基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探討鼻咽解毒膠囊治療鼻咽癌的作用機(jī)制

唐 鋒，高元峰，任香怡，歐陽婷，黎 旭

(湖南中醫(yī)藥大學(xué) 第一附屬醫(yī)院，湖南 長沙 410007)

鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma，NPC)是一種發(fā)生在鼻咽部上皮組織的惡性腫瘤，發(fā)病率居耳鼻咽喉惡性腫瘤之首[1]。鼻咽癌與EB病毒感染密切相關(guān)，遺傳、化學(xué)致癌、環(huán)境飲食等因素與鼻咽癌的發(fā)生有明顯相關(guān)性[2]。放射治療是無遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的NPC患者首要治療方法，局部進(jìn)展期則采取放療和化療綜合治療[3]。但放療和化療綜合治療后通常發(fā)生腺體萎縮、放射性腦損傷、骨髓抑制、肝腎毒性等不良反應(yīng)[4]?，F(xiàn)代中醫(yī)認(rèn)為鼻咽癌的發(fā)生內(nèi)則正氣虛弱，臟腑功能失調(diào)；外則是邪毒乘虛而入，內(nèi)外相互影響，逐漸結(jié)聚而成癌腫[5 ]。臨床實(shí)踐證明，以放化療為主，中藥治療作為輔助的綜合治療方案，可以一定程度上改善鼻咽癌患者的預(yù)后，提高5年生存率[6，7]。鼻咽解毒膠囊由黃芪、黃連、黃芩、白花蛇舌草、甘草5味中藥組成，是湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院院內(nèi)制劑，具有清熱解毒，扶正培本之功效，可以用于鼻咽炎、鼻咽癌及EB病毒陽性的鼻咽癌治療。鼻咽解毒膠囊已有文獻(xiàn)報道主要集中在化學(xué)成分及質(zhì)量控制方法的研究[8-9]。研究表明：黃芪多糖、黃芩中的黃芩素和漢黃芩素均可抑制鼻咽癌CNE2細(xì)胞增殖[10-12]；黃連中的黃連素和甘草中的甘草素對鼻咽癌CNE-2細(xì)胞有放療增敏作用[13，14]；白花蛇舌草水提物對鼻咽癌細(xì)胞株CNE-1有放療增敏作用[15]。然而，由于中藥復(fù)方化學(xué)成分的復(fù)雜性，使得鼻咽解毒膠囊抗鼻咽癌的作用機(jī)制并不明確。中藥方劑是按照“君、臣、佐、使”進(jìn)行組分配伍，通過多味中藥的配合實(shí)現(xiàn)對機(jī)體紊亂狀態(tài)的調(diào)節(jié)。中醫(yī)藥治療疾病的特色是中藥復(fù)方對復(fù)雜疾病的辨證論治，強(qiáng)調(diào)整體性。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)作為一門新興學(xué)科，與中藥復(fù)方“多成分、多途徑、多靶點(diǎn)”協(xié)同作用的理念相吻合，已被廣泛用于中藥靶點(diǎn)的預(yù)測及作用機(jī)制的研究[16-18]。本文運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法探討鼻咽解毒膠囊治療鼻咽癌的活性成分、作用靶點(diǎn)，并闡釋其作用機(jī)制，為進(jìn)一步實(shí)驗及臨床研究提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 活性成分收集與篩選

中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫和分析平臺(TCMSP，http://ibts.hkbu.edu.hk/LSP/tcmsp.php)[19]通過整合藥效學(xué)、藥物動力學(xué)、靶標(biāo)預(yù)測以及網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)分析等方法和數(shù)據(jù)，提供了一個系統(tǒng)層面的視角來研究中藥復(fù)雜成分的潛在生物學(xué)機(jī)制。將黃芪、黃連、黃芩、白花蛇舌草、甘草5種中藥分別輸入TCMSP 數(shù)據(jù)庫進(jìn)行成分檢索，通過查閱相關(guān)文獻(xiàn)并以口服生物利用度(OB)值≥ 30%藥物相似性(DL)值≥ 0.18作為篩選條件，得到鼻咽解毒膠囊的活性成分。

