超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法測定鹽酸諾氟沙星原料藥有關(guān)物質(zhì)

陳 銳，徐 皓，胡光華

（1.長春市食品藥品檢驗中心化學(xué)室，吉林 長春 130000；2.長春市食品藥品檢驗中心抗生素室，吉林 長春 130000）

鹽酸諾氟沙星為喹諾酮類藥物是一種人工合成的、抗菌譜廣泛的高效抗菌藥[1]。鹽酸諾氟沙星作用于細菌DNA旋轉(zhuǎn)酶和拓撲異構(gòu)酶Ⅳ與其形成復(fù)合物，抑制細菌DNA的合成與復(fù)制而導(dǎo)致細菌死亡。主要用于治療敏感細菌（葡萄球菌、肺炎球菌、腸球菌）引起的泌尿道、呼吸道及胃腸道感染。為有效控制鹽酸諾氟沙星的質(zhì)量, 對該原料藥有關(guān)物質(zhì)測定方法進行研究，對含量大于0.1%的雜質(zhì)運用HPLCMS聯(lián)用進行定量分析，并使用質(zhì)譜對雜質(zhì)進行定性分析，為鹽酸諾氟沙星建立安全有效的質(zhì)量標準提供研究參考。

1 材料與方法

1.1 藥品、試劑及儀器

鹽酸諾氟沙星原料藥(常州方圓藥業(yè)有限責(zé)任公司，批號：191025) ；諾氟沙星雜質(zhì)A（中國食品藥品檢定研究院，批號：130610-201909）；諾氟沙星雜質(zhì)B（中國食品藥品檢定研究院，批號：130611-201901） 乙腈為色譜純，其余試劑為分析純，水為去離子水。

HP1100高效液相色譜儀（Agilent）；ZMDMicromass電噴霧質(zhì)譜儀（美國waters）； AB265-S電子天平（德國meuler公司）

1.2 檢測條件

HP1100高效液相色譜儀（Agilent），色譜柱：ODS柱（250mm×4.6mm，5μm），流動相： 0.025mol/L磷酸（用三乙胺調(diào)節(jié)PH至3.0）-乙腈（84：16），流速為1mL/min，樣溫為室溫，進樣方式為自動進樣。ZMDMicromass電噴霧質(zhì)譜儀（美國waters），ESI離子源，正離子掃描， 3.0kV的毛細管電壓，電噴霧接口干燥氣(N2)流速為540L/h,離子源溫度為100℃；錐孔電壓為30V，脫溶劑氣溫為130℃；質(zhì)量數(shù)掃描范圍m/z：100～800。

2 方法與結(jié)果

2.1 各溶液的制備

精密稱取鹽酸諾氟沙星原料藥10mg，置100ml量瓶中，加適量流動相進行溶解并稀釋至刻度，搖勻，精密量取5 m l，置于2 5 m l量瓶中，用流動相稀釋至刻度，搖勻，用0.22μm濾膜濾過，作為供試品溶液；精密量取上述溶液1ml，置100ml量瓶中，加流動相稀釋至刻度，搖勻，作為對照溶液；采用自身對照法，利用諾氟沙星的峰對雜質(zhì)進行含量計算，其中有A和B的含量大于0.1%。

另精密稱取雜質(zhì)A和雜質(zhì)B對照品適量，置于200ml量瓶中，加流動相溶解并稀釋至刻度，搖勻，精密量取適量， 用流動相定量稀釋制成質(zhì)量濃度分別為20.0μg/ml的雜質(zhì)A和B混合對照品溶液。

2.2 線性關(guān)系考察

精密量取混合對照品溶液，按稀釋倍數(shù)為1、1.2、1.5、2、3、6依次逐級稀釋，定容，制得6個濃度梯度的系列混合對照品溶液，按照上述質(zhì)譜條件測定，以峰面積對進樣量濃度進行線性回歸，繪制標準曲線，求得各成分回歸方程、r、線性范圍。雜質(zhì)A的回歸方程為Y=1.69X+10566×C，r=0.9998，線性范圍為2.934-11.683μg/ml；雜質(zhì)B的回歸方程為Y=1.35X+32451×C，r=0.9999，線性范圍為5.623-28.625μg/ml。

