維生素C通過胰島素信號通路增強秀麗隱桿線蟲抗氧化作用

傅雯 柏樺 王瑤 李恩霜 錢玉霞 楊嬌 鄒偉

摘 要：目的：利用秀麗隱桿線蟲為模式生物，研究維生素C在秀麗隱桿線蟲體內的抗氧化效應及其機制。方法：分別以含有0.05、0.25、0.5 mg/mL維生素C的NGM培養(yǎng)基飼養(yǎng)秀麗隱桿線蟲，測定不同濃度維生素C飼養(yǎng)線蟲體內超氧化物歧化酶（SOD）和過氧化氫酶（CAT）的含量，同時檢測0.25 mg/mL的維生素C飼養(yǎng)線蟲age-1、daf-2、daf-16、sir-2.1、clt-1基因mRNA變化。在高氧環(huán)境中，干擾0.25 mg/mL維生素C飼養(yǎng)線蟲daf-2、daf-16基因表達檢測線蟲的存活情況，觀察0.25 mg/mL維生素C飼養(yǎng)線蟲DAF-16入核情況。結果：0.25 mg/mL的維生素C提高秀麗隱桿線蟲體內SOD和CAT活力，在高氧環(huán)境中，0.25 mg/mL的維生素C降低age-1、daf-2基因表達，提高daf-16基因表達，同時增加DAF-16蛋白入核。結論：維生素C通過DAF-16胰島素信號通路增強秀麗隱桿線蟲抗氧化作用。

關鍵詞：秀麗隱桿線蟲;抗氧化作用;維生素C;胰島素信號途徑

及時消除機體內的自由基將會減少人類很多衰老疾病，如糖尿病、老年癡呆癥等。維生素C有兩種異構體，分別是L型和D型，其中L型抗壞血酸是一種良好的水溶性抗氧化劑，廣泛存在于新鮮的蔬菜、水果中，人體自身不能合成需通過進食獲取[1-3]。維生素C能維持人體紅細胞ATP酶以及超氧化物歧化酶（SOD）活性，在起到降低血漿丙二醛和鉀離子含量的作用的同時，也可以清除體內多種有害自由基，包括超氧負離子、羥自由基、有機自由基、有機過氧基等，從而保護機體免受自由基的破壞[4-5]。

近年來研究發(fā)現(xiàn)，不同的維生素C濃度對抗氧化作用的調節(jié)不同，高濃度的條件下維生素C具有促氧化作用，在細胞外液中產生過氧化氫（H2O2）后進入細胞，加速產生更多的活性氧（ROS）損傷DNA，造成細胞膜功能障礙[6]。適當濃度維生素C對衰老大鼠紅細胞的抗氧化能力具有修復作用[7]，不同質量濃度的維生素C可以降低亞硝酸鹽對匙吻鱘仔魚脅迫作用[8]，在一定濃度范圍內維生素C可促進維生素D3活化，從而在降低體內的氧化應激水平時可以同步提高機體的抗氧化能力[9]。維生素C在秀麗隱桿線蟲體內調節(jié)抗氧化的分子機制尚不完善，基于對秀麗隱桿線蟲機制的探索操作易行，且其與人類的遺傳物質相似，可用于代謝功能研究[10]。因此，以秀麗隱桿線蟲為模式生物，測定其體內的抗氧化酶活力、相關基因（age-1、daf-2、daf-16、sir-2.1、clt-1等）的表達水平。其次，在高氧環(huán)境中，通過基因干擾的方法探討維生素C在秀麗隱桿線蟲體內抗氧化過程中起的作用及其調節(jié)機制。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

維生素C，上海生工生物工程有限公司;SOD試劑盒、CAT試劑盒，南京建成生物工程研究所;RNA提取試劑盒，寶生物工程（大連）有限公司;c-DNA合成試劑盒、SYBR Green，天根生化科技（北京）有限公司;q-PCR引物，由上海生工生物工程有限公司合成;daf-16（ot971[daf-16：GFP]）秀麗隱桿線蟲株（以下簡稱daf-16：GFP秀麗隱桿線蟲株），用綠色熒光蛋白將DAF-16蛋白進行熒光標記，由云南大學微生物重點實驗室饋贈。