1.2 活性成分靶點(diǎn)預(yù)測

TCMSP平臺利用SysDT藥物-靶標(biāo)預(yù)測模型[20]預(yù)測活性化合物靶點(diǎn)，通過TCMSP平臺尋找候選化合物相關(guān)的潛在靶點(diǎn)，并根據(jù)得到的潛在靶點(diǎn)在TCMSP平臺中找出相關(guān)的疾病，將候選化合物與其潛在的靶點(diǎn)、潛在靶點(diǎn)對應(yīng)疾病進(jìn)行整理。并利用UniProt(http://www.uniprot.org)數(shù)據(jù)庫中的Uni-ProtKB搜索功能對不同來源的靶點(diǎn)進(jìn)行檢索，設(shè)置背景為Homo sapiens，得到所有靶點(diǎn)的official gene symbol，用于后續(xù)分析。

1.3 網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建與分析使用

Cytoscape3.6.1軟件(http://www.cytoscape.org/)對候選化合物-潛在靶點(diǎn)和潛在靶點(diǎn)-疾病網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行構(gòu)建。網(wǎng)絡(luò)圖中的節(jié)點(diǎn)分別為化學(xué)成分、潛在靶點(diǎn)、相應(yīng)疾病?；瘜W(xué)成分與潛在靶點(diǎn)或潛在靶點(diǎn)與相應(yīng)疾病之間有相互作用關(guān)系的以邊相連。使用Cytoscape3.6.1 軟件中Network Analysis插件對相應(yīng)網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行拓?fù)湫再|(zhì)分析。

1.4 靶點(diǎn)的通路分析

為了進(jìn)一步了解上述篩選出的靶標(biāo)蛋白基因(Degree≥5)的功能以及在信號通路中的作用，將篩選得到的作用靶點(diǎn)導(dǎo)入DAVID6.8 數(shù)據(jù)庫(https://david.ncifcrf.gov/home.jsp)，通過輸入靶基因名稱列表并限定物種為Homo sapiens，將所有靶基因名稱校正為其官方名稱(official gene symbol)，經(jīng)上述數(shù)據(jù)庫檢索和轉(zhuǎn)化操作，設(shè)定閾值P<0.05，進(jìn)行GO生物學(xué)過程富集分析和KEGG信號通路富集分析，選取前20個KEGG富集條目通過Omishare平臺(http://www.omicshare.com/tools/index.php/)進(jìn)行可視化處理。

2 結(jié)果

2.1 活性化合物的篩選

通過TCMSP共收集了鼻咽解毒膠囊中化合物1190個，其中黃連96個、黃芪174個、黃芩286個、白花蛇舌草74個、甘草560個。以O(shè)B≥30%和DL≥0.18并結(jié)合文獻(xiàn)報道的活性化合物進(jìn)行分析，共篩選出33個活性化合物。表1為33個活性化合物基本信息。

