卵胞漿內單精子注射對后代安全性影響的研究進展

邵帥，江梅，丁濤，姜經航，王開秀，王婷婷，李長超

(湖北省荊門市第二人民醫(yī)院，1.生殖醫(yī)學科；2.檢驗科，荊門 448000)

卵胞漿內單精子注射(ICSI)又稱“第二代試管嬰兒”，是直接將單個精子注射到卵母細胞胞漿內，使其受精形成胚胎進行移植受孕。ICSI是在體外受精-胚胎移植(IVF-ET)基礎上發(fā)展起來的顯微受精技術，常用于男性嚴重少弱畸精子癥、無精子以及IVF受精失敗等的治療[1]。ICSI 技術對精子的要求比較低，受精率高，是目前治療男性不育最有效的技術[2]。雖然 ICSI 在臨床上的應用比較成熟，但ICSI 操作的步驟包括透明質酸酶的作用、機械去除卵母細胞周圍的顆粒細胞、精子的制動、注射針對卵母細胞的侵入性操作、精子頂體注射以及精子制動液注射到卵母細胞內等各個環(huán)節(jié)都可能影響胚胎以及后代的發(fā)育，具有潛在的遺傳風險[3-4]；而且ICSI技術避開了精子自然選擇的過程，可能會增加新生兒出生缺陷的患病率[5]。由此引發(fā)ICSI 出生后代是否與自然出生的人群存在安全性、遺傳性及其他方面的差異尚不可知。因此，本文主要對ICSI導致的先天畸形、表觀遺傳疾病、染色體異常、不育、代謝性疾病、癌癥等研究做一綜述，以便為生殖中心的ICSI規(guī)范操作提供相關依據(jù)。

一、先天性畸形

先天性畸形是指先天結構或功能異常，可能是由遺傳或多種因素造成的，但在大多數(shù)情況下原因未知。2015年加利福利亞的一項回顧性隊列研究發(fā)現(xiàn)，ICSI應用于非男性因素不孕時，與IVF相比會增加自閉癥的風險[6]。此外，美國國家輔助生殖技術中心監(jiān)測系統(tǒng)從1996年至2012年的數(shù)據(jù)顯示，在非男性因素不孕患者治療中，與傳統(tǒng)IVF相比，ICSI出生新生兒伴隨著低出生體重率和低多胎率；而在植入率、妊娠率、流產率、早產率和低出生體重等方面，男性因素與非男性因素不孕癥的結果并無顯著性差異[7]。Tararbit等[8]發(fā)現(xiàn)，ICSI出生新生兒與法洛四聯(lián)癥風險顯著相關，但與其他先天性心臟病風險不相關。Lacamara等[9]通過系統(tǒng)回顧和Meta分析發(fā)現(xiàn)，ICSI單胎妊娠出生的新生兒與自然受孕的新生兒相比，發(fā)生先天性畸形的風險更高；同時研究結果也顯示輔助生殖技術(ART)存在相關風險，包括配子體外操作、胚胎冷凍與解凍等；除了與父母特征相關的因素如母親或父親的年齡、男性不育因素外，先天性畸形的發(fā)生還與社會經濟地位、妊娠期間使用的藥物、誘發(fā)卵巢過度刺激的方法等有關。然而，Zhu等[10]研究發(fā)現(xiàn)，在IVF和ICSI的新生兒出生缺陷中，不管單胎還是雙胎其發(fā)生率均無顯著性差異；在評估凍融胚胎移植(FET)出生新生兒時，也未發(fā)現(xiàn)IVF出生新生兒和ICSI出生新生兒之間存在出生缺陷風險上的統(tǒng)計學差異。對于AZF微缺失的患者，應用ICSI也可以獲得良好的臨床妊娠結局，ICSI患者與非ICSI患者出生的新生兒結局無顯著性差異[11]。Jwa等[12]并未發(fā)現(xiàn)與ICSI出生新生兒相關的先天性畸形風險增加，即使分析ICSI獲得的凍融胚胎以及移植不同發(fā)育階段胚胎，也得出同樣的結論。

