北美海棠組織培養(yǎng)中褐變影響因子分析

賈曉梅++周悅++崔彬彬++曹柳青

摘要：為解決北美海棠組培快繁和組織再生中的褐變問題，分析北美海棠組織培養(yǎng)中外植體褐變影響因子。結(jié)果表明，莖段、嫩葉、嫩芽3種外植體中，褐變程度最低的為莖段；MS+1.0 mg/L 2，4-D的培養(yǎng)基上外植體褐變程度最低；暗培養(yǎng)下褐化程度低于光照培養(yǎng)；遮光暗處理外植體母株枝條可減輕褐變；低溫條件下培養(yǎng)可抑制褐變；4月進(jìn)行培養(yǎng)時外植體褐化程度最低，隨后隨月份增加褐變程度加重；培養(yǎng)基中附加聚乙烯吡咯烷酮（PVP）可減輕外植體褐變，而附加檸檬酸（CA）、維生素C以及維生素C預(yù)處理外植體均不能明顯降低褐變率。

關(guān)鍵詞：北美海棠；褐變；組織培養(yǎng)；PVP；維生素C

中圖分類號： S685.990.4+3文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號：1002-1302（2016）12-0091-03

收稿日期：2016-02-01

基金項目：河北省科學(xué)技術(shù)研究與發(fā)展計劃（編號：15227527）；河北省高等學(xué)校科學(xué)技術(shù)研究（編號：Z2013008）；保定學(xué)院科研基金（編號：2012Z08）；保定學(xué)院本科教學(xué)工程建設(shè)項目（編號：20120205）；保定學(xué)院科研團(tuán)隊（編號：KYTD2013001）；保定學(xué)院本科教學(xué)工程建設(shè)項目重點發(fā)展學(xué)科（編號：Xk20130601）。

作者簡介：賈曉梅（1978—），女，河北曲陽人，碩士，副教授，主要從事植物生理和生物技術(shù)的研究。E-mail：jxmqiang@aliyun.com。

北美海棠（Malus micromalus cv. “American”）為薔薇科蘋果屬落葉喬木[1-2]，花、葉、枝條和果實顏色多樣，在不同季節(jié)中形態(tài)多樣，觀賞價值極高，具有耐寒、抗病等特性，還具有較強(qiáng)的觀賞性和長時間的觀賞周期，是優(yōu)秀的園林植物種類[3]，在我國的園林綠化中有非常大的應(yīng)用潛力。北美海棠主要通過扦插嫁接進(jìn)行繁殖，雖然操作簡單，但是繁殖速度較慢，難以在短期內(nèi)滿足市場需求，對北美海棠進(jìn)行組織培養(yǎng)則可以加快繁殖速度[4]。在果樹尤其是木本果樹的組織培養(yǎng)中，易出現(xiàn)外植體或培養(yǎng)物的褐化、枯死現(xiàn)象，即褐變現(xiàn)象，又稱酚污染[5-6]，褐變在北美海棠組織培養(yǎng)過程中也普遍存在。北美海棠接種24 h便開始出現(xiàn)褐變，導(dǎo)致外植體活性明顯降低甚至死亡，難以建立組培快繁體系，限制了其組織培養(yǎng)及遺傳轉(zhuǎn)化工作的開展。有關(guān)褐變的研究在板栗[7]、芭蕾蘋果[8]、龍眼[9]、核桃[10]、中國李[11]和油桃[12]等植物上已獲得一定結(jié)果，但關(guān)于北美海棠組培過程還鮮有報道。本試驗使用常規(guī)組培方法，比較不同取材時間、不同外植體、不同激素種類與配比、不同培養(yǎng)條件及預(yù)處理方法下培養(yǎng)過程中褐化程度的差異，以期找到適合控制褐變的措施，為北美海棠組培快繁和組織再生奠定基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1試驗材料

試驗用外植體為北美海棠的嫩芽、嫩葉和莖段，于2015年4月至8月采自生長健壯、無病蟲害的北美海棠。

1.2試驗方法

1.2.1外植體的接種培養(yǎng)剪取的外植體用20%皂粉水浸泡 25 min，自來水沖洗1.0～1.5 h。隨后將材料在超凈工作臺上，用75%乙醇消毒20～30 s，再用0.1 % HgCl2消毒7～8 min，無菌水沖洗5遍，置于無菌干燥濾紙上吸干水分。將枝條切分成05～1.0 cm 的帶芽莖段、不帶芽莖段，將葉片切為0.5 cm2，接種至培養(yǎng)基中。以MS培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，添加蔗糖30 g/L，瓊脂8 g/L，調(diào)節(jié)pH值為5.8。培養(yǎng)條件為溫度（23±2）℃，光照度1 500～2 000 lx，時間12 h/d。

