富硒西蘭花中硒的賦存形態(tài)及其抗氧化性

陳清清，張澤洲，袁林喜，朱元元，尹雪斌,2，王張民,2*

(1.蘇州硒谷科技有限公司，江蘇省硒生物工程技術(shù)研究中心，江蘇 蘇州 215000；2．中國(guó)科技大學(xué) 蘇州研究院，功能農(nóng)業(yè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 蘇州 215123；3．宜春學(xué)院 生命科學(xué)與資源環(huán)境學(xué)院，江西 宜春 336000)

硒作為人體必需的微量元素之一，自從其營(yíng)養(yǎng)價(jià)值首次被發(fā)現(xiàn)后[1]，缺硒對(duì)人體可能引起的疾病成為研究的熱點(diǎn)。1973年，Rofruek等[2-3]發(fā)現(xiàn)硒是紅細(xì)胞內(nèi)谷胱甘肽過(guò)氧化物酶的必需組成成分，對(duì)磷脂氫過(guò)氧化物酶[4]和胞外谷胱甘肽過(guò)氧化物酶[5]的結(jié)構(gòu)和功能的進(jìn)一步研究，結(jié)果表明硒是這些酶類的必要成分，并在生物機(jī)體內(nèi)發(fā)揮如抗氧化、提高免疫力和保護(hù)肝臟等重要作用。大量的研究表明硒營(yíng)養(yǎng)不足會(huì)影響人體正常的生理代謝，會(huì)引發(fā)包括克山病，大骨節(jié)病，貧血性溶血及癌癥[6-7]等疾病。因此，每天合理補(bǔ)充硒，保證硒攝入，對(duì)滿足機(jī)體正常的生理代謝很有必要。

1 材料與方法

研究方法依富硒西蘭花中營(yíng)養(yǎng)成分組成及其硒含量、富硒西蘭花中四種溶性粗蛋白的組成及其結(jié)合態(tài)硒含量、四種溶性含硒粗蛋白態(tài)中含硒氨基酸的組成、以及四種溶性含硒粗蛋白的自由基清除能力的順序分別闡述。

富硒西蘭花總硒測(cè)定參照《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中硒的測(cè)定 GB 5009.93-2017》[13]氫化物原子熒光光譜法進(jìn)行總硒檢測(cè)分析。

1.1 材料與試劑

研究所用的富硒西蘭花由江蘇省硒生物工程技術(shù)研究中心提供，硒含量為87.5 mg/kg。

研究中所有的試劑半胱氨酸(L-Cysteine)、蛋氨酸(DL-Methionine)、L-硒代半胱氨酸(L-selenocysteine)、L-硒代蛋氨酸(L-selenomethionine)標(biāo)樣、2，3-二氨基萘(DAN)(2, 3-diaminaphthalene (DNA))和D-脫氧核糖(D- Deoxyribose)購(gòu)自Sigma-Aldrich公司。其他試劑均為分析純，購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，主要包括抗壞血酸、鄰苯三酚、2-硫代巴比妥酸(2-Thiobarbituric acid，TBA)、三氯化鐵(FeCl3)和過(guò)氧化氫(H2O2)。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器與設(shè)備

9230型原子熒光分光光度計(jì)、液相色譜-原子熒光聯(lián)用形態(tài)分析儀、紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)、臺(tái)式冷凍離心機(jī)、pH計(jì)、數(shù)顯恒溫振蕩器、磁力攪拌器、超聲波清洗器。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

以下所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)重復(fù)測(cè)定3次，

1.3.1 樣品預(yù)處理

富硒西蘭花樣品用超純水洗凈后，于55℃烘箱中烘干，粉粹機(jī)磨碎后過(guò)40目篩制成標(biāo)準(zhǔn)粉，干燥器內(nèi)保存待用。

1.3.2 富硒西蘭花含硒營(yíng)養(yǎng)成分的提取

1)核酸硒的提取

取西蘭花樣品10 g，加入2 mol/L的NaCl 溶液100 mL，沸水浴中提取，重復(fù)三次，合并上清液，氯仿-異戊醇法除去蛋白質(zhì)后，調(diào)節(jié)pH至2.0，放于冰箱中靜置24 h，離心后得核酸沉淀，用95%乙醇淋洗沉淀三次，烘干后測(cè)定硒含量。

2)多糖硒的提取

在1)西蘭花殘?jiān)屑尤?%的草酸溶液100 mL，沸水浴中提取，重復(fù)三次，合并濾液及1)操作中的廢液，氯仿-異戊醇法除去蛋白質(zhì)后，加入95%的乙醇500 mL，靜置24 h，離心后得到多糖沉淀，用85%乙醇洗滌沉淀三次，烘干后測(cè)定硒含量。

3)蛋白質(zhì)硒的提取

取10 g西蘭花樣品加入0.25 mol/L的NaOH溶液200 mL，50℃水浴中提取8h。在浸提液中緩緩加入(NH4)2SO4晶體至95%飽和，冰箱中靜置2 h，離心得蛋白質(zhì)沉淀，乙醇-乙醚混合液(2：1)洗滌沉淀三次，烘干后測(cè)定硒含量。

