慢性肺部炎癥合并肺炎支原體肺炎小鼠模型的建立*

蒙艷麗 徐慧星 王曉溪 宋亞娟 蔡蕭君 王偉明

(黑龍江省中醫(yī)藥科學(xué)院， 哈爾濱 150036)

肺炎支原體肺炎(MPP)屬于間質(zhì)性肺炎，是肺炎支原體(MP)引起的以肺間質(zhì)纖維結(jié)締組織增生為主要病理改變的呼吸道感染性肺炎。慢性肺部疾病和免疫力低下人群對(duì)肺炎支原體易感，MPP占成年人肺炎的20%，兒童可達(dá)到40%[1]。肺炎支原體經(jīng)呼吸道侵入后主要侵犯細(xì)支氣管和支氣管周圍組織小葉間和肺泡間隔的結(jié)締組織，慢性肺部炎癥導(dǎo)致病變反復(fù)遷延，細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)的反復(fù)破壞、修復(fù)、重建和過度沉積而致間質(zhì)纖維化，病理改變有間質(zhì)性病變改變，多見斑片影、片狀密度增高影，雙肺均可受累[2]。

考慮到臨床肺炎支原體易感于慢性支氣管炎癥患者，結(jié)合臨床病因，建立慢性肺部炎癥合并肺炎支原體肺炎實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型[3]。首先使用煙霧對(duì)支氣管黏膜進(jìn)行刺激，經(jīng)過反復(fù)刺激呼吸道，黏膜和纖毛損害，建立慢性肺部炎癥模型[4-6]。損害的黏膜和纖毛易于肺炎支原體入侵，再通過給小鼠滴鼻肺炎支原體，建立肺炎支原體肺炎模型[7-8]。兩種模型結(jié)合將建立一種新型肺部慢性炎癥合并肺炎支原體肺炎模型，為后續(xù)的中藥制劑芩百清肺濃縮丸等療效提高和深度開發(fā)提供理論和實(shí)驗(yàn)根據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌株

肺炎支原體標(biāo)準(zhǔn)株(ATCC 15531)購自American Type Culture Collection，培養(yǎng)在胎牛血清中24 h后，放于含20%胎牛血清，10%酵母的PPLO培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，每隔7 d傳代一次。

1.2 動(dòng)物

100只BALB/c小鼠，體質(zhì)量18～22 g，雌雄各半，北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供，許可證號(hào)SCXK(京)2015-0001。

1.3 主要試劑

PPLO 培養(yǎng)基 (Becton，Dickinson and Company，USA);酵母(安琪酵母股份有限公司);胎牛血清(Gibco，USA);蘇木素、伊紅染液(南京建成公司);Masson 三色染色試劑盒(Solarbio);TRIzol試劑(美國Invitrogen);One-step RT-PCR kit(Promega);肺炎支原體核酸定量檢測(cè)試劑盒(中國達(dá)安基因)。

1.4 主要儀器設(shè)備

KD-TS3A自動(dòng)組織脫水機(jī)(浙江金華科迪儀器設(shè)備有限公司)；KD-BM生物組織包埋機(jī)(浙江金華科迪儀器設(shè)備有限公司)；RM2235組織切片機(jī)(德國萊卡)；BX4-1生物顯微鏡(OLYMPUS公司)；Infinite M200 型多功能酶標(biāo)儀(瑞士TECAN公司)；9 600 熒光定量PCR儀(杭州博日有限公司)；MDF-382E -80 ℃低溫冰箱(日本SANYO公司)；ST-16R型低溫高速離心機(jī)(美國Thermo Fisher Scientific公司)；LXJ-n型普通低速離心機(jī)(上海醫(yī)用分析儀器廠)20 μL、200 μL、1 000 μL微量加樣器(Eppendoff 公司)；BP211D分析天平(Sartorius公司)。