1.2.2不同外植體及培養(yǎng)基對褐變的影響以MS為基本培養(yǎng)基，添加不同濃度6-BA、NAA、2，4-D的3種增殖培養(yǎng)基：（1）MS+2.0 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA；（2）MS+1.0 mg/L 2，4-D；（3）MS+1.0 mg/L 6-BA+1.0 mg/L 2，4-D。將北美海棠的莖段、嫩芽、嫩葉3種外植體接種在上述3種培養(yǎng)基中， 每個處理接種30個外植體，培養(yǎng)7 d后[LM]統(tǒng)計褐變率和出愈率。

1.2.3光照、溫度對褐變的影響對接種在不同激素組合的3種培養(yǎng)基的3種外植體進(jìn)行光培養(yǎng)、暗培養(yǎng)和低溫培養(yǎng)。光培養(yǎng)條件：光照度1 500～2 000 lx，時間12 h/d，溫度（23±2）℃。暗培養(yǎng)溫度不變，進(jìn)行遮光處理。低溫遮光培養(yǎng)，在遮光條件下溫度設(shè)為4 ℃。培養(yǎng)7 d統(tǒng)計褐變率和出愈率，每個處理接種外植體30個。

1.2.4光線預(yù)處理對褐變的影響將植株上正常生長的北美海棠新生枝條用厚紙袋罩住，密封上部分，下部分留口保證枝條能夠生長但不能接受陽光，處理20 d后接種到3種不同配方的培養(yǎng)基中，每種方案接種30個外植體，以沒有遮光的嫩莖為對照，培養(yǎng)7 d后統(tǒng)計褐變率和出愈率。

1.2.5不同取材時間對褐變的影響分別于4—8月取北美海棠的莖段、嫩芽、嫩葉，接種在不同激素組合的3種培養(yǎng)基中，每處理接種外植體30個，7 d后統(tǒng)計褐變率和出愈率。

1.2.6抗氧化劑對褐變的影響莖段消毒后分別接種在 1/2 MS、1/2 MS+100 mg/L 維生素C+150 mg/L檸檬酸（CA）、1/2MS+1 g/L 聚烯吡絡(luò)烷酮（PVP）3種培養(yǎng)基中，每個處理接種30個外植體，培養(yǎng)7 d后統(tǒng)計褐變率。

1.2.7外植體維生素C預(yù)處理對褐變的影響莖段浸泡在100 mg/L 維生素C水溶液中0、0.5、1.0、2.0、4.0、12.0 h，對照為清水浸泡12h，材料經(jīng)滅菌后接種于l/2 MS培養(yǎng)基，每個處理接種30個外植體，培養(yǎng)7 d后統(tǒng)計褐變率。

2結(jié)果與分析

2.1外植體類型和培養(yǎng)條件對褐變的影響

由表1可見，莖段、嫩葉、嫩芽3種外植體均出現(xiàn)褐變，并且褐變程度表現(xiàn)不同，嫩芽和嫩葉的褐變程度都很嚴(yán)重，褐變率高達(dá)100.0%，莖段相比較低（93.3%）。3個培養(yǎng)基配方的褐變程度和出愈情況也有所不同，培養(yǎng)基2褐變程度低于培養(yǎng)基1、3，出愈率高于培養(yǎng)基1、3。暗培養(yǎng)平均褐變率為14.8%，光照培養(yǎng)平均褐變率為100.0%，暗培養(yǎng)比光照培養(yǎng)明顯降低；暗培養(yǎng)的出愈率為3.7%，光照培養(yǎng)的出愈率為0；低溫條件褐變率最低，培養(yǎng)7 d平均褐變率為0，出愈率也較低，僅為1.0%（表1）。

2.2遮光預(yù)處理對褐變的影響

遮光預(yù)處理可以抑制褐變的發(fā)生，遮光處理枝條的褐變率為20.4%，遠(yuǎn)低于未遮光處理的38.9%，二者相差18.5個百分點，遮光處理平均出愈率也達(dá)5.6%，未遮光處理沒有愈傷發(fā)生（表2）。

2.3不同取材時間對褐變的影響

取材時間會影響外植體褐變的情況，由表3可知，4月外植體平均褐變率為37.0%，褐變程度最低；隨采樣時間的推移，外植體平均褐變率有整體提高的趨勢，而且接種后材料污染的情況也愈加嚴(yán)重。6月取材的外植體平均出愈率最高，達(dá)5.2%，其次是4月，出愈率為3.7%，其他月份均未有愈傷組織發(fā)生。

