胚胎植入前非整倍體檢測：囊胚形態(tài)學評分有指導作用嗎？

饒群，白劍，胡丹，楊殊琳

(華中科技大學同濟醫(yī)學院附屬同濟醫(yī)院生殖醫(yī)學中心，武漢 430000)

生殖醫(yī)學領域往往采用形態(tài)學評分來決定胚胎移植順序。目前應用比較廣泛的囊胚形態(tài)學評分標準是1999年Gardner評分標準[1-3]，其使用囊胚腔擴張程度、內細胞團(ICM)外觀和滋養(yǎng)外胚層細胞(TE)的外觀來評價囊胚質量。

隨著胚胎植入前非整倍體檢測(Preimplantation genetic testing for aneuploidy，PGT-A)的開展，囊胚形態(tài)學評分與胚胎整倍性的關系越來越受到關注。一些研究將囊胚形態(tài)學的整體評級作為獨立指標，研究其與胚胎整倍性的關系[4-5]，還有研究分別將ICM分級、TE分級和囊胚腔的擴張程度作為3個獨立指標探討其與胚胎整倍性的關系[6-7]。此外，囊胚發(fā)育天數(shù)與擴張程度共同體現(xiàn)了囊胚的發(fā)育速度，有些學者認為囊胚腔擴張程度變化快，不可作為可靠的評價指標[8]；而另一些學者認為，囊胚發(fā)育速度是其整倍體率的獨立影響因素[9]。因此，如何選擇囊胚形態(tài)學評價指標探討形態(tài)學評分與胚胎整倍性的關系仍然存在爭議。

女性卵母細胞整倍體率和活產率隨年齡的增長而下降[6，10-11]。有研究提示在PGT-A周期中，整倍體胚胎的形態(tài)學評分可預測繼續(xù)妊娠率[12-13]，且胚胎形態(tài)學評分越高其移植后活產率越高[3，14-19]。也有研究表明，胚胎整倍性與活產密切相關，超過50%的整倍體胚胎可獲得活產，且這一結論與女方年齡和囊胚形態(tài)學評分無關[4-5，20-22]。由于胚胎形態(tài)學評分、胚胎整倍性和臨床妊娠結局之間的關系仍存在爭議，如何最大限度的提高患者收益、縮短獲得妊娠的時間是生殖領域醫(yī)生面對的挑戰(zhàn)。本研究回顧性分析在本中心進行活檢的囊胚形態(tài)學評分和相關臨床資料，探討囊胚形態(tài)學評分在PGT-A周期中的指導作用。

資料和方法

一、研究對象

回顧性分析2019年1～12月在本中心行PGT-A的177個取卵周期(共732枚活檢胚胎)的臨床資料。本中心進行PGT-A的適應癥(符合其一即可)：(1)不明原因反復妊娠丟失(RPL≥2次)；(2)高齡(年齡≥38歲)；(3)流產物檢測出染色體非整倍體；(4)反復移植失敗(RIF)；(5)夫妻一方為染色體數(shù)目異常。

納入標準：(1)所有患者卵巢刺激均使用激動劑降調節(jié)方案(卵泡期長方案或黃體期長方案)或拮抗劑方案；(2)所有胚胎都在囊胚期進行活檢；(3)均采用二代測序(NGS)進行非整倍體篩查檢測；(4)所有卵母細胞均來自患者本人，無供卵周期。

排除標準：(1)因活檢細胞量不足或單細胞擴增失敗導致檢測失敗的胚胎；(2)因高齡、RPL行PGT-A的胚胎；(3)重復活檢的胚胎；(4)嵌合體胚胎；(5)因夫妻一方染色體異常導致的非整倍體胚胎；(6)臨床數(shù)據(jù)不全(如缺失年齡或隨訪結果)的胚胎。

按照納入和排除標準，最終本研究共納入474枚囊胚，其中因流產物檢測出染色體非整倍體行PGT-A的胚胎占比51.9%(246/474)，因RIF行PGT-A的胚胎占比1.1%(5/474)，因夫妻一方染色體數(shù)目異常行PGT-A的胚胎占比47.0%(223/474)。