表1 鼻咽解毒膠囊中33個活性化合物基本信息

2.2 化合物-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與分析

通過TCMSP平臺尋找與33個候選化合物相關(guān)的潛在靶點(diǎn)，有6個活性成分未收錄與之對應(yīng)的靶點(diǎn)，故針對有相應(yīng)靶點(diǎn)的27個活性成分，通過Cytoscape3.6.1軟件繪制出活性成分-靶點(diǎn)相互作用網(wǎng)絡(luò)圖(圖1)?；衔?靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)共包括158個節(jié)點(diǎn)(27個化合物節(jié)點(diǎn)和131個靶點(diǎn)節(jié)點(diǎn))和275條邊，其中綠色節(jié)點(diǎn)表示化合物，紅色節(jié)點(diǎn)表示靶點(diǎn)，每條邊表示化合物與靶點(diǎn)之間的相互作用關(guān)系。在網(wǎng)絡(luò)中，一個節(jié)點(diǎn)的度(Degree)表示網(wǎng)絡(luò)中和節(jié)點(diǎn)相連的路線的條數(shù)。根據(jù)網(wǎng)絡(luò)的拓?fù)鋵W(xué)性質(zhì)篩選Degree較大的節(jié)點(diǎn)進(jìn)行分析，這些節(jié)點(diǎn)在整個網(wǎng)絡(luò)中起到樞紐的作用，可能是關(guān)鍵的化合物或靶點(diǎn)。表2和表3列出了化合物-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)中關(guān)鍵的化合物和靶點(diǎn)的Degree。該網(wǎng)絡(luò)中，每個化合物的平均靶點(diǎn)數(shù)目為11個，每個靶點(diǎn)平均與3個化合物相互作用。網(wǎng)絡(luò)中存在一個化合物與多個靶點(diǎn)之間的相互作用，同時也存在不同化合物共同作用于同一個靶點(diǎn)的現(xiàn)象，體現(xiàn)了鼻咽解毒膠囊多成分-多靶點(diǎn)作用的機(jī)制。對于化合物，槲皮素(M98)的連接度最高，能與87個靶點(diǎn)蛋白發(fā)生相互作用；其次山奈酚(M422)作用靶點(diǎn)55個；另外芒柄花黃素(M392)、Shinpterocarpin(M4891)、漢黃芩素(M173)都能與36個靶點(diǎn)蛋白發(fā)生相互作用。對于靶點(diǎn)，Degree最高的為雌激素受體(NR3C4)對應(yīng)了25個化合物，其次是雌激素受體蛋白(ESR1)、前列腺素G/H合成酶2(PTGS2)、原癌基因絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶Pim-1(PIM1)及細(xì)胞周期素A2(CCNA2)均對應(yīng)了23個化合物。另外過氧化物酶體增殖物激活受體γ(PPARG)和誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(NOS2)均對應(yīng)了22個化合物。

圖1 鼻咽解毒膠囊化合物-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)

表2 化合物-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)的關(guān)鍵化合物節(jié)點(diǎn)

表3 化合物-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)的關(guān)鍵靶標(biāo)節(jié)點(diǎn)

2.3 鼻咽解毒膠囊靶點(diǎn)-疾病相互作用網(wǎng)絡(luò)

選取化合物-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)中選取Degree≥5的靶點(diǎn)構(gòu)建靶點(diǎn)-疾病網(wǎng)絡(luò)。該網(wǎng)絡(luò)由201個節(jié)點(diǎn)組成，包括31個靶點(diǎn)節(jié)點(diǎn)，170個疾病節(jié)點(diǎn)和341條邊，其中紅色節(jié)點(diǎn)表示靶點(diǎn)，藍(lán)色節(jié)點(diǎn)表示疾病，每條邊則表示靶點(diǎn)與疾病之間的相互作用關(guān)系(圖2)。39個靶點(diǎn)中有 8個靶點(diǎn)在靶點(diǎn)-疾病網(wǎng)絡(luò)中沒有相對應(yīng)的疾病，推測鼻咽解毒膠囊復(fù)方中還存在暫時未被發(fā)現(xiàn)的作用途徑。該網(wǎng)絡(luò)中靶點(diǎn)和疾病表現(xiàn)出復(fù)雜的相互作用模式，這進(jìn)一步體現(xiàn)出中藥復(fù)方多靶點(diǎn)-多疾病的復(fù)雜作用模式。該網(wǎng)絡(luò)包含的疾病根據(jù)Degree由大到小分別為腫瘤(Neoplasms)，心血管疾病(Cardiovascular disease)，神經(jīng)系統(tǒng)疾病Nervous System Diseases)，呼吸道疾病(Respiratory tract diseases)等。由此推測鼻咽解毒膠囊可能在這些疾病的治療過程中發(fā)揮一定的作用。

圖2 鼻咽解毒膠囊靶點(diǎn)-疾病網(wǎng)絡(luò)

