前列腺癌組織中Nanog、SOX2的表達(dá)及其臨床意義

李 梅，何桂芳，李明鳳，鄭露露，蔡永萍,，尹 玉,

目前，前列腺癌(prostate cancer, PCa)的發(fā)病率和病死率均較高，已成為男性泌尿生殖系統(tǒng)常見的惡性腫瘤[1]。由于我國(guó)人民生活方式日趨西化及醫(yī)療水平的提高，PCa的檢出率逐年增加。因此，識(shí)別新的診斷和治療方案研究PCa的發(fā)病機(jī)制意義重大。Nanog基因是腫瘤干細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄因子，在維持干細(xì)胞的多能分化性、調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖及非對(duì)稱分裂起關(guān)鍵作用[2]。Nanog在多種實(shí)體腫瘤的癌變和進(jìn)展中起主導(dǎo)作用，包括乳腺癌、胚胎性癌癥、精原細(xì)胞瘤和原位睪丸癌等；且Nanog表達(dá)增加與癌癥的臨床進(jìn)程有關(guān)[3]。在PCa干細(xì)胞研究中，Gong等[4]認(rèn)為Nanog作為維持干細(xì)胞多能性的關(guān)鍵分子，是分離和鑒定PCa干細(xì)胞的標(biāo)志物；Jeter等[5]也提出Nanog可以促進(jìn)PCa的干細(xì)胞特性，可促進(jìn)去勢(shì)抵抗性PCa細(xì)胞的再生。SOX2是SOX基因家族的重要成員，最近的研究表明，SOX2與轉(zhuǎn)移性PCa的發(fā)生、發(fā)展和預(yù)后不良有關(guān)。同時(shí)SOX2與Nanog協(xié)同對(duì)維持胚胎干細(xì)胞多能性以及特定組織成體干細(xì)胞自我更新的能力具有關(guān)鍵作用。本文收集PCa組織和良性前列腺增生(benign prostatic hyperplasia, BPH)組織，檢測(cè)Nanog和SOX2的表達(dá)，探討兩者的相關(guān)性及其與PCa發(fā)生、發(fā)展的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 材料收集2015年1月～2016年12月安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院行活檢或手術(shù)切除的前列腺標(biāo)本127例，其中62例BPH ，年齡56～86歲，平均69.89歲；65例PCa，年齡53～88歲，平均69.25歲。所有患者均未接受放、化療或免疫治療，均經(jīng)兩名資深病理醫(yī)師采用雙盲法判讀。PCa組織按Gleason評(píng)分以主要分化程度和次要分化程度分別評(píng)分，兩項(xiàng)評(píng)分相加≤4分為高分化組，5～7分為中分化組，8～10分為低分化組。

1.2 試劑與方法Nanog 兔多克隆抗體(濃度1 ∶400、14295-1-AP)、SOX2 兔多克隆抗體(濃度1 ∶400，11064-1-AP)及免疫組化MaxVision 試劑盒，均購(gòu)自北京中杉金橋公司。石蠟包埋組織連續(xù)切片，厚4 μm，免疫組化采用MaxVision 法染色，具體操作步驟嚴(yán)格按試劑盒說明書進(jìn)行，用已知陽(yáng)性組織作為陽(yáng)性對(duì)照，以PBS代替一抗作為陰性對(duì)照。

1.3 結(jié)果判斷Nanog和SOX2主要表達(dá)于細(xì)胞核或細(xì)胞核/質(zhì)。(1)根據(jù)細(xì)胞染色強(qiáng)度評(píng)分：無(wú)陽(yáng)性著色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。(2)根據(jù)陽(yáng)性細(xì)胞染色百分比評(píng)分：≤25%為1分，26%～50%為2分，51%～75%為3分，>75%為4分。將兩項(xiàng)得分結(jié)果相乘，采用半定量評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)判斷，<6分為低表達(dá)，≥6分為高表達(dá)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析應(yīng)用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，采用χ2檢驗(yàn)分析兩組樣本間的表達(dá)率差異，采用Spearman等級(jí)相關(guān)分析進(jìn)行兩者之間的相關(guān)性檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 BPH和PCa組織中Nanog的表達(dá)Nanog陽(yáng)性主要定位于正常腺體的上皮細(xì)胞核和癌變細(xì)胞核或細(xì)胞核/質(zhì)。Nanog在62例BPH組中有12例呈高表達(dá)，陽(yáng)性率為19.4%；在65例PCa組中有26例呈高表達(dá)，陽(yáng)性率為40.0%，兩組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=6.450，P<0.05，表1，圖1、2)。Nanog在21例轉(zhuǎn)移性PCa組中有17例呈高表達(dá)，陽(yáng)性率為81.0%；在44例非轉(zhuǎn)移性PCa組中有9例呈高表達(dá)，陽(yáng)性率為20.5%；兩組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=8.354，P<0.05，表2)。