1.3.3 含硒粗蛋白的逐級(jí)提取與硒形態(tài)分析

制備富硒西蘭花凍干粉：

西蘭花樣品用超純水洗凈后，冷凍干燥，最后采用粉粹機(jī)磨碎，過(guò)40目篩制成粉，干燥器內(nèi)保存待用。

1)水溶性含硒粗蛋白的制備

取50 g富硒西蘭花凍干粉，加入超純水1000 mL，冰水浴中置于磁力攪拌器攪拌8h，4℃低溫離心后，取上清液，殘?jiān)俅渭尤?000 mL超純水后，重復(fù)上述操作一次，離心后取上清液，合并兩次上清液，添加(NH4)2SO4晶體至飽和狀態(tài)，隨后放入冰箱，溫度為4℃靜置24 h，離心后收集沉淀轉(zhuǎn)入透析袋，放入超純水中透析，直至用飽和BaCl2溶液檢驗(yàn)透析水中為陰性，將透析水進(jìn)行真空冷凍干燥，制備水溶性含硒粗蛋白晶體，并檢測(cè)硒濃度。

2)鹽溶性含硒粗蛋白的制備

在1)提取后剩余的殘?jiān)?，加?000 mL、0.5 mol/L的NaCl溶液，冰水浴中置于磁力攪拌器中攪拌8 h，除了加入(NH4)2SO4至半飽和，其他操作與水溶性蛋白提取相同。

3)醇溶性含硒粗蛋白的制備

在2)提取的殘?jiān)屑尤?5%的乙醇1000 mL，冰水浴中置于磁力攪拌器攪拌8 h，除了不加入(NH4)2SO4，其他操作與水溶性蛋白提取相同。

4)堿溶性含硒粗蛋白的制備

在3)提取的殘?jiān)屑尤?.1 mol/L的NaOH溶液1000 mL，冰水浴中置于磁力攪拌器中攪拌8 h，除了加入(NH4)2SO4至半飽和，其他操作與水溶性蛋白提取相同。

1.3.4 四種溶性含硒粗蛋白中的硒形態(tài)分析

稱取1)、2)、3)和4)制備的四種粗蛋白各稱取0.1 g，分別加入5 mL Tris-HCl超聲30 min后，依次加入纖維素酶，蛋白酶K，蛋白酶XIV，放入恒溫振蕩器中酶解，氫化物原子熒光光譜與液相色譜聯(lián)用分析蛋白酶解后的含硒氨基酸形態(tài)。

1.3.5 含硒粗蛋白對(duì)自由基的清除

1)含硒粗蛋白羥基自由基(·OH)的清除

分析1.3.3制備的四種粗蛋白對(duì)·OH的清除能力，采用D-脫氧核糖(DR)法[14]：在10 mL離心管中依次加入0.4 mL的KH2PO4-KOH緩沖液， 0.2、0.5、1.0、1.5、2.0和2.5mg/mL的蛋白樣品液0.1 mL，然后順序加入1.04 mmol/L的 EDTA 溶液、1 mmol/L的 FeCl3溶液、12 mmol/L 的H2O2溶液、60 mmol/L D-脫氧核糖(DR)溶液和2 mmol/L抗壞血酸溶液各0.1 mL，最后加入超純水，定容至1.0 mL。隨后置于37℃的恒溫水浴鍋中1 h，取出后迅速加入25%的HCl溶液和1% 的TBA 溶液各1.0 mL，置于100 ℃沸水中加熱15 min，取出、冷卻。若有混濁，置于離心機(jī)，調(diào)至10000 r/min離心15min，取上清液。選擇波長(zhǎng)為532nm，測(cè)定吸光度?！H清除率按公式(1)計(jì)算：

·OH清除率(%)

=[1-(A1-A2)/A0]×100%

(1)

其中A0：為空白液吸光度；

A1：為加入清除劑和D-脫氧核糖(DR)后吸光度；

A2：樣品吸光度。

(2)

其中As：對(duì)照組，不含待測(cè)物時(shí)吸光度；

Ac：試樣組，含待測(cè)物吸光度。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

論文中相關(guān)性分析、單因素方差分析和差異顯著性分析，采用SPSS 17.0 統(tǒng)計(jì)分析。采用sigma plot 12.5軟件繪制圖、表。

2 結(jié)果與分析

2.1 富硒西蘭花中含硒營(yíng)養(yǎng)成分分布規(guī)律

測(cè)定富硒西蘭花中核酸、多糖、粗蛋白和其他物質(zhì)中硒含量，由圖1可知，硒在富硒西蘭花中主要以蛋白硒形式存在，約占總硒含量的90.2%～91.5%，核酸硒與多糖結(jié)合硒量很少，不到總硒含量的5%，其他形式的硒約占4%。這與硒生物強(qiáng)化技術(shù)得到的其他富硒生物材料如富硒小麥、富硒玉米等相似[15-16]，即硒主要賦存為含硒粗蛋白。