1.5 方法

1.5.1動(dòng)物模型建立：30只20～22 g的BALB/c小鼠，隨機(jī)分為3組，煙熏并感染組(煙熏并肺炎支原體感染)10只，感染組(肺炎支原體感染)10只，空白組10只。煙熏并感染組小鼠使用國家發(fā)明專利儀器嚙齒類動(dòng)物呼吸系統(tǒng)暴露染毒裝置煙熏10 d，每天2次，每次30 min。10 d后煙熏并感染組和感染組小鼠乙醚麻醉，移液槍吸取20 μL 106CCU/mL肺炎支原體液，抓取小鼠通過小鼠自然吸氣鼻吸入液體，連續(xù)3 d。空白組則吸入同體積的MP液體培養(yǎng)基。結(jié)束后將小鼠斷髓處死，分離肺組織，左肺組織10%甲醛固定，用于HE染色、右肺組織進(jìn)行支原體檢測(cè)Realtime PCR實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.5.2Realtime PCR：應(yīng)用肺炎支原體核酸定量檢測(cè)試劑盒進(jìn)行肺炎支原體基因拷貝數(shù)測(cè)定，參照張?jiān)饺A和鄭秀青文獻(xiàn)優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件[9]。各組肺組織勻漿后，吸取10 uL勻漿液，再加入等量DNA 提取液充分混勻，在100 ℃恒溫處理10 min；12 000 r/min離心5 min，取上清備用。取PCR 反應(yīng)管，加入處理后的樣品、陰性質(zhì)控品、MP弱陽性、MP強(qiáng)陽性質(zhì)控品及不同濃度的MP陽性定量參考品上清液2 μL，8 000 r/min離心數(shù)秒，放入PCR儀器樣品槽。按對(duì)應(yīng)順序設(shè)置位置，循環(huán)條件設(shè)置：93 ℃ 2 min； 93 ℃ 45 s，55 ℃ 60 s，10個(gè)循環(huán)；93 ℃ 30 s,55 ℃ 45 s，30個(gè)循環(huán)。有效檢測(cè)劑量為>103基因拷貝/mL。

1.5.3HE染色：檢測(cè)組織結(jié)構(gòu)改變的最常規(guī)方法。肺組織放于10%甲醛中固定48 h以上，脫水、透明、包埋、切片、脫蠟、水化后，用蘇木素和伊紅染色，脫水，中性樹膠進(jìn)行封片。肺組織切片HE染色，細(xì)胞核被染成藍(lán)色，細(xì)胞質(zhì)、結(jié)締組織和肌肉等均被染成不同程度的紅色，在光學(xué)顯微鏡下觀察肺組織病理的變化。病理評(píng)分為0(沒有改變)～16(最大改變)，按毛細(xì)支氣管炎、血管周圍炎、間質(zhì)性肺炎和肺泡炎從輕到重定為1～4分。

1.5.4Masson染色：Masson染色是結(jié)締組織染色最經(jīng)典的一種方法，主要用于顯示組織中纖維。肺組織放于10%甲醛中固定48 h以上，脫水、透明、包埋、石蠟切片脫蠟，蘇木精染液5～10 min，充分水洗，鹽酸酒精分化，Masson 麗春紅酸性復(fù)紅液5～10 min，2%冰醋酸水溶液浸洗片刻，1%磷鉬酸水溶液分化3～5 min，直接用苯胺藍(lán)液染5 min，以0.2%冰醋酸水溶液浸洗片刻，95%酒精、無水酒精、二甲苯透明、中性樹膠封固。

1.6 統(tǒng)計(jì)方法

統(tǒng)計(jì)分析為單因素方差分析方法分析組間差異，相關(guān)數(shù)據(jù)用“均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，顯著差異P<0.05。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，每次實(shí)驗(yàn)取平均值，三次重復(fù)平均值結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果

2.1 肺炎支原體基因拷貝數(shù)測(cè)定

實(shí)驗(yàn)使用肺炎支原體核酸定量檢測(cè)試劑盒，檢測(cè)肺上清液中的肺炎支原體DNA,見表1。大于103基因拷貝/mL為有效檢測(cè)劑量，重復(fù)3次實(shí)驗(yàn)PCR結(jié)果統(tǒng)計(jì)看出，煙熏并感染組小鼠肺炎支原體感染率為93%，高于感染組77%；空白組小鼠感染率為0%，見圖1。結(jié)果證明與空白組比較，煙熏并感染組和感染組均有顯著性差異，P<0.05。煙熏并感染組優(yōu)于感染組。