表1 良性前列腺增生及前列腺癌組織中Nanog和 SOX2的表達(dá)

表2 非轉(zhuǎn)移性及轉(zhuǎn)移性前列腺癌組織中Nanog和 SOX2的表達(dá)

2.2 BPH和PCa組織中SOX2的表達(dá)SOX2陽(yáng)性主要定位于正常腺體的上皮細(xì)胞核和癌變細(xì)胞核或細(xì)胞核/質(zhì)。 SOX2在62例BPH組中有11例呈高表達(dá)，陽(yáng)性率為17.7%；在65例PCa組中有24例呈高表達(dá)，陽(yáng)性率為36.9%；兩組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=5.848，P<0.05，表1，圖3、4)。SOX2在21例轉(zhuǎn)移性PCa組中有14例呈高表達(dá)，陽(yáng)性率為66.7%；在44例非轉(zhuǎn)移性PCa組中有10例呈高表達(dá)，陽(yáng)性率為22.7%，兩組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=4.976，P<0.05，表2)。

①②③④

2.3 PCa中Nanog、SOX2表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系PCa組中Nanog和SOX2表達(dá)均與TNM分期、有無(wú)淋巴結(jié)和骨轉(zhuǎn)移相關(guān)(P<0.05)；與患者年齡、術(shù)前PSA值均無(wú)關(guān)(P>0.05)。與Nanog不同的是，SOX2表達(dá)高低與Gleason評(píng)分無(wú)關(guān)(P>0.05，表3)。

表3 前列腺癌中 Nanog、SOX2表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系[n(%)]

2.4 PCa中Nanog、SOX2表達(dá)的相關(guān)性PCa組織中Nanog、SOX2同時(shí)高表達(dá)18例，同時(shí)低表達(dá)33例；提示兩者的表達(dá)呈正相關(guān)性(rs=0.297，P=0.003，表4)。

表4 前列腺癌中Nanog和SOX2表達(dá)的相關(guān)性

3 討論

PCa的早期階段行雄激素剝奪治療被認(rèn)為是這一時(shí)期患者的有效治療手段。由于PCa具有高度異質(zhì)性和多灶性的生物學(xué)特性，治療一段時(shí)間后多數(shù)患者開始對(duì)雄激素剝奪出現(xiàn)抵抗，將發(fā)展成為去勢(shì)抵抗性前列腺癌(castration resistant prostate cancer, CRPC)。CRPC變異體是神經(jīng)內(nèi)分泌性前列腺癌(neuroendocrine prostate cancer, NEPC)，具有高度侵襲性且療效較差[6-7]。目前尋找雄激素剝奪治療后的耐藥機(jī)制及這一階段有代表性的標(biāo)志物已引起學(xué)者們的極大關(guān)注。最近癌癥干細(xì)胞(cancer stem cell, CSC)理論增加了對(duì)癌癥發(fā)展的理解，據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道CSC在不同組織的多種實(shí)體瘤中發(fā)生[8]，且在PCa惡性程度和腫瘤內(nèi)異質(zhì)性形成中有重要作用[9]。腫瘤干細(xì)胞理論認(rèn)為PCa組織具有不均一性，激素治療可殺死大部分癌細(xì)胞，但是這些存活下來的具有致瘤潛力的小部分癌細(xì)胞又可隨時(shí)間的推移而生長(zhǎng)，為PCa經(jīng)過激素治療后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移現(xiàn)象提供了依據(jù)[10]。為了延長(zhǎng)PCa患者的生存期，在預(yù)測(cè)轉(zhuǎn)移性PCa可能的致病因素或治療靶點(diǎn)時(shí)，本實(shí)驗(yàn)收集具有干細(xì)胞特性的Nanog、SOX2蛋白作為分析對(duì)象，結(jié)果顯示在轉(zhuǎn)移性PCa組織中，Nanog、SOX2蛋白的表達(dá)遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于非轉(zhuǎn)移性PCa組和BPH組。