二、診療回顧

具有PGT-A適應癥的患者通過控制性促排卵后接受取卵手術，使用卵胞漿內單精子注射(ICSI)技術進行體外受精，之后在體外培養(yǎng)至第5天(D5)或D6形成囊胚，利用激光法進行囊胚活檢，隨后進行NGS檢測。

1.控制性促排卵：激動劑方案使用曲普瑞林(Triptorelin，輝凌公司，瑞士)進行降調節(jié)；拮抗劑方案使用醋酸西曲瑞克(Cetrorelix Aacetate Ppowder，百特腫瘤制藥有限公司，德國)抑制LH峰。予以重組人卵泡刺激素(rFSH，默克雪蘭諾公司，瑞士)和/或人尿促性素(HMG，珠海麗珠制藥公司)進行卵巢刺激。B超監(jiān)測卵泡發(fā)育，當超聲監(jiān)測有2個以上優(yōu)勢卵泡直徑≥18 mm時，予人絨毛膜促性腺激素(HCG，沈陽光大制藥有限公司)肌內注射10 000 U，36～38 h后超聲引導下卵泡穿刺取卵。

2.體外受精與活檢：所有卵母細胞均行ICSI。胚胎培養(yǎng)采用G系列序貫培養(yǎng)系統(tǒng)。受精后5～6 d，對質量優(yōu)于3BC的囊胚進行活檢。利用激光法于囊胚ICM對側的滋養(yǎng)外胚層分離出3～8個細胞進行檢測。冷凍活檢后的囊胚，等待檢測結果。

3.囊胚形態(tài)學評分：本中心采用Gardner提出的囊胚形態(tài)學評分方法[1-3]進行評價，囊胚腔擴張程度3期以上、ICM和TE總體評分在AA/AB/BA的為優(yōu)質囊胚，BB為一般囊胚，余下等級為較差囊胚[8]。評級低于3BC囊胚丟棄，不予活檢。

4.PGT-A檢測：文庫制備使用植入前遺傳學篩查試劑盒(Pre-implantation Genetics Screening Library Prep Kit，億康基因，中國)進行。用基于多次退火環(huán)狀循環(huán)擴增技術的基因擴增和文庫構建法(MALBAC-Lab)進行全基因組擴增和文庫構建。測序平臺為MiniSeq，測序結果由億康基因公司行質量控制。

5.冷凍囊胚復蘇移植：均采用激素替代周期進行內膜準備，行凍融單囊胚移植。囊胚復蘇使用玻璃化解凍試劑盒(Kitazato Biopharma Co.Ltd，日本)。

6.隨訪：移植后14 d測血HCG，陽性者移植后28 d行B超檢查，見宮內孕囊及胎心搏動者確定為臨床妊娠。所有臨床妊娠患者隨訪至妊娠終止或活產。

三、研究分組

本研究按照兩個層次進行分析比較。首先對在本中心行PGT-A的所有732枚囊胚按照納入標準和排除標準進行篩選，共有474枚囊胚納入研究，按照活檢時間不同分為D5組(204枚)和D6組(270枚)(具體篩選及胚胎評分情況見圖1)，探討囊胚評

圖1 所有活檢囊胚的篩選流程

級與整倍體率及活產率的關系。考慮到本研究中大部分囊胚ICM和TE評分為BB級，故將納入研究的244枚BB級囊胚按照不同囊胚擴張程度分為<4期、4期和>4期3組(具體篩選及胚胎評分情況見圖2)，探討D5或D6活檢的囊胚擴張程度對整倍體率和活產率的影響。

圖2 BB級活檢囊胚的篩選流程

四、統(tǒng)計學分析

采用GraphPad Prism 9統(tǒng)計軟件系統(tǒng)進行數(shù)據(jù)分析。計量資料的組間均數(shù)比較采用t檢驗或ANOVA分析，組間率的比較采用Chi-square檢驗，不滿足Chi-square檢驗的采用Fisher確切概率法檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

一、納入囊胚的患者基線資料比較

474枚囊胚中D5活檢囊胚204枚，其中優(yōu)質囊胚19枚，一般囊胚129枚，較差囊胚56枚；D6活檢囊胚270枚，其中優(yōu)質囊胚10枚，一般囊胚115枚，較差囊胚145枚。各亞組間女方平均年齡、基礎FSH、抗苗勒管激素(AMH)、體質量指數(shù)(BMI)值比較均無統(tǒng)計學差異(P>0.05)(表1)。

