基于小鼠肝炎病毒研究遺傳工程小鼠隔離檢疫設計*

桂 飛 楊偉偉 俞利平 周 祥 汪海燕 孫筱品 戴方偉 宋曉明

(1. 杭州師范大學實驗動物中心, 杭州 310036)(2. 浙江省醫(yī)學科學院實驗動物中心, 杭州 310013)

隨著基因編輯技術的不斷進步，遺傳工程小鼠逐漸成為生命科學研究中應用最為廣泛的實驗動物，各大高校、科研機構每年需引進、制備大量品系的遺傳工程小鼠，其中很大比例來自科研院所的交流或從海外進口。這有效促進了生命科學相關領域的快速發(fā)展，同時引入一系列關于實驗動物病原微生物和寄生蟲質(zhì)量控制的難題。一旦隔離檢疫環(huán)節(jié)出現(xiàn)疏漏，往往導致大規(guī)模、持續(xù)性病原感染，不僅嚴重影響科研成果準確性，更威脅到從業(yè)人員健康和生命安全。檢測機構在接收委托檢測時發(fā)現(xiàn)，很多機構采用遺傳工程小鼠背景鼠—C57BL/6小鼠作為哨兵鼠進行隔離檢疫和常規(guī)病原監(jiān)測。我國對入境活體動物的隔離檢疫，綜合《進境動物檢疫疫病名錄》相關鼠病和國標《實驗動物 微生物學等級及監(jiān)測》[1]要求，將SPF鼠隔離期由30 d調(diào)整為14 d[2]，在1～2周內(nèi)需實現(xiàn)病原檢測是否可行以及如何實現(xiàn)是實驗動物管理人員都需面對的現(xiàn)實問題。

小鼠肝炎病毒(murine hepatitis virus, MHV)屬于冠狀病毒科、冠狀病毒屬，基因組為線性不分段的單股正鏈RNA[3]。 MHV感染是一種嚴重危害小鼠生產(chǎn)的病毒性傳染病，正常情況下呈隱性感染，應激激發(fā)時會誘發(fā)致死性病變，是一種廣泛傳播且頑固的病原，難于被發(fā)現(xiàn)和有效控制，MHV已是遺傳工程小鼠微生物控制中最難于生物凈化的病原之一[4]。目前，針對MHV的診斷方法有病毒分離與鑒定、血清學試驗、組織病理學診斷和分子生物學診斷等。本文以MHV為例，研究兩種品系小鼠作為哨兵鼠在MHV感染后，病毒核酸檢測量和血清抗體變化規(guī)律，以期為遺傳工程小鼠隔離檢疫以及常規(guī)病原檢測提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1實驗動物：6～8周齡C57BL/6小鼠和BALB/c小鼠各10只，雌雄各半，由杭州師范大學實驗動物中心提供，生產(chǎn)許可證：SCXK(浙)2016-0004，小鼠飼養(yǎng)在屏障系統(tǒng)隔離器中，使用許可證：SYXK(浙)2016-0006，動物自由采食和飲水。待動物充分適應環(huán)境后，在符合動物福利的條件下進行實驗。

1.1.2試劑:DNA/RNA Isolation Kit(TIANGEN DP422)核酸提取試劑盒以及Fast Quant RT Kit(With gDNase)(TIANGEN KR106)反轉錄試劑盒購自天根生化科技有限公司；小鼠肝炎病毒實時熒光定量PCR檢測試劑盒TaqMan? Gene Expression Master Mix(ABI 4369016)購自ABI公司；小鼠肝炎病毒ELISA檢測試劑盒購自Xpress Bio公司。

1.1.3主要儀器與設備：微量紫外分光光度計(Thermo Nanodrop 2000)、 普通PCR擴增儀(Bio-RAD)、實時熒光PCR儀(ABI One step plus)、生物安全柜(Thermo)、酶標儀(Molecular Devices)、 DEM-3型自動洗板機(北京拓普分析儀器有限責任公司)。

1.2 方法

1.2.1引物與探針的設計：從NCBI的FTP中下載兩株MHV基因組序列，經(jīng)分析比對、Primer Premier 5.0 軟件設計熒光定量PCR引物和探針以及實驗篩選和驗證，選取29843-31210 Murine hepatitis virus strain JHM為靶基因。引物、探針(見表1)由上海捷瑞生物工程有限公司合成。

表1 MHV TaqMan熒光定量PCR引物及探針序列

1.2.2樣品的收集及前處理：C57BL/6小鼠和BALB/c小鼠作為哨兵鼠，參照常規(guī)的遺傳工程小鼠隔離檢疫方式進行如下設計：小鼠雌雄各半，分4籠放入同一個隔離包中，使用經(jīng)MHV核酸檢測陽性的小鼠臟墊料為感染源，均分后感染待檢哨兵鼠。哨兵鼠每周更換2次臟墊料，使其自然感染。接觸飼養(yǎng)28天后停止接觸臟墊料，每只小鼠進行單籠飼養(yǎng)并取樣直至實驗結束。在第7、14、21、28、42、56天分別將每只實驗小鼠取出至經(jīng)高壓滅菌的籠盒中，待其自然排便后采集小鼠的新鮮糞便，同時采集血樣。取50 mg糞便用液氮研磨法[5]，加入600 μL裂解液，充分混勻后，按試劑盒操作步驟提取。血液經(jīng)3 000 r/min、5 min離心后，取血清放置于-20 ℃?zhèn)溆?，待所有血清收集完成后，使用ELISA檢測試劑盒檢測血清MHV特異性抗體。

