PTS預處理對大鼠心肌缺血再灌注損傷保護效果及機制研究

王 靜 洪炳哲 張習敬 任海勤 葛魯敏

(1.貴州盤江投資控股(集團)有限公司總醫(yī)院，盤州市 553536)(2.齊齊哈爾醫(yī)學院附屬第三醫(yī)院，齊齊哈爾 161000)

心肌缺血再灌注損傷(MIRI)指心肌組織經過一段時間缺血，血液恢復灌注后導致再灌注區(qū)心肌細胞出現(xiàn)功能障礙及進一步損傷的現(xiàn)象。這是心臟手術、器官移植及心臟缺血性疾病中常見的損傷[1]。人參，系五加科人參屬植物，作為我國傳統(tǒng)寶貴的藥材，具有調節(jié)免疫，改善循環(huán)，抗氧化，抗炎等作用，不僅用于保健養(yǎng)生方面，還對多種疾病具有預防作用[2]。人參性溫，味甘，微苦，其主要有效成分為人參皂苷。迄今為止，大概有40余種皂苷成分被分離出來，可分為3類，人參二醇皂苷、人參三醇皂苷、齊墩果烷皂苷。其中人參三醇皂苷具有心臟保護作用，已用于心血管系統(tǒng)等方面的研究[3-4]。本研究選用Wistar大鼠作為研究對象，用人參三醇皂苷預處理后，進行心肌缺血再灌注損傷模型的建立，觀察人參三醇皂苷對心肌缺血再灌注大鼠心肌的保護作用。

1 材料與方法

1.1 動物來源

選用健康SPF級Wistar大鼠120只，雌雄各半，體質量為(220±20)g，由中南大學湘雅醫(yī)學院實驗動物中心提供，動物合格證號為：SCXK(湘)2015-0412。大鼠于溫度為(25±2) ℃、相對濕度為30%～60%條件的動物房中飼養(yǎng)。適應性至少喂養(yǎng)1周后進行正式試驗。本實驗嚴格按照3R原則進行，且遵守醫(yī)院動物倫理委員會規(guī)則。

1.2 試劑與設備

人參三醇皂苷(PTS)，由中南大學天然藥物化學教研室提供；生脈注射液，四川川大華西藥業(yè)股份有限公司，批號17081613；PCR試劑盒，購于美國Sigma-Aldrich公司；ELISA試劑盒，如腫瘤壞死因子-α(TNF-α)和白細胞介素-6(IL-6)等購于深圳達科有限公司；肌酸激酶同工酶(CK-MB)試劑盒購于南京生物工程研究所。JEM-1400EX透射電鏡：日本電子株式會社；DG3022 A酶標儀：北京倍肯醫(yī)療；7020型全自動生化分析儀：日本日立公司。

1.3 動物分組

大鼠按隨機原則分成6組，每組20只。具體分組如下：假手術組(生理鹽水2 mL/kg體質量)、模型組(生理鹽水2 mL/kg體質量)、PTS低劑量組(人參三醇皂苷25 mg/kg)、PTS中劑量組(人參三醇皂苷45 mg/kg)、PTS高劑量組(人參三醇皂苷90 mg/kg)、陽性藥組(生脈注射液450 mg/kg)。各組大鼠于心肌缺血再灌注損傷前，即造模前，連續(xù)7 d腹腔注射給藥。

1.4 大鼠心肌缺血/再灌注動物模型的建立

各組大鼠連續(xù)腹腔給藥7 d，于末次給藥1 h后進行造模手術。將大鼠麻醉后固定四肢，將其綁定到心電圖儀上，記錄正常心電圖。將大鼠胸部去毛后，碘伏消毒，用手術刀沿胸左側3～4肋間打開胸腔，剪開心包，擠出心臟，從冠狀動脈左前降支穿線結扎，送回心臟，關閉胸腔，記錄心電圖變化，結扎成功的標志為：ST段下降或抬高0.1 mV。結扎缺血30 min后，開胸松解結扎線實現(xiàn)心肌再灌注，記錄心電圖變化情況。荷包縫合，再灌注24 h后取材料測定各項指標。假手術組僅進行冠脈穿線不進行結扎，其余各組均進行穿線結扎。

1.5 觀察指標

1.5.1心電圖ST段的變化：各組大鼠按照實驗分組給藥后，進行造模手術。將大鼠麻醉后固定在溫控手術臺上，于四肢皮下插入針型電極，監(jiān)測心電，觀察結扎缺血5、30 min時及松解縫合線實現(xiàn)再灌注后5、30、60 min時心電圖的變化。

1.5.2血清指標的測定：大鼠再灌注24 h后經腹動脈取血5 mL，4 000 r/min離心15 min后，取上清液，檢測血清中CK-MB、TNF-α和IL-6水平。

1.5.3心肌梗死面積的測定：大鼠取血后迅速取出大鼠心臟，用氯化鈉注射液洗凈后剪去右心室。用濾紙將水吸干后左心室稱質量。沿心尖斷面切厚度相等的4～5片，置于0.1%的氯化硝基四氮唑藍溶液中，染色15 min，取出固定，用數碼相機照相。ImagePro Plus 6.0圖像軟件評價分析心肌梗死面積比例(正常心肌組織為藍色，梗死面積呈灰白色；心肌梗死面積比例=梗死區(qū)面積/左心總面積)。