2.2 肺組織病理檢查

HE染色顯示空白組小鼠肺組織形態(tài)無異常改變，結(jié)構(gòu)清楚，肺泡腔完整，排列規(guī)則，無炎細(xì)胞浸潤。感染組小鼠肺組織上皮細(xì)胞脫落，支氣管間隙增厚，肺泡壁毛細(xì)血管中有過量的紅細(xì)胞，肺泡壁與間隔有大量炎性細(xì)胞浸潤，肺泡壁塌陷，可發(fā)生灶性肺不張。煙熏并感染組小鼠肺組織細(xì)胞形態(tài)發(fā)生明顯變化，表現(xiàn)為肺泡壁明顯增厚，塌陷嚴(yán)重，肺泡腔排列不規(guī)則，部分肺泡腔閉塞使肺組織呈片狀密度增高的致密結(jié)構(gòu)，與正常肺組織的分界非常明顯，有些肺組織充斥大量紅細(xì)胞，見圖2A。

表1 空白組、感染組、煙熏并感染組小鼠肺炎支原體基因拷貝數(shù)

圖1 空白組、感染組、煙熏并感染組小鼠肺炎支原體感染率

圖2 空白組、感染組、煙熏并感染組小鼠病理HE染色及評(píng)分結(jié)果 (×200)

從3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)病理評(píng)分可知，煙熏并感染組在毛細(xì)支氣管炎、血管周圍炎、間質(zhì)性肺炎和肺泡炎等癥狀上較感染組損傷嚴(yán)重。與空白組比較，煙熏并感染組和感染組均有顯著差異，見圖2B。(P<0.05。)

2.3 肺組織纖維化實(shí)驗(yàn)

小鼠肺組織Masson染色表明，空白組小鼠肺組織無或極少有膠原纖維形成，肺結(jié)構(gòu)清晰可見，排列規(guī)則；感染組小鼠肺組織的小葉間質(zhì)以及血管周圍、細(xì)支氣管周圍有大量藍(lán)染的膠原纖維，呈現(xiàn)細(xì)絲狀；煙熏并感染組小鼠藍(lán)色區(qū)域即膠原纖維明顯增多呈現(xiàn)帶狀，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。見圖3。

圖3 空白組、感染組、煙熏并感染組小鼠病理Masson染色結(jié)果 (×200)

3 討論

藥物臨床前研究是新藥研發(fā)的重要階段,是評(píng)價(jià)藥物有效性和安全性的基礎(chǔ)工作,臨床前研究結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性,是保證藥物研發(fā)成功和降低臨床研究風(fēng)險(xiǎn)的重要措施。藥物的臨床前研究主要是指使用非人類模式生物或?qū)嶒?yàn)動(dòng)物進(jìn)行的研究,通過不同的動(dòng)物模型和實(shí)驗(yàn)方法,評(píng)價(jià)藥物的藥效。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型是研究的最常用的方法，能為我們解析重大人類疾病機(jī)理,發(fā)現(xiàn)新藥作用靶點(diǎn)和新型藥物的創(chuàng)制。目前沒有慢性肺部炎癥合并肺炎支原體肺炎模型建立方法的報(bào)道，參照以往肺損傷動(dòng)物模型[10]及鼻滴入感染方法建立肺炎支原體肺炎動(dòng)物模型[11-12]，考慮到肺炎支原體的感染特點(diǎn)即易感于慢性肺部炎癥人群[13]，本論文改進(jìn)動(dòng)物造模方法，模擬臨床病因建立慢性肺部炎癥合并肺炎支原體肺炎模型[14-15]。

煙霧對(duì)支氣管黏膜反復(fù)刺激，損害黏膜和纖毛，易于肺炎支原體黏附，加重肺炎支原體肺炎。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，支原體檢測(cè)試劑盒檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)煙熏并感染組小鼠的支原體感染率明顯高于正常感染組；通過HE染色，煙熏并感染組小鼠肺組織病理圖片的細(xì)胞狀態(tài)、輪廓、炎癥變化都要比正常感染組的嚴(yán)重，表明煙熏并感染組小鼠的感染明顯加重。Masson染色圖片顯示，煙熏并感染組小鼠膠原纖維大量增加，呈現(xiàn)寬帶狀或片狀，其病變程度明顯高于感染組。實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明，煙熏并感染組小鼠與感染組小鼠比較，肺組織結(jié)構(gòu)損壞嚴(yán)重，間質(zhì)膠原纖維生成更加明顯，肺炎支原體更加易感，這可能是慢性肺部炎癥患者易于合并肺炎支原體肺炎，并反復(fù)遷延不愈原因。