu)均清晰可辨(圖5)。人膽管癌組織免疫組化PD-L1染色結(jié)果顯示：均勻表達(dá)在細(xì)胞膜，特異性強(qiáng)(圖6)。整個(gè)染色流程中切片無(wú)脫片，所有位點(diǎn)完好無(wú)損。以上結(jié)果證明，組織芯片制作技術(shù)成熟，已達(dá)到技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)。

圖5 肝癌組織芯片HE染色

圖6 膽管癌組織芯片免疫組化PD-L1染色，EnVision法

3 討論

文獻(xiàn)報(bào)道的組織芯片制作方法很多，根據(jù)是否需要受體蠟塊分為兩類，需要受體蠟塊制作的組織芯片[5-6]方法繁多，但步驟繁瑣，受體蠟塊的預(yù)制孔常與組織柱大小不一致，切片時(shí)會(huì)散片、掉片。另外組織柱植入受體蠟塊后需要烤蠟塊，對(duì)烤蠟塊的溫度和時(shí)間很難把控，溫度過(guò)高或時(shí)間過(guò)久會(huì)造成蠟塊坍塌，而溫度過(guò)低或時(shí)間太短會(huì)造成切片困難。

無(wú)需受體蠟塊的組織芯片制作時(shí)需要用膠水把組織柱黏附在包埋模具底部[7-9]，過(guò)夜晾干的過(guò)程操作復(fù)雜且有組織柱傾倒風(fēng)險(xiǎn)。

本課題組借鑒前人經(jīng)驗(yàn)，制作的組織芯片有以下優(yōu)勢(shì)；(1)無(wú)需受體蠟塊，操作簡(jiǎn)便；(2)包埋模具底部貼有微陣列圖利于組織柱擺列整齊；(3)微陣列圖利用蠟液黏附在包埋模具底部，組織柱亦通過(guò)蠟液的黏附性植入微陣列圖上，無(wú)需膠水，節(jié)約時(shí)間并且不易產(chǎn)生空洞；(4)在灌注蠟液時(shí)組織柱同樣受到蠟液的黏附不易傾倒；(5)包埋出的組織芯片易于切片，產(chǎn)片率高并且不易掉片。因此，該方法簡(jiǎn)單易行，成本低，易于推廣。