表1 納入囊胚不同活檢時間和評級亞組的基線資料比較(-±s)

通過PGT-A獲得的233枚整倍體胚胎中，移植了126枚，根據(jù)移植的囊胚不同分為D5移植組(移植D5活檢囊胚，n=61)和D6移植組(移植D6活檢囊胚，n=65)。D5移植組中移植優(yōu)質囊胚8枚，一般囊胚40枚，較差囊胚13枚；D6移植組中移植優(yōu)質囊胚5枚，一般囊胚32枚，較差囊胚28枚。各亞組間女方平均年齡、基礎FSH、AMH、BMI值比較均無統(tǒng)計學差異(P>0.05)(表2)。

表2 移植不同時間整倍體囊胚各亞組基線資料比較(-±s)

二、納入囊胚各組整倍體率和移植臨床結局比較

D5組活檢囊胚的整倍體率比較，一般囊胚顯著高于較差囊胚(P=0.025，OR=2.173，95%CI：1.160-4.043)，其余各組比較整倍體率均無顯著性差異(P>0.05)。D6組活檢囊胚的整倍體率比較，一般囊胚亦顯著高于較差囊胚(P=0.005，OR=2.094，95%CI：1.280-3.488)，其余各組比較整倍體率均無顯著性差異(P>0.05)。D5組和D6組兩組間優(yōu)質囊胚、一般囊胚、較差囊胚的整倍體率比較均無顯著性差異(P>0.05)(表3)。

PGT-A檢測后獲得的整倍體囊胚中，移植D5優(yōu)質囊胚、一般囊胚、較差囊胚的活產率無顯著性差異(P>0.05)；移植D6優(yōu)質囊胚、一般囊胚、較差囊胚的活產率無顯著性差異(P>0.05)。兩組間比較，移植D5、D6不同囊胚評級的活產率亦無顯著性差異(P>0.05)(表3)。

表3 納入囊胚各亞組整倍體率和活產率比較(%)

三、BB級囊胚各組患者基線資料比較

244枚BB級囊胚中D5活檢囊胚(D5組)129枚，其中擴張程度<4期囊胚35枚，4期囊胚92枚，>4期囊胚2枚；D6活檢囊胚(D6組)115枚，擴張程度<4期囊胚12枚，4期囊胚82枚，>4期囊胚21枚。各亞組間女方平均年齡、基礎FSH、AMH、BMI值比較均無統(tǒng)計學差異(P>0.05)(表4)。通過PGT-A獲得的整倍體胚胎中，移植了72枚，其中D5移植組40枚(擴張程度<4期的9枚，4期的31枚，>4期的0枚)；D6移植組32枚(擴張程度<4期的2枚，4期的22枚，>4期的8枚)。各亞組間女方平均年齡、基礎FSH、AMH、BMI值比較均無統(tǒng)計學差異(P>0.05)(表5)。

表4 BB級囊胚不同活檢時間和擴張程度亞組的基線資料比較(-±s)

表5 移植不同時間BB級整倍體囊胚各亞組基線資料比較(-±s)

四、BB級囊胚各組整倍體率和移植臨床結局比較

BB級囊胚中D5組活檢囊胚的整倍體率比較，擴張程度<4期、4期、>4期各組整倍體率均無統(tǒng)計學差異(P>0.05)；D6組活檢囊胚的整倍體率比較，擴張程度<4期組顯著高于4期組(P=0.026，OR=0.203，95%CI：0.057-0.711)，余各組囊胚整倍體率差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。D5組和D6組兩組間擴張程度<4期、4期、>4期組的整倍體率比較均無顯著性差異(P>0.05)(表6)。

PGT-A檢測后獲得的BB級整倍體囊胚中，移植D5擴張程度<4期、4期、>4期囊胚的活產率無顯著性差異(P>0.05)；移植D6擴張程度<4期、4期、>4期囊胚的活產率無顯著性差異(P>0.05)。兩組間比較，移植D5、D6不同擴張程度的囊胚活產率亦無顯著性差異(P>0.05)(表6)。