2.4 GO生物功能富集分析

采用DAVID 6.8數(shù)據(jù)庫對Degree≥5潛在作用靶點(diǎn)進(jìn)行GO基因本體分類富集分析，確定了160個GO條目。其中，生物學(xué)過程(BP)相關(guān)的條目最多，有100個，主要涉及RNA聚合酶II啟動子轉(zhuǎn)錄的調(diào)控、對藥物的反應(yīng)、肽基絲氨酸磷酸化、血管生成、氧化還原過程等；分子功能(MF)相關(guān)的條目43個，主要涉及蛋白結(jié)合、酶結(jié)合、蛋白質(zhì)均聚活性、蛋白絲氨酸/蘇氨酸激酶活性、ATP結(jié)合等；細(xì)胞組成(CC)相關(guān)的條目17個，主要涉及細(xì)胞核、質(zhì)膜、胞漿、細(xì)胞質(zhì)、核質(zhì)等；前20條富集結(jié)果見表2。結(jié)果提示與鼻咽解毒膠囊治療鼻咽癌相關(guān)的關(guān)鍵靶標(biāo)可能與蛋白結(jié)合、細(xì)胞核、質(zhì)膜、胞漿、細(xì)胞質(zhì)、核質(zhì)、酶結(jié)合等生物功能有一定關(guān)系。

表4 前20條GO生物功能分析

2.5 KEGG通路富集分析

利用DAVID 6.8數(shù)據(jù)庫對Degree≥5潛在作用靶點(diǎn)進(jìn)行KEGG通路富集分析，共獲得45條富集結(jié)果。限定P<0.05，前20條KEGG代謝通路及其相關(guān)信息見圖3。前20條通路主要包括肺小細(xì)胞癌通路(Small cell lung cancer)、癌癥通路(Pathways in cancer)、病毒致癌(Viral carcinogenesis)、結(jié)直腸癌(Colorectal cancer)、前列腺癌(Prostate cancer)等腫瘤疾病通路；EB病毒感染(Epstein-Barr virus infection)、血管內(nèi)皮生長因子信號通路(VEGF signaling pathway)等與鼻咽癌密切相關(guān)的信號通路。另外還包括雌激素信號途徑(Estrogen signaling pathway)、甲狀腺激素信號途徑(Thyroid hormone signaling pathway)、催乳素信號途徑(Prolactin signaling pathway)等與內(nèi)分泌系統(tǒng)相關(guān)的信號通路；T細(xì)胞受體信號通路(T cell receptor signaling pathway)等與免疫系統(tǒng)相關(guān)的通路。鼻咽解毒膠囊的有效成分可能通過作用于這些通路協(xié)同發(fā)揮治療鼻咽癌的作用。

圖3 鼻咽解毒膠囊治療鼻咽癌KEGG通路富集分析

3 討論

鼻咽癌多被認(rèn)為因火毒或風(fēng)熱所致，臨床治療強(qiáng)調(diào)清熱解毒。鼻咽癌放、化療后常見證型雖包括陰津耗傷、脾胃失調(diào)及氣血虧虛等，但陰津耗傷是傷陰，脾胃失調(diào)為傷氣，最終都會導(dǎo)致氣血虧虛顯示為虛弱體質(zhì)，所以在清熱解毒的同時，應(yīng)重視疏肝解郁、行氣活血，又要強(qiáng)調(diào)補(bǔ)益氣血以培補(bǔ)元?dú)?。鼻咽解毒膠囊方中黃芪具有補(bǔ)氣升陽、益衛(wèi)固表等功效，可補(bǔ)益中氣，振興運(yùn)化。黃連、黃芩、白花蛇舌草均苦寒，能清熱解毒，治療癰腫瘡毒。甘草具有補(bǔ)脾益氣、緩急止痛、清熱解毒、調(diào)和諸藥等功效，與黃芪同用益氣升陽，同時可增強(qiáng)黃芪、黃芩、白花蛇舌草之清熱解毒的功效。全方扶正祛邪，改善患者氣虛體質(zhì)，同時解毒養(yǎng)陰，起到平和抗癌的作用。