最近研究表明，SOX2與轉(zhuǎn)移性PCa患者的病情發(fā)展和預(yù)后不良有關(guān)。在PCa早期SOX2表達(dá)較低，但隨著Gleason評(píng)分的增加而顯著增加[11]。此外，SOX2在大多數(shù)淋巴結(jié)陽(yáng)性PCa組織中表達(dá)[12]，而晚期PCa中SOX2表達(dá)增加與不良生存能力密切相關(guān)[11]，與本組結(jié)果一致，SOX2在轉(zhuǎn)移性PCa組織中表達(dá)較高。Nanog在多種惡性腫瘤中具有自我更新和多能性，在前列腺腺癌細(xì)胞中也呈陽(yáng)性反應(yīng)[13]。在人類前列腺腺癌細(xì)胞中已觀察到Nanog、OCT4、SOX、CD44、NESTIN的表達(dá)[14]，表明CSC和祖細(xì)胞在PCa發(fā)生、發(fā)展中有重要作用。同時(shí)，Nanog和SOX2在預(yù)測(cè)PCa病程中的價(jià)值報(bào)道較少。本組檢測(cè)CSC標(biāo)志物Nanog和SOX2的表達(dá)，結(jié)果表明Nanog和SOX2在PCa中的表達(dá)明顯高于BPH，且與TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、骨轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)。

體外實(shí)驗(yàn)顯示Nanog與自我更新能力和集落形成活性等惡性指標(biāo)有關(guān)[15]，特別在雄激素敏感性和CRPC細(xì)胞系中，Nanog過表達(dá)促進(jìn)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的移植瘤形成。文獻(xiàn)報(bào)道80%的PCa中存在Nanog mRNA表達(dá)[16]。同時(shí)，在惡性轉(zhuǎn)化細(xì)胞中Nanog基因的水平最高，而BPH中未檢測(cè)到，表明Nanog可能參與PCa的發(fā)生[17]。本組實(shí)驗(yàn)中通過對(duì) Nanog蛋白檢測(cè)，顯示 Nanog蛋白的陽(yáng)性率在PCa組織尤其是轉(zhuǎn)移性PCa組織中明顯高于非轉(zhuǎn)移性PCa組織，提示Nanog蛋白表達(dá)可能與PCa的發(fā)生、發(fā)展相關(guān)。

SOX2是屬于SOXB1組的SOX基因家族成員。SOX2是胚胎發(fā)育的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，通常被認(rèn)為是維持胚胎干細(xì)胞的多能性和自我更新特性的關(guān)鍵調(diào)節(jié)劑[18]。有文獻(xiàn)報(bào)道從早期PCa的特異性基因表達(dá)下降就伴隨SOX2表達(dá)，一直持續(xù)到末期NEPC[19]，提示SOX2在驅(qū)動(dòng)NEPC分化中潛在的關(guān)鍵作用。張振宇等[20]分別采用免疫組化、Western blot法及RT-PCR檢測(cè)SOX2在PCa中表達(dá)均明顯高于BPH，且與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)，與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。本組結(jié)果表明，SOX2在PCa中尤其是轉(zhuǎn)移性PCa中表達(dá)升高，與TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、骨轉(zhuǎn)移有關(guān)。

本組中Nanog和SOX2在PCa中的表達(dá)明顯高于BPH，隨臨床分期和病理分級(jí)增加，其陽(yáng)性率逐漸增高。此外，Nanog陽(yáng)性率隨Gleason評(píng)分的增加而增高，與相關(guān)報(bào)道結(jié)果一致，且兩者在PCa中的表達(dá)呈正相關(guān)；提示在PCa發(fā)生、發(fā)展過程中Nanog和SOX2可能同時(shí)被調(diào)控，兩者之間可能有協(xié)同關(guān)系影響PCa的進(jìn)展。因此，作者猜想Nanog和SOX2在PCa的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要作用，聯(lián)合檢測(cè)Nanog和SOX2有望成為診斷PCa新的分子標(biāo)志物，為臨床治療提供新思路。