1.2.3核酸提?。簩⒉杉募S便樣本，按照TIANGEN DP422核酸提取試劑盒說明書，手動提取病毒RNA，并進行核酸濃度測定，常規(guī)方法反轉錄成cDNA，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4實時熒光定量TaqMan-PCR檢測及判定標準：用TaqMan試劑盒對提取的病毒RNA進行檢測，反應體系如下： 2×TaqMan Fast Advanced Master Mix 12.5 μL，上下游引物(10 μmol/L) 各 0.5 μL，探針(5 μmol /L) 1.0 μL，模板cDNA 2.0 μL，補水至 25 μL。擴增程序為： 50 ℃孵育2 min，95 ℃預變性10 min； 95 ℃變性 15 s，60 ℃退火延伸 1 min，共 40 個循環(huán)，收集熒光信號并讀取數(shù)據(jù)。

參考《中國實驗動物學會團體標準匯編及實施指南》[6]，若待檢測樣品無熒光擴增曲線，則判定樣品未檢出小鼠肝炎病毒。若待檢測樣品有熒光擴增曲線，且Ct值應≤35時，則判斷樣品中檢出小鼠肝炎病毒。若待檢測樣品Ct值介于35和40之間時，應重新進行實時熒光RT-PCR檢測。重新檢測后，若Ct值≥40時，則判定樣品未檢出小鼠肝炎病毒。重新檢測后的Ct值仍介于35和40之間，則判定樣品檢出小鼠肝炎病毒。

1.2.5血清抗體檢測及判定標準：應用XpressBio公司小鼠肝炎病毒ELISA檢測試劑盒，按照說明書步驟進行檢測。在405 nm波長處，待檢測樣本光吸收值與相應陰性對照孔的光吸收值的差值≥0.3時，則判定該待測樣本中檢出小鼠肝炎病毒。

1.2.6統(tǒng)計學分析：數(shù)據(jù)運用SPSS statistics 22軟件處理，采用Cohen’s kappa系數(shù)[7]分析兩種檢測方法對樣本陽性判斷的一致性，P< 0.05為差異顯著；P< 0.01為差異極顯著。

2 結果

2.1 C57BL/6小鼠糞便中肝炎病毒檢測量與血清抗體的變化結果

C57BL/6小鼠qPCR檢測結果(表2)表明，在接觸含小鼠肝炎病毒臟墊料的第7天、第14天和第21天均未從單獨采集的糞便中檢出病毒核酸，在第28天、第42天各有兩只C57BL/6小鼠糞便中檢出病毒核酸陽性，陽性率僅為20%，2個陽性樣本的平均Ct值分別為(37.31±1.35)和(36.36±3.06)。第56天所有糞樣均為陰性，未檢出病毒核酸。由血清MHV特異性抗體結果(表2)可知，在整個臟墊料接觸期(第1天至第28天)以及之后四周的單獨飼養(yǎng)期均未從本項目設計的C57BL/6哨兵鼠血清中檢出MHV特異性抗體。

由表2可知，當采用 C57BL/6小鼠作為隔離檢疫的哨兵鼠使用時，qPCR法在第28天小鼠糞樣中檢出MHV陽性，檢出率僅為20%，第42天陽性數(shù)量未增加，到第56天時糞便病毒載量已經(jīng)低于qPCR檢測限。采用ELISA法檢測血清MHV特異性抗體的結果則表明，本研究所設計的整個隔離檢疫策略無法檢出陽性樣本。

表2 C57BL/6小鼠糞便中肝炎病毒的檢測量與血清中抗體的變化結果

2.2 BALB/c小鼠糞便中肝炎病毒的檢測量與血清抗體的變化結果

qPCR檢測結果(表3)發(fā)現(xiàn)，在BALB/c小鼠與臟墊料接觸期的第21天，從單獨采集的糞便中可檢測出少量的MHV核酸，qPCR方法的檢出率為20%，平均Ct值為(38.70±0.99)。在第28天，從10只BALB/c小鼠中檢出7只小鼠的MHV核酸陽性，陽性率為80%，陽性樣本的平均Ct值為(27.31±6.85)，經(jīng)脫離臟墊料環(huán)境飼養(yǎng)兩周后，第42天也有5只BALB/c小鼠檢出MHV核酸陽性，在第56天qPCR未能檢出陽性。

ELISA檢測結果(表3)顯示，在接觸感染期(第1天至第28天周)血清抗體檢測結果均為陰性，在第42天和第56天，待檢的10只哨兵鼠中有5只BALB/c小鼠血清特異性抗體檢測呈陽性，且第56天抗體OD值與第42天相比有顯著提高。