2.2 系統(tǒng)適用性實驗

取供試液溶液進樣，對各組分峰的分離度進行計算，均符合規(guī)定。

2.3 專屬性考察，

精密稱取鹽酸諾氟沙星原料藥，分別制備酸破壞樣品溶液，堿破壞樣品溶液，氧化破壞樣品溶液，光照破壞樣品溶液，高溫破壞樣品溶液。經(jīng)破壞后產(chǎn)生的降解產(chǎn)物在上述色譜條件下，與主峰的分離度都較好。

2.4 穩(wěn)定性試驗

取鹽酸諾氟沙星原料藥，按“2.1”中的方法進行制備，在0、1、2、4、8、12、24 h時分別進樣進行測定，記錄峰面積。結(jié)果：諾氟沙星各時間點峰面積的RSD=0.72%，說明供試液在24h之內(nèi)的穩(wěn)定性較好。

2.5 精密度試驗

在上述色譜條件下，對“2.1”中配制的供試液連續(xù)進樣5次，計算雜質(zhì)A和B峰面積的RSD分別為0.58%和0.67%，說明本實驗方法精密度良好。

2.6 檢出限考察

用流動相將供試品溶液逐步稀釋，并依次進樣檢測，當信噪比 (S/N) 為3時，雜質(zhì)A和B的檢出限均為0.1ng。

2.7 定量限考察

用流動相將供試品溶液逐步稀釋，并依次進樣檢測，當信噪比 (S/N) 為10時，雜質(zhì)A和B的定量限分別為0.2578ng和0.2842ng。

2.8 加樣回收實驗

精密稱取已測得雜質(zhì)A、雜質(zhì)B含量的鹽酸諾氟沙星9份， 每3份分別加入高、中、低3個不同濃度的雜質(zhì)A和雜質(zhì)B的混合對照品溶液，按“2.1”項下方法制備供試品溶液，按上述質(zhì)譜條件進行測定，雜質(zhì)A 的平均加樣回收率為99.89%，RSD=0.79%；雜質(zhì)B的平均加樣回收率為100.52%，RSD=0.82%。

2.9 樣品測定

取5個批次的樣品進行檢測，按上述方法進行測定，結(jié)果均檢出雜質(zhì)A和B，結(jié)果見表1。

表1 樣品測定結(jié)果

2.10 結(jié)構(gòu)解析

對雜質(zhì)進行質(zhì)譜檢測并提取雜質(zhì)A和B質(zhì)譜全掃描圖，結(jié)果雜質(zhì)A的母離子m/z為269.66，雜質(zhì)B的母離子m/z為293.30。對其進行二級質(zhì)譜掃描，確定其分子式和結(jié)構(gòu)式，結(jié)果見表2。

表2 鹽酸諾氟沙星雜質(zhì)A、B的質(zhì)譜數(shù)據(jù)

3 討 論

本研究中選用的諾氟沙星原料藥符合企業(yè)注冊標準。選擇0.025mol/L磷酸（用三乙胺調(diào)節(jié)PH至3.0）-乙腈（84：16）作為流動相可使主成分峰以及各有關(guān)物質(zhì)峰均實現(xiàn)良好的分離，有關(guān)物質(zhì)可被有效檢出。根據(jù)質(zhì)譜對含量大于0.1%的雜質(zhì)A和B進行解析，表明該方法可簡便快速并以較高的專屬性尋找諾氟沙星原料藥中的雜質(zhì)。同時依據(jù)解析過程可推測雜質(zhì)A可能是在原料藥合成過程中引入，雜質(zhì)B的形成可能是在酸性條件下發(fā)生了脫羧反應(yīng)或在氧化條件下發(fā)生了哌嗪環(huán)的氧化反應(yīng)。本研究為鹽酸諾氟沙星原料藥質(zhì)量標準的建立以及雜質(zhì)的檢出方面提供了理論依據(jù)。