綜上所述，經ART助孕新生兒和先天性畸形風險之間的聯(lián)系仍然不明確，這可能與個體異質性、研究設計的針對性、選擇偏倚以及Meta分析限制等導致的畸形總數(shù)偏低有關。鑒于患者的疾病和ICSI適應證也可能與畸形風險有關，因此將較高的遺傳風險完全歸因于ICSI似乎有些牽強。

二、表觀遺傳疾病

表觀遺傳是指DNA序列不發(fā)生變化但基因表達卻發(fā)生了可遺傳的改變，即基因型未發(fā)生變化而表型卻發(fā)生了改變。表觀遺傳學主要通過DNA修飾、蛋白質修飾與非編碼 RNA 調控 3個層面上調控基因表達。Choux等[13]通過前瞻性研究將IVF/ICSI單胎妊娠結局和自然妊娠結局進行比較，發(fā)現(xiàn)IVF/ICSI胎盤樣本中一些轉位因子和印跡基因發(fā)生了甲基化和轉錄改變，表明IVF/ICSI可能會導致胎盤表觀遺傳改變。研究表明，IVF/ICSI與H19甲基化顯著降低、IGF2和SNRPN甲基化顯著升高相關，而印跡基因表達異常和DNA甲基化可能與印跡障礙和其他生長發(fā)育相關疾病有關，需要進一步調查ART對健康的長期影響[14]。在不育男性檢查中發(fā)現(xiàn)印跡基因GTL 2和H19 異常表達，表明男性不育與精子中印跡位點甲基化異常相關，一些少精子癥患者精子中存在的印跡位點甲基化異常現(xiàn)象，通過ICSI能夠遺傳給后代[15]。Hattori等[16]研究認為，與ART相關的印記障礙可能傾向于在受精后不久出現(xiàn)，即在表觀基因組最脆弱的時候發(fā)生，并可能受到ICSI操作技術及受精卵培養(yǎng)基組分的影響。外源性促性腺激素刺激引發(fā)的卵巢相關激素改變和成熟卵母細胞的采集均可導致ART助孕新生兒的表觀遺傳障礙或印跡缺陷風險的增加。此外，受精操作和胚胎培養(yǎng)條件可能會改變DNA甲基化狀態(tài)，從而增加印跡障礙的風險。

研究人群和組織樣本的異質性以及不同的實驗室操作方法可能導致了模棱兩可的結果。但顯而易見，雖然自然受孕的新生兒和ART受孕的新生兒之間確實存在著印跡和表觀遺傳的差異，但這種差異對其生長發(fā)育的影響是微乎其微的。

三、染色體異常

ICSI已成為治療男性不育癥的首選方法，但由于不育患者的精子染色體異常頻率升高，妊娠頭3個月的染色體非整倍體率可能會增加。染色體分離異常會引起成熟生殖細胞的染色體異常，并導致胚胎染色體異常。事實上，非整倍體和染色體結構畸變是導致受精失敗、植入失敗、自然流產、死胎、先天性畸形以及精神和行為功能障礙的主要因素。因此，不育夫婦進行ICSI治療時，后代染色體異常的風險可能會增加，因為這種技術通過注射染色體異常精子會使染色體非整倍體遺傳給下一代。

男性因素不育治療中，ICSI助孕可以提高受孕成功率，但也增加了非整倍體和染色體結構重排的發(fā)生率，導致妊娠率和著床率偏低而流產率偏高[17]。一般來說，通過ICSI受孕的后代染色體異常發(fā)生率偏高，特別是后代性染色體非整倍體的風險比自然受孕和IVF受精的后代更高[18]；但Belva等[19]研究發(fā)現(xiàn)，ICSI出生新生兒核型異常率為3.2%，主要與大量新發(fā)常染色體異常有關，而非與性染色體異常有關；在產前和產后取樣的聯(lián)合組中，發(fā)現(xiàn)了1.9%的新生兒染色體異常率且高于一般人群，這與父親的精子數(shù)量有關。由于以上結果均出自男性不育癥文獻，因此有理由認為ICSI出生新生兒的染色體異常風險與不育父親的低質量精子有關，而非ICSI技術本身。