表3 BALB/c小鼠糞便中肝炎病毒的檢測量與血清抗體的變化結果

配對卡方檢驗發(fā)現(xiàn)，感染前28 d，僅qPCR方法可檢測出陽性；第42天兩種方法均可檢出陽性，且兩種檢測方法的Cohen’s kappa系數(shù)為1，P<0.01，具有很強的一致性。而第56天僅ELISA方法檢測出陽性。由表3可知，在模擬常規(guī)隔離檢疫的臟墊料接觸感染21 d后，有20% BALB/c小鼠糞樣qPCR檢測為陽性，第28天有80%BALB/c小鼠糞樣檢出陽性，第42天仍有50%陽性率。采用ELISA法檢測特異性抗體時，第21天、第28天均無陽性血樣檢出，僅在第42天時開始檢測到抗體陽性，表明qPCR檢測糞樣病毒核酸較ELISA法測血清抗體具有早檢出且檢出率更高的特點，更能達到隔離檢疫的目標。

2.3 C57BL/6和BALB/c小鼠糞便中MHV核酸檢測量與血清抗體變化的比較

將C57BL/6和BALB/c兩品系小鼠糞便中MHV qPCR核酸檢測量進行對比(圖1)后發(fā)現(xiàn)，BALB/c小鼠在感染第21天，從糞便中即可檢測出少量MHV核酸陽性，隨后病毒含量呈上升趨勢；C57BL/6小鼠在感染后第28天才能檢出，從Ct值判斷其病毒含量一直處于較低水平。兩品系小鼠的血清抗體檢測結果對比顯示，C57BL/6小鼠直至第56天，均未檢測出抗體陽性，BALB/c小鼠隨著肝炎病毒檢測量的增加，從第42天開始血清抗體水平持續(xù)增加。當血清抗體增加到一定程度后，病毒檢測量出現(xiàn)了下降(見圖1)。因此，本研究結果表明，針對小鼠肝炎病毒BALB/c小鼠較C57BL/6更易感，且更易引起機體的免疫應答反應。

圖1 C57BL/6和BALB/c小鼠糞便中肝炎病毒檢測量與血清抗體的變化結果

3 討論

從實驗結果看，BALB/c小鼠在當前的感染條件下，MHV感染后糞便中病毒載量的變化呈先升后降的趨勢，第21天開始檢出少量，第28天檢測含量最高，隨后下降，第56天未能檢出，這表明小鼠在感染前期，因體內(nèi)未產(chǎn)生抗體，病毒處于復制期，當病毒復制到一定量后刺激機體發(fā)生免疫反應，產(chǎn)生抗體，從而使感染后期病毒載量出現(xiàn)下降趨勢；感染后期才出現(xiàn)小鼠肝炎病毒抗體，與Scavizzi和Raspa等[8]實驗結果基本一致。且糞便中病毒載量與血清抗體的變化呈負相關關系。本研究中采用自然感染的方式，所用的感染源MHV含量較低，就病毒檢出時間和檢出率來看，自然感染小鼠排毒時間較人工感染小鼠肝炎病毒排毒明顯滯后[9]，可能毒株的類型和其毒力的強弱有關，也可能與感染途徑或方式有關。

通過比較不同品系小鼠發(fā)現(xiàn)，C57BL/6小鼠對MHV不太敏感，在整感染過程中，從糞便中僅檢測出極少量病毒，且未能刺激機體產(chǎn)生抗體。BALB/c小鼠對MHV較易感，誘導產(chǎn)生較強烈的免疫反應，產(chǎn)生抗體。Shigeru Kyuwa等[10]也發(fā)現(xiàn)在BALB/c小鼠的原代肝細胞增殖的MHV滴度比C57BL/6小鼠的原代肝細胞增殖的要高，提示BALB/c小鼠較C57BL/6小鼠對小鼠肝炎病毒更易感，可為哨兵鼠的選擇提供參考依據(jù)。

在隔離檢疫的過程中，通過小鼠糞便，可以較早檢測小鼠肝炎病毒的感染情況，提早確定病原微生物的感染狀況；感染后期，血清抗體相對穩(wěn)定，與劉香梅等[11]報道結果相一致。研究提示可結合糞便中病原微生物檢測和血清抗體含量的檢測方法，綜合評價實驗動物病原微生物的感染狀況，從而有效控制病原微生物的感染。

針對本研究選用的小鼠肝炎病毒，無論是用qPCR法還是ELISA法，BALB/c作為哨兵鼠比C57BL/6小鼠有更高的檢出率，鑒于MHV是遺傳工程小鼠最主要的感染病原之一，我們建議在隔離檢疫和常規(guī)病原檢測中，選用BALB/c替代C57BL/6作哨兵鼠。同時在大鼠或小鼠進行隔離檢疫時，糞便和其他排泄物均用PCR法來監(jiān)測傳染性病原體。