1.2 儀器與設備

倒置熒光顯微鏡，日本Nikon公司;超聲破碎儀，寧波新芝生物科技公司;酶標儀，鄭州安圖實驗儀器有限公司;低溫高速離心機，美國貝克曼公司;PCR儀器，德國Biometra公司;電泳儀、凝膠成像系統(tǒng)，美國Bio-Rad公司;實時熒光定量PCR儀，德國Eppendorf公司。

1.3 方法

1.3.1 秀麗隱桿線蟲培養(yǎng) 接種線蟲于生長培養(yǎng)基（NGM）中，待線蟲大量產卵后進行同步化得到蟲卵。4 000 r/min離心30 s后收集蟲體和蟲卵于15 mL離心管中，去上清液，加入次氯酸鈉200 μL和5 mol/L氫氧化鈉50 μL，邊震蕩邊觀察直至蟲體破碎，立即加入M9至管中14 mL刻度處，4 000 r/min離心2 min，去上清液。加入M9至管中14 mL刻度處，4 000 r/min離心2 min沖洗4次。留1 mL液體混勻后加入到培養(yǎng)皿中，補充適量的M9。放置于20攝氏度的恒溫箱培養(yǎng)12 h，待蟲卵孵化，將其加入到新鮮NGM培養(yǎng)基中長至未產卵的成蟲階段備用。

1.3.2 抗氧化酶活力測定 將同步化后L1期線蟲分別加入含有0、0.05、0.25、0.5 mg/mL維生素C的NGM平板中培養(yǎng)2 d后，收集至EP管。M9洗滌并加入200 μL生理鹽水于超聲破碎儀上破碎，取上清液，按照超氧化物歧化酶（SOD）和過氧化氫酶（CAT）試劑盒的操作步驟測定SOD、CAT活力。實驗重復3次。

1.3.3 實時熒光定量PCR 線蟲同步化后收集蟲卵孵化L1線蟲，將L1線蟲加至普通NGM平板或維生素C的NGM平板中進行培養(yǎng)，48 h后收集線蟲。按照寶生物工程（大連）有限公司的RNA提取試劑盒的步驟提取線蟲的總RNA，按照天根生化科技有限公司的逆轉錄試劑盒的步驟進行逆轉錄反應合成c-DNA，并進行實時熒光定量PCR。我們以gpd-1為內參基因，用2-ΔΔCt計算0.25 mg/mL維生素C處理組較之對照組age-1、daf-2、daf-16、sir2.1、clt-1基因轉錄水平的差異，引物序列見表1。

1.3.4 線蟲RNAi干擾 接種HT115菌株、age-1以及daf-16基因干擾株于5 mL含100 μg/mL的氨芐培養(yǎng)基中培養(yǎng)8 h，取300 μL菌液加至含1 mmol/L IPTG（異丙基-β-D-硫代半乳糖苷）和100 μg/mL AMP的NGM培養(yǎng)基上并吹干，20 ℃恒溫箱培養(yǎng)12 h，誘導小RNA的生成。將L1線蟲加入成功誘導出小RNA生成的平板中，培養(yǎng)48 h，收集平板上的線蟲進行后續(xù)實驗。

1.3.5 線蟲急性氧化應激實驗 將野生型線蟲、0.25 mg/mL維生素C飼養(yǎng)線蟲、0.25 mg/mL維生素C飼養(yǎng)age-1RNAi線蟲和0.25 mg/mL維生素C飼養(yǎng)daf-16 RNAi線蟲轉移到含1‰ H2O2及對應濃度維生素C平板（加入產卵抑制劑FUDR）中，每組3板，每板30條線蟲左右。每間隔2 d觀察線蟲存活情況，直至所有平板有線蟲死亡為止，實驗重復3次。