1.5.4心肌組織病理學檢查：心肌再灌注24 h后，在結扎線附近，取缺血中央區(qū)域部分心肌組織，置于4%甲醛溶液中固定，脫水，常規(guī)切片，進行HE染色。用中性樹膠封片，于光鏡下觀察心肌組織病理學改變。

心肌再灌注24 h后，沿心肌纖維方向取一塊梗死區(qū)域的心肌組織，置于4 ℃，4%戊二醛中固定。包埋劑包埋成塊，超薄切片，雙染色等，按常規(guī)透射電鏡要求制備樣品。用電子顯微鏡觀察心肌細胞超微結構改變。

1.5.5PCR檢測mRNA：采用總RNA提取試劑盒提取總RNA。提取后建立相應逆轉錄和擴增反應條件，預變性：94 ℃，2 min；變性：94 ℃，30 s；退火：49.3 ℃，30 s；延伸：72 ℃，2 min，循環(huán)33次，最后再72 ℃延伸5 min。引物序列：Bcl-2，上游引物5’-GCGCAGATCCACCATTGCTAT-3’，下游引物5’-GCTCCGTTGCAGCCTACT TCCG-3’；Bax，上游引物5’-GTCTCTTCTACTCATCGTGC-3’，下游引物5’-AGG CGTCTATCAACTGAAAG-3’；β-actin為內參，上游引物：5’-TGCTCGCCGG TATGTAGGCCTG-3’，下游引物：5’-TCCGTCGCCCTCATCCTGAGGTG-3’。

1.6 統(tǒng)計方法

采用SPSS18.0統(tǒng)計軟件分析，采用t檢驗進行組間比較，以P<0.05，P<0.01為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 心電圖ST段的變化

心電監(jiān)測結果見表1。模型組大鼠缺血5、30 min及再灌注5、30、60 min時，心電圖ST段顯著高于假手術組(P<0.01)。與模型組比較，陽性藥組大鼠缺血5、30 min及再灌注5、30、60 min時，均能顯著抑制ST段抬高(P<0.05、0.01)；PTS高劑量組大鼠缺血及再灌注后各時間點，同樣能顯著抑制ST段抬高(P<0.05、0.01)；PTS中劑量組大鼠缺血5、30 min及再灌注后30 min時，能顯著抑制ST段抬高(P<0.05)；而PTS低劑量組大鼠心電圖ST段無明顯變化。

2.2 血清CK-MB、IL-6、TNF-a水平

模型組大鼠血清CK-MB、IL-6、TNF-α水平較假手術組明顯增加，差異顯著(P< 0.05、0.01)。與模型組比較，陽性藥組大鼠血清各炎癥因子水平顯著降低(P< 0.05、0.01)；PTS高劑量組同樣能顯著抑制大鼠血清各炎癥因子水平(P<0.05、0.01)；PTS中劑量組能顯著抑制大鼠血清CK-MB、TNF-α水平(P<0.05)；PTS低劑量組大鼠血清水平變化不明顯，見表2。

表1 各組大鼠心電圖ST段變化

表2 各組大鼠血清生化指標及心肌梗死面積

2.3 心肌梗死面積比例

模型組大鼠心肌梗死面積比例達到21.97%。與模型組相比，陽性藥組大鼠心肌梗死面積比例顯著降低(P<0.05)；PTS中劑量及高劑量組大鼠心肌梗死面積比例也顯著降低(P<0.05、0.01)；而PTS低劑量組心肌梗死面積比例無顯著變化。

2.4 心肌病理形態(tài)

大鼠心肌組織進行石蠟切片、HE染色，結果見圖1。假手術組心肌細胞結構形態(tài)完整，纖維排列規(guī)則，膜正常，組織間隙正常。模型組心肌間質出現(xiàn)明顯水腫，有大量心肌細胞壞死，中性粒細胞大量浸潤，胞漿紅染，核消失，肌纖維被破壞。陽性藥組與模型組比較，有局部少量血管擴張充血，心肌細胞排列較正常，炎性細胞浸潤明顯減少。PTS高劑量組和PTS中劑量組，與模型組比較，心肌間質水腫明顯減輕，心肌細胞形態(tài)基本正常，炎性細胞浸潤程度明顯減少。而PTS低劑量組與模型組比較，仍明顯可見心肌細胞小片壞死，炎性細胞浸潤。

2.5 心肌細胞超微結構

大鼠電鏡下心肌組織的變化見圖2。假手術組心肌細胞結構完整，核仁清楚，細胞核呈長橢圓型，染色質分布均勻；胞質內肌節(jié)清晰；線粒體形態(tài)正常；未見炎性細胞浸潤和膠原纖維沉積。模型組心肌細胞超微結構明顯受損：肌膜破裂，肌絲排列紊亂，染色質出現(xiàn)凝聚成塊，區(qū)域性膠原纖維沉積。陽性藥組：心肌細胞結構基本完整，線粒體輕微腫脹。PTS高劑量組和PTS中劑量組，與模型組比較，心肌細胞受損明顯減輕，線粒體基本完整，細胞核異常程度減少，核仁較清楚，肌絲排列較整齊。PTS低劑量組與模型組比較沒有明顯改善，心肌細胞受損，細胞核染色塊凝聚，血管內皮細胞腫脹等。