表6 BB級活檢囊胚各亞組整倍體率和活產率比較(%)

討 論

隨著NGS技術的發(fā)展，PGT-A技術被臨床廣泛運用。但是，其有效性和安全性尚存在爭議。為了更好地提高患者的囊胚利用率、節(jié)省患者的治療費用、縮短其獲得妊娠的時間，移植囊胚的選擇就顯得尤為重要。已有研究表明，囊胚形態(tài)學與整倍體率相關[4-7，23]，其整倍體率主要受促排卵方案和培養(yǎng)體系影響，與囊胚培養(yǎng)天數(shù)無關[24]。而另一些研究發(fā)現(xiàn)，D5活檢的囊胚其整倍體率和活產率顯著高于D6活檢的囊胚[25-26]。國內研究證明，無論是新鮮周期還是凍融周期的單囊胚移植，囊胚擴張程度可預測活產，而ICM及TE分級則與活產無關[27]。也有文獻指出擴張程度4期以上的囊胚有較高的著床率[28]。但基于現(xiàn)有研究結果，囊胚形態(tài)學評分、胚胎整倍體率和臨床結局之間的關系仍然存在爭議。

本研究納入的研究對象均為凍融移植周期單囊胚移植患者，且內膜準備方案均為激素替代周期，以排除不同的卵巢刺激方案對內膜容受性的影響以及移植胚胎數(shù)目對臨床結局的影響，同時還排除了高齡、染色體異常、復發(fā)性流產、RIF等因素，以盡量減少臨床結局的混雜因素。本研究將ICM、TE評分以及囊胚擴張程度作為獨立因素分別討論，評價囊胚形態(tài)學評分在PGT-A周期中的指導作用。本研究結果顯示，整體納入研究的囊胚中ICM和TE評分較差囊胚的非整倍體率顯著升高，而囊胚發(fā)育天數(shù)對其整倍體率并無顯著預測作用。對于同級別的整倍體胚胎，雖然最終結果沒有統(tǒng)計學差異，但發(fā)育速度快的(D5活檢)囊胚其活產率略高于發(fā)育較慢胚胎(D6活檢)，原因可能是D6囊胚較D5囊胚發(fā)育速度延遲，且體外培養(yǎng)時間較長，DNA損傷的可能性增加，導致發(fā)育潛能較差[29]。凍融周期中D5囊胚在玻璃化冷凍及復蘇過程中，可能更能耐受冷凍損傷，有較高的發(fā)育潛能[30]。BB級囊胚統(tǒng)計結果顯示D6活檢評級為BB級的囊胚擴張程度<4期時，其非整倍體率較4期組更高。雖然D5活檢的整倍體胚胎移植活產率有高于D6的趨勢，但差異尚無統(tǒng)計學意義。因此，我們認為，PGT-A可優(yōu)先用于檢測發(fā)育速度較慢(D6囊胚)、擴張程度<4期的較差囊胚(ICM和TE評級低于BB級)。在移植時，囊胚形態(tài)學評分與臨床結局無關，建議優(yōu)先選擇發(fā)育速度較快(D5活檢)的整倍體胚胎進行移植。但本研究也存在一定的局限性，首先，納入研究數(shù)目較少且納入的囊胚多為4BB級別，因此其分析結果可能存在一定偏倚，需進一步擴大樣本量后進行研究；其次，囊胚形態(tài)學評分具有一定主觀性，可能造成偏倚。

綜上所述，本研究結果再次證實了囊胚形態(tài)學評分越差，其非整倍體發(fā)生率越高。在通過PGT-A檢測后，D5活檢獲得的整倍體胚胎移植時具有更高的活產率。因此，建議臨床工作中，對于發(fā)育速度較慢(D6囊胚)、擴張程度<4期的較差囊胚(ICM和TE評級低于BB級)進行PGT-A檢測更具臨床意義；經(jīng)PGT-A篩查獲得的整倍體胚胎，胚胎形態(tài)學評分在預測活產率中無明顯作用，建議優(yōu)先選擇發(fā)育速度較快(D5活檢)的整倍體胚胎進行移植。