1.3.6 線蟲熒光觀察 將daf-16：GFP L4期線蟲和0.25 mg/mL維生素C飼養(yǎng)daf-16：GFP L4期線蟲轉移到含1‰ H2O2和對應濃度維生素C平板（加入產卵抑制劑FUDR）1 d后，熒光顯微鏡下觀察DAF-16入核情況（n=20），實驗重復3次。

1.3.7 數(shù)據(jù)分析 采用GraphPad軟件進行作圖和統(tǒng)計學分析，組間比較采用單因素方差分析，采用卡方檢驗進行率的比較，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果與分析

2.1 不同濃度維生素C對秀麗隱桿線蟲體內SOD和CAT活力的影響

將L1線蟲飼養(yǎng)于含0、0.05、0.25、0.5 mg/mL的維生素C NGM平板2 d后，收集未產卵的成蟲，分別測定SOD和CAT活力，與對照組相比，0.05 mg/mL維生素C飼養(yǎng)線蟲SOD活力無明顯增強（P>0.05），將濃度提高至0.25 mg/mL后，SOD活力增強為261.7%（P<0.05），濃度提升至0.5 mg/mL，SOD活力增強為116%（P<0.05）。此外與對照組相比，0.05 mg/mL維生素C飼養(yǎng)線蟲CAT活力無明顯提升（P>0.05），0.25 mg/mL處理后，CAT活力提升為155.8%（P<0.05），濃度提升至0.5 mg/mL，SOD活力無明顯增強（P>0.05）。表2表明，0.25 mg/mL的維生素C濃度提升秀麗隱桿線蟲SOD和CAT活力。

2.2 高氧環(huán)境中維生素C提升線蟲存活率

在NGM平板中加入1‰過氧化氫（H2O2）后，形成高氧環(huán)境。與對照組0 mg/mL相比，高氧環(huán)境中線蟲壽命縮短。此外，在高氧環(huán)境中，0.25 mg/mL維生素C飼養(yǎng)線蟲壽命得到部分回復（圖1），0.25 mg/mL的維生素C具有保護線蟲應對高氧環(huán)境的作用。

2.3 維生素C對線蟲抗氧化基因表達水平的影響

檢測0 mg/mL（對照組）維生素C飼養(yǎng)線蟲和0.25 mg/mL維生素C飼養(yǎng)線蟲age-1、ctl-1、sir-2.1、daf-2、daf-16基因的mRNA水平。與對照組相比，0.25 mg/mL維生素C飼養(yǎng)線蟲daf-16 mRNA水平增加（P<0.05），daf-2、age-1mRNA水平下降（P<0.05），ctl-1、sir-2.1 mRNA水平無明顯變化（P>0.05）（表3）。

2.4 高氧環(huán)境中維生素C通過DAF-16胰島素信號途提升線蟲存活率

將0 mg/mL（對照組）線蟲、0.25 mg/mL維生素C飼養(yǎng)線蟲、0.25 mg/mL維生素C飼養(yǎng)age-1RNAi線蟲和0.25 mg/mL維生素C飼養(yǎng)daf-16 RNAi線蟲轉移到含1‰ H2O2及對應濃度維生素C平板（加入產卵抑制劑FUDR）中，每組3板，每板30條線蟲左右。每間隔2 d觀察線蟲存活情況，直至所有平板所有線蟲死亡為止，實驗重復3次。與0 mg/mL（對照組）相比，0.25 mg/mL維生素C飼養(yǎng)線蟲壽命增加（P<0.05），0.25 mg/mL維生素C飼養(yǎng)daf-16 RNAi線蟲壽命無明顯變化（P>0.05），0.25 mg/mL維生素C飼養(yǎng)age-1RNAi線蟲壽命增加（P<0.05）（圖2）。age-1表達量降低增強daf-16的活性，從而增強線蟲抗逆境的能力，而daf-16的活性降低線蟲存活率無明顯變化，表明age-1、daf-16信號通路在維生素C調控線蟲抗氧化中的關鍵作用。