圖1 富硒西蘭花中硒的主要結(jié)合形式與含量

2.2 四種溶性含硒粗蛋白中硒含量與形態(tài)分析

采用超純水、NaCl溶液、乙醇和NaOH溶液順序分離出水溶性、鹽溶性、醇溶性和堿溶性蛋白并測(cè)定硒含量，分了這四種溶性粗蛋白的比例，以及含硒粗蛋白的主要類型，其中四種溶性含硒粗蛋白的硒含量總和為富硒西蘭花的粗蛋白結(jié)合態(tài)硒的總硒含量。由表1數(shù)據(jù)結(jié)果，提取的可溶性蛋白中主要為水溶性蛋白和堿溶性蛋白，分別占25.9%、65.4%，但是鹽溶性蛋白和醇溶性蛋白所占比例較低，總共不到10%。其中蛋白結(jié)合硒量較高的為水溶性蛋白，堿溶性蛋白，水溶性蛋白結(jié)合硒量最高，約為415.7 mg/kg，占含硒粗蛋白總硒的比例也最高約為57.9%。其次是堿溶性蛋白結(jié)合硒量為245.3 mg/kg，占比為34.2%，鹽溶性蛋白和醇溶性蛋白結(jié)合硒量最少。

表1 四種溶性粗蛋白結(jié)合態(tài)硒的硒含量

將研究載體富硒西蘭花與其他研究載體富硒大蒜和富硒花生中四種含硒粗蛋白的結(jié)果相比較。岳晶念等發(fā)現(xiàn)富硒大蒜中水溶性蛋白為主要賦存形態(tài)，占可溶性蛋白總量的62.24%，且四種含硒溶性蛋白結(jié)合態(tài)的硒含量水溶性蛋白最高、堿溶性蛋白次之、醇溶性蛋白最低，而鹽溶性蛋白位于堿溶性和醇溶性蛋白之間[17]，這與論文中富硒西蘭花結(jié)果一致。而富硒花生中堿溶性蛋白為可溶性蛋白的主要存在形式，檢測(cè)后，其蛋白結(jié)合態(tài)硒含量也遠(yuǎn)遠(yuǎn)超于其他溶性蛋白，可達(dá)總蛋白結(jié)合態(tài)硒總量的93%[18]。

采用原子熒光與高效液相色譜連用連續(xù)分析富硒西蘭花中水溶性、鹽溶性、醇溶性和堿溶性蛋白由圖2可知，四種不同溶性含硒蛋白中主要硒氨基酸形式為硒代蛋氨酸(SeMet)、硒代半胱氨酸(Secys)、四價(jià)硒(Se4+)、硒甲基半胱氨酸(SeMecys)。其中水溶性蛋白中以Secys形式含量最高，約占38.4%，其次是SeMet(30.5%)、SeMecys(28.6%)，Se4+含量最低(2.3%)。堿溶性蛋白中以SeMet形式含量最高，約占40.4%，其次是Secys(32.5%)、SeMecys(25.8)，Se4+含量最低(1.1%)。鹽溶性蛋白和醇溶性蛋白主要硒氨基酸形式為SeMet、Secys，占總比例90%以上。這與其他研究載體富硒酵母、富硒小麥和富硒玉米等的硒氨基酸形態(tài)一致，含硒粗蛋白中硒代蛋氨酸為主要賦存形態(tài)，富硒酵母超過(guò)90%[19]，富硒小麥約90%[20]，富硒玉米超過(guò)95%[21]。

圖2 四種溶性蛋白中的硒的形態(tài)分析

2.3 四種溶性粗蛋白清除自由基的能力

圖3 四種溶性粗蛋白與羥基自由基(·OH)清除率之間的劑量-效應(yīng)關(guān)系

圖4 四種溶性粗蛋白與超氧陰離子清除率之間的劑量-效應(yīng)關(guān)系

3 結(jié)論

硒在富硒西蘭花中主要以蛋白硒形式存在，約占總硒含量的90.2%～91.5%，核酸硒與多糖結(jié)合硒量很少。

富硒西蘭花中粗蛋白主要以水溶性蛋白、堿溶性蛋白為主，超過(guò)90%。蛋白結(jié)合態(tài)硒含量以水溶性蛋白最高、堿溶性蛋白次之、鹽溶性蛋白再次之、醇溶性蛋白最低，水溶性和堿溶性蛋白結(jié)合硒量，分別約為415.7 mg/kg和 245.3 mg/kg。

四種溶性粗蛋白中硒主要賦存形式為硒氨基酸形式為硒代蛋氨酸(SeMet)、硒代半胱氨酸(Secys)、四價(jià)硒(Se4+)與硒甲基半胱氨酸(SeMecys)。其中，水溶性和堿溶性蛋白中硒主要以Secys、SeMet、SeMecys形式存在，而在鹽溶性和醇溶性蛋白中主要以Secys、SeMet形式存在。

四種不同溶性蛋白的抗氧化活性由弱到強(qiáng)的順序?yàn)椋核苄缘鞍?堿溶性蛋白>鹽溶性蛋白>醇溶性蛋白，且硒能夠增強(qiáng)四種溶性蛋白抗氧化能力。