本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法研究鼻咽解毒膠囊中5味中藥的有效成分并預(yù)測潛在靶點(diǎn)，同時構(gòu)建了化合物-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)，從系統(tǒng)水平分析化合物與靶點(diǎn)相互作用關(guān)系。根據(jù)化合物-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)分析，度值排名前15的化合物有10個與抗鼻咽癌密切相關(guān)。研究表明，槲皮素能通過caspase-3途徑抑制人鼻咽癌HEN1細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，并具有細(xì)胞周期特異性[21]。另外槲皮素還可通過下調(diào)Bcl-2蛋白表達(dá)，促進(jìn)人鼻咽癌CNE2細(xì)胞凋亡[22]；山奈酚可以促進(jìn)細(xì)胞凋亡并抑制腫瘤細(xì)胞增殖，其機(jī)制與降低抗凋亡蛋白Bcl2和增加促凋亡蛋白Bax的表達(dá)相關(guān)[23]。另外，山奈酚在體內(nèi)和體外均能抑制血管內(nèi)皮生長因子分泌，從而抑制血管生成達(dá)到抗腫瘤的效果[24]；芒柄花黃素可能通過上調(diào)BAX/Bc l-2和下調(diào)p-Akt/Akt誘導(dǎo)人鼻咽癌細(xì)胞株HONE1凋亡[25]；此外，黃芩素[11]、漢黃芩素[12]、異甘草素、小檗堿、熊果酸、白楊素、毛蕊異黃酮等化合物也有抗鼻咽癌的作用[26-30]。由此推測槲皮素、山奈酚、芒柄花黃素、漢黃芩素、黃芩素等黃酮成分為主要有效成分。另外Shinpterocarpin、千層紙素、巴馬亭、藥根堿、齊墩果酸與鼻咽癌相關(guān)報道較少，有待進(jìn)一步研究?；衔?靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)中NR3C4、ESR1、PTGS2、PIM1、PPARG、NOS2等處于網(wǎng)絡(luò)的中心位置，可能為鼻咽解毒膠囊抗鼻咽癌重要的靶點(diǎn)。ESR1基因SNP rs9322354位點(diǎn)多態(tài)性與鼻咽癌存在顯著的相關(guān)性[31]。PTGS2作為一個血管生成促進(jìn)因子及一種潛在的癌基因，在乳腺癌、小細(xì)胞肺癌等及鼻咽癌在內(nèi)多種頭頸部惡性腫瘤中表達(dá)上調(diào)，在鼻咽癌中，EB病毒的癌蛋白LMP1可通過NFKB介導(dǎo)PTGS2的表達(dá)，從而使VEGF的表達(dá)增高，最后達(dá)到血管生成[32]。而PTGS2抑制劑也被證明能減少鼻咽癌血管生成[33]。癌基因PIM-1通過調(diào)控mir-17-5p的表達(dá)，可以調(diào)控鼻咽癌腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移[34]。PPARG參與控制單核細(xì)胞分化成熟、誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞凋亡、誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞分化和凋亡、抑制炎性反應(yīng)、抑制腫瘤血管生成等過程。近年來對PPARG的研究主要集中于腫瘤細(xì)胞分化、凋亡、抑制腫瘤細(xì)胞浸潤、抑制炎性反應(yīng)等生理病理過程[35]。誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(NOS2)在鼻咽癌組織中呈高表達(dá)，并與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和T分期密切關(guān)聯(lián)，提示其過度表達(dá)與鼻咽癌的發(fā)生、發(fā)展、浸潤和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[36]。推測鼻咽解毒膠囊可能通過作用于ESR1、PTGS2、PIM1、PPARG、NOS2等靶點(diǎn)發(fā)揮抗鼻咽癌作用。另外NR3C4與鼻咽癌相關(guān)報道較少，有待進(jìn)一步研究。KEGG通路富集分析發(fā)現(xiàn)，鼻咽解毒膠囊潛在作用通路直接影響多種腫瘤疾病，也有間接影響內(nèi)分泌系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)等多條與腫瘤形成發(fā)展相關(guān)的途徑。鼻咽解毒膠囊中多種化學(xué)成分可與多個靶點(diǎn)相互作用，并通過多種信號途徑起作用，反映出中藥多成分、多靶點(diǎn)、多途徑和整體調(diào)節(jié)的特點(diǎn)。然而，本研究僅從網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)角度探討了鼻咽解毒膠囊有效成分治療鼻咽癌作用機(jī)制，其具體臨床機(jī)制尚不明確。因此，本課題組后期將通過實(shí)驗對預(yù)測的結(jié)果進(jìn)行驗證和深入研究。