2.5 H2O2高氧應激情況下維生素C增加DAF-16入核

比較在H2O2高氧條件下，0 mg/mL（對照組）線蟲、0.25 mg/mL維生素C飼養(yǎng)線蟲DAF-16蛋白入核情況，0.25 mg/mL維生素C飼養(yǎng)線蟲高于0 mg/mL（對照組）線蟲（P<0.05）（圖3）。H2O2高氧情況下，維生素C促使線蟲DAF-16蛋白入核來增強線蟲抵抗高氧環(huán)境。

3 討論

線蟲體內存在SOD、CAT分別負責清除線蟲體內過量的超氧化物自由基和H2O2，抗氧化酶活力的升高標志著線蟲抗氧化能力的增強。daf-16是FOXO（叉頭轉錄因子）家族的同源物，受到age-1和daf-2活性的抑制，在線蟲的壽命、免疫及應激等方面發(fā)揮正調控作用[11]，其中，daf-2是人胰島素/胰島素樣生長因子受體家族的同族體[12]、age-1是哺乳動物磷脂酰激酶-3-羥基激酶的同族體[13]。研究表明，age-1基因突變后，個體表現(xiàn)出壽命延長的表型，同時在氧化應激條件下，daf-2突變體也表現(xiàn)出比野生型更強的抵抗能力[14]。線蟲體內daf-2受體與胰島素配體結合后可以引發(fā)激酶級聯(lián)反應，磷酸化磷脂酰肌醇-3激酶age-1[13]，而age-1又可通過AKT-1/AKT-2/SGK-1通路引起叉頭轉錄因子daf-16磷酸化[14-15]。daf-16的活性大小調節(jié)該信號通路對機體壽命影響，因此daf-16被認為是機體壽命、熱刺激以及抵抗氧化應激的重要監(jiān)控器，可激活為靶基因如sod-3和ctl-1[16-19]等。研究發(fā)現(xiàn)，0.25 mg/mL維生素C飼養(yǎng)線蟲后，SOD和CAT水平增加，體內的daf-2、age-1的表達量均下降，同時daf-16表達量上調并大量進入細胞核從而增強線蟲抗逆境的能力，這說明維生素C可以通過參與daf-16胰島素信號通路的調控來增強線蟲的抗氧化能力?！?/p>

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Vitamin C Enhances Antioxidant Activity Through Insulin Signaling Pathway in Caenorhabditis elegans

FU Wen，BAI Hua，WANG Yao，LI En-shuang，QIAN Yu-xia，YANG Jiao，ZOU Wei

（School of Public Health，Kunming Medical University，Kunming 650500，China）

Abstract：Objective To investigate the antioxidation effect and mechanism of vitamin C in model organism Caenorhabditis elegans.Method Caenorhabditis elegans was cultured in Nematode Growth Medium containing vitamin C of different mass concentrations（0.05，0.25，0.5 mg/mL）.The contents of superoxide dismutase（SOD）and catalase（CAT）was detected，then the mRNA changes of age-1，daf-2，daf-16，sir-1，clt-1 genes was detected by qPCR.Meanwhile，we verified the survival rate after interference the daf-2 or daf-16 gene expression and observed the situation of DAF-16 enter the nucleus in the H2O2 oxidative stress environment treated by 0.25 mg/mL of vitamin C.Result The result showed that 0.25 mg/mL of vitamin C increased the activity of superoxide dismutase（SOD）and catalase（CAT）.In the H2O2 oxidative stress environment，0.25 mg/mL of vitamin C up-regulated the expression level of daf-16 gene，down-regulated the expression level of age-1 and daf-2 gene，and increased DAF-16 entering the nucleus.Conclusion Vitamin C enhances the antioxidant activity through DAF-16 insulin signaling pathway in Caenorhabditis elegans.

Keywords：Caenorhabditis elegans;antioxidative effect;vitamin C;insulin signaling pathway

基金項目：云南省基礎研究計劃（昆醫(yī)聯(lián)合專項）（項目編號：2018FE001-309）;云南省教育廳科學研究基金（項目編號：2017ZDX159）。

作者簡介：傅 雯（1998— ），女，學士，研究方向：生物分析與檢測。

通信作者：鄒 偉（1988— ），男，博士，講師，研究方向：生物分析與檢測。