2.6 Bcl-2和Bax基因的表達

與假手術組相比，模型組Bcl-2和Bax mRNA水平明顯升高(P<0.05)。與模型組比較，陽性藥組、PTS高劑量組和PTS中劑量組大鼠Bcl-2 mRNA水平明顯升高(P<0.05)，Bax mRNA水平明顯降低(P<0.05)。PTS低劑量組與模型組比較差異不明顯，結果見圖3。

圖1 大鼠心肌病理形態(tài)變化 (×200)

圖2 大鼠心肌細胞超微結構的變化 (×5000)

圖3 Bcl-2和Bax mRNA水平變化

3 討論

近年來，冠狀動脈粥樣硬化性心臟病發(fā)病率逐年增高，心肌梗死(MI)成為人類健康的第一殺手[5]。心肌梗死是冠狀動脈的血流急劇減少，而導致大量心肌壞死。治療最關鍵方法是盡快恢復血流再灌注，但有研究認為缺血再灌注的二次損傷比心肌梗死還要嚴重，可導致嚴重的心律失常[6]。因此怎樣預防心肌缺血再灌注損傷變得尤為重要。

本研究參考相關文獻，選擇大鼠心肌缺血30 min，再灌注24 h時間點進行造模[7]。結果表明，大鼠缺血5、30 min及再灌注后5、30、60 min時，模型組比假手術組心電圖ST段明顯抬高(P<0.01)。心電圖ST段改變與心肌缺血再灌注損傷緊密相關。經HE染色及透射電鏡下觀察模型組的心臟組織結構發(fā)現(xiàn)確有心肌缺血壞死等改變，且血清各炎癥因子水平顯著升高，說明造模成功。經PTS中劑量及高劑量組預處理的大鼠心肌細胞受損明顯減輕，細胞核異常程度減少，未見明顯炎癥細胞浸潤，且心肌梗死面積顯著低于模型組大鼠。而PTS低劑量組，可能是因為藥物濃度過小原因，心肌受損情況沒有較大改善。這說明，PTS對心肌缺血再灌注損傷有保護作用，作用強弱與劑量相關。

MIRI是一個復雜的病理生理過程，涉及心肌細胞凋亡、炎癥反應、冠狀血管內皮損傷、中性粒細胞浸潤等方面[8-9]。陳濤等[10]報道炎癥反應與MIRI關系密切，發(fā)生MIRI時，血管內皮細胞將釋放大量炎癥因子，如IL-6、TNF-a等；而炎癥因子會進一步促進細胞因子級聯(lián)反應，誘導細胞間粘附分子的表達，加重心肌損傷。宋維鵬等報道[11]在心臟衰竭患者血清IL-6、TNF-a水平明顯升高，且隨著患者病情的惡化，二者水平進一步增加。血清心肌酶譜，尤其是CK-MB濃度是臨床上對心肌炎以及心肌梗死等心肌損傷性疾病的主要判定指標。本實驗結果表明，一定劑量的PTS能降低大鼠血清CK-MB、IL-6及TNF-α水平，提示，PTS對心肌缺血再灌注損傷的保護作用可能是通過降低心肌組織的炎性反應而實現(xiàn)的。

細胞凋亡是MIRI發(fā)病機制的重要環(huán)節(jié)之一，凋亡的程度決定了MIRI損傷的嚴重程度。細胞凋亡基因可分為二類，第一類為前凋亡蛋白，有誘導細胞凋亡的作用，如Bax等；第二類為抗凋亡蛋白，有抗凋亡和保護細胞生存作用，通過與前凋亡蛋白結合而發(fā)生作用，如Bcl-2等，當Bcl-2與Bax結合后，可抑制Bax誘導凋亡作用[12-13]。正常生理情況下，Bcl-2與Bax水平處于動態(tài)平衡中，當機體受到外部影響，Bcl-2與Bax平衡狀態(tài)被打破，Bax大量分泌，而體內Bcl-2不能完全結合Bax，導致細胞凋亡。本實驗結果表明，PTS高劑量組和PTS中劑量組大鼠Bcl-2 mRNA水平明顯升高(P< 0.05)，而Bax mRNA水平明顯降低(P< 0.05)。這提示：PTS能調控心肌凋亡和抗凋亡關鍵酶，從而抑制心肌凋亡，減輕心肌缺血再灌注損傷。

綜上所述，本研究表明PTS預處理能減輕心肌細胞損傷，縮小心肌梗死面積，有效保護心肌缺血再灌注損傷大鼠的心肌細胞，其作用機制可能與降低大鼠血清CK-MB、IL-6及TNF-α水平，及調節(jié)凋亡和抗凋亡關鍵酶Bcl-2和Bax的表達相關。