四、不育

ICSI自1992年誕生以來，至今才有20多年，對ICSI出生后代的生育狀況檢測尚有諸多不便。因為男性不育可能會損害睪丸間質細胞功能和降低血清睪丸激素水平，而3月齡時垂體-睪丸軸暫時活躍，因此3月齡的嬰兒血清睪丸激素可以作為ICSI成年生殖功能的預測指標，據(jù)此可以比較ART出生的嬰兒和自然受孕嬰兒的睪丸功能。研究顯示：ICSI出生男孩和IVF出生男孩的血清生殖激素[FSH、LH、抑制素B和睪酮(T)]水平無顯著性差異；因男性因素不育采用ICSI出生男孩的血清總T和游離T水平顯著低于自然受孕出生男孩，而LH/T比率高于自然受孕出生男孩；因女性因素不孕采用IVF助孕出生男孩和自然受孕出生男孩的血清生殖激素比較無顯著性差異；提示ICSI出生男孩的睪丸間質細胞功能受損，可能遺傳自父親，因此成年后需進行生殖健康檢查[20-22]。Catford等[23]研究發(fā)現(xiàn)，與同齡的正常男孩相比，因男性因素不育采用ICSI出生的3月齡男孩的血清T較低，LH/T比率較高；ICSI出生的年輕成年男性精子發(fā)生障礙，精液質量下降，還有較高的FSH水平和較低的抑制素B水平。Belva等[24]研究發(fā)現(xiàn)，ICSI出生男孩的青春期內分泌功能正常，但唾液T水平以及抑制素B水平等在成年早期不正常，并且ICSI出生青年男性的精液質量和數(shù)量均有所下降；通過ICSI助孕導致精子發(fā)生異常的代際遺傳可能性有待進一步研究。

Y染色體微缺失通過ICSI傳遞給男性后代，導致其有很高的不育風險，如核型為inv(9)(p11q13)就可以通過ICSI傳給后代；某些Y染色體微缺失，包括最常見的gr/gr微缺失，不一定會導致后代男性不育，但會增加不育的風險。Y染色體缺失的男性患者其女性后代不會增加患先天性異?；虿辉邪Y的風險。因此，對 Y染色體微缺失男性不育患者行ART治療時，可以進行特定的產前診斷(包括胚胎植入前遺傳學診斷)，以篩查胎兒性別或者確定是否存在Y染色體微缺失[25]。

ART出生的女性后代其生育狀況的數(shù)據(jù)很少。有研究顯示，ART出生的18～22歲女性與自然受孕出生的女性對照組相比，兩組間血清抗苗勒管激素、FSH水平及竇卵泡計數(shù)比較均無顯著性差異[22]。