2.4添加抗氧化劑對褐變的影響

培養(yǎng)基中添加PVP及維生素C+CA組合培養(yǎng)后外植體褐變率和褐變程度如表4所示。附加PVP的培養(yǎng)基褐變率為27.8%，外植體基部切口的褐變情況較輕，而附加維生素C+CA的培養(yǎng)基褐化率為66.7%，與對照68.9%的褐變率差異不明顯。

2.5抗氧化劑維生素C預(yù)處理材料對褐變的影響

外植體浸在100 mg/L 的維生素C水溶液中0～12.0 h，外植體培養(yǎng)褐變都不能被抑制，反而隨浸泡時間的延長，接種后的外植體褐變率升高，褐變程度加深，清水浸泡處理平均褐變率高于維生素C預(yù)處理（表5）。

3討論與結(jié)論

在本試驗中，不同外植體、不同培養(yǎng)基組成對外植體褐變均有不同程度影響。試驗所選的3種外植體（莖段、嫩葉、嫩芽）褐變程度不同，褐變程度最低的為莖段，達(dá)93.3%，而嫩葉和嫩芽褐變程度都較重，平均褐變率均為100.0%。3種培養(yǎng)基配方中，MS+2.0 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA褐變率最高，MS+1.0 mg/L 2，4-D培養(yǎng)基褐變率最低。推測可能與細(xì)胞分裂素6-BA對酚類化合物的合成有促進(jìn)作用，而 2，4-D 作為生長素類能延緩酚類物質(zhì)的合成，減輕褐化程度[13]有關(guān)。

光照和溫度也會對外植體褐變的程度產(chǎn)生影響。光照條件下，酚類物質(zhì)的生物合成也隨光照度增加而增加，外植體褐變程度也加重。暗處理可以一定程度地抑制褐變的發(fā)生，可能原因是在酚類化合物合成和氧化過程中需要許多酶的參與，部分酶的活性受光照的誘導(dǎo)[14]。本試驗表明，暗培養(yǎng)平均褐變率為14.8%，光照培養(yǎng)平均褐變率高達(dá)100.0%，暗培養(yǎng)的北美海棠外植體褐變程度明顯低于光照培養(yǎng)，并且遮光處理也可起到抑制褐變的作用。王明華等的研究結(jié)果同樣顯示對芭蕾蘋果母株枝條進(jìn)行遮光處理能抑制褐變的發(fā)生[8]。母株進(jìn)行遮光處理后，需要光誘導(dǎo)合成的酚類與氧化酶的生物活性降低，使酚類化合物的合成減少。本試驗中低溫培養(yǎng)外植體褐變率低，這與高汝勇在進(jìn)行天竺葵莖尖培養(yǎng)時得出的結(jié)果類似[15]。低溫能夠抑制褐變是由于溫度低時酚類物質(zhì)的合成降低，外植體中的酚含量下降或者多酚氧化酶的活性降低，均可使褐變減輕或受到抑制。

試材采集時間會對植物材料接種后褐變有明顯影響，4月采集的北美海棠外植體褐變程度低于其他月份，5月及以后采集的外植體褐變率達(dá)86%以上，7—8月外植體全部褐變。由此可知，北美海棠在春季取材時褐變程度最低，隨著采樣時間的后移，植株體內(nèi)的酚類化合物含量不斷提高，多酚氧化酶的活性不斷升高，所以外植體褐變呈現(xiàn)加重趨勢。

在培養(yǎng)基中添加抗氧化劑或?qū)χ参锊牧线M(jìn)行預(yù)處理也是有效抑制褐變加重的措施之一[16]。本試驗添加不同抗氧化劑的培養(yǎng)基中，附加PVP的培養(yǎng)基效果好于附加維生素C+CA的培養(yǎng)基，附加PVP的培養(yǎng)基中外植體基部切口的褐變情況明顯減輕。這與羅麗華的研究結(jié)果[7]不同，推測與植物多樣性有關(guān)。對芭蕾蘋果褐變的研究表明，將外植體浸在清水或抗氧化劑中，褐變程度不能得到抑制[8]，同樣在本試驗中，外植體無論是浸在清水中還是在含100 mg/L維生素C溶液中，褐變都不能被抑制，而且隨著浸泡時間延長，外植體褐變程度加重，褐變率提高。這可能是因為莖段長時間浸在清水或抗氧化劑中，處于無氧呼吸狀態(tài)，生命力降低，另外外植體細(xì)胞水勢低于外部溶液而吸水，使其含水量升高引起細(xì)胞膨脹，此時的細(xì)胞對于消毒劑乙醇和氯化汞的刺激更敏感，易受到損傷，