以上研究表明，ICSI出生的男性后代可能會存在源自父系的生育能力缺陷，而ICSI出生的女性后代因現(xiàn)有資料太少，無法對其生育能力作出任何推測。

五、代謝性疾病

ART過程包括卵巢刺激、配子操作和胚胎培養(yǎng)等，都發(fā)生在基因組甲基化模式建立的關鍵窗口期。有研究者認為，DNA甲基化的改變會影響基因轉錄調控，并可能增加兒童和成人患心臟代謝疾病的風險[26]。肥胖或超重婦女的胚胎常常表現(xiàn)出發(fā)育和代謝狀況不佳，究其原因，肥胖或超重婦女的卵母細胞比正常女性的卵母細胞要小，發(fā)育成囊胚期的概率降低，為促進其發(fā)育，滋養(yǎng)外胚層的細胞數(shù)量相應減少，從而對著床和胚胎產生負面影響；這些胚胎也表現(xiàn)出明顯的代謝變化，葡萄糖消耗減少、氨基酸代謝改變、甘油三酸酯水平增加等，可能對后代有潛在的不良影響。在胚胎發(fā)育過程中，胚胎所處的微環(huán)境若發(fā)生根本性的變化，可能會導致心臟代謝途徑發(fā)生永久性的改變[27]。Kosteria等[28]通過血清蛋白質組學分析發(fā)現(xiàn)ICSI出生的孩子中有19個高表達蛋白和3個低表達蛋白，大多數(shù)過表達蛋白與急性期反應、凝血、補體通路激活以及鐵和脂代謝有關，提示亞臨床不良的心臟代謝特征。Vlachopoulos等[29]研究發(fā)現(xiàn)，ART后代中血清前蛋白轉化酶枯草溶菌素/Kexin 9型(PCSK9)水平隨著年齡的增長而增加，提示心血管風險的增加可能與其導致的血脂狀況的逐漸惡化有關；與ICSI相比，IVF治療伴隨較高水平的脂蛋白a[Lp(a)]。其他研究表明，在IVF/ICSI出生的后代中，新生兒、嬰兒和兒童的生長發(fā)育與血壓呈正相關，兒童生長與血管內皮細胞功能呈負相關[30]。ICSI出生的男性后代其體內高密度脂蛋白(HDL)的平均濃度較低，而代謝綜合征的其他標志物則不受受孕方式的影響[31]。

六、癌癥

丹麥的一項調查研究顯示，1996至2015年出生兒童中，F(xiàn)ET出生兒童與自然生育的兒童患癌比例分別為44.4/100 000和17.5/100 000，兩者間有統(tǒng)計學差異[32]。一項系統(tǒng)回顧性分析顯示，與自然受孕的后代相比，ART出生后代的患癌風險總體增加；在對癌癥類型的分析中發(fā)現(xiàn)，ART出生后代罹患特定類型癌癥的風險有所增加，包括肝母細胞瘤和橫紋肌肉瘤、神經系統(tǒng)腫瘤、惡性上皮腫瘤、白血病以及霍奇金淋巴瘤[33]。也有研究發(fā)現(xiàn)，有生育問題女性的后代患癌癥的風險總體上有所增加，這可能與母親遺傳有關[34]；是否存在其他潛在的致癌因素還未可知，有可能先天因素才是(兒童)癌癥的最重要原因而非ART技術所致。因此，建議進行更多的相關研究。然而Spaan等[35]研究發(fā)現(xiàn)，與自然受孕的兒童或與普通人群相比，ART出生的后代總體患癌風險并沒有增加，ICSI或FET出生的兒童患癌風險有輕微但不顯著的增加；與自然受孕的兒童相比，ART受孕的兒童發(fā)生淋巴細胞白血病和黑色素瘤的風險無顯著增加。不同類型的癌癥可能有不同的病因，盡管ART治療后出生的兒童總體患癌風險沒有增加，但某些特定類型的癌癥發(fā)生風險可能會有所增加。在ART分層分析中，ICSI和常規(guī)體外受精兒童間的癌癥發(fā)生率無顯著性差異。

總 結

ICSI技術的問世給男性不育患者的治療帶來了希望，是一項革命性的技術突破。畢竟至今只有28年的應用時間，所以ICSI的安全性一直備受人們的廣泛關注。不可否認，大部分研究認為ICSI子代和自然妊娠兒童健康狀況相似，ICSI是相對安全的；除了以上ICSI出生后代相關問題需要擔憂以外，還有神經系統(tǒng)及認知發(fā)育、社會心理發(fā)育、子代出生缺陷等方面也值得關注和擔憂。因此，ICSI技術的安全性仍值得關注，有待大規(guī)模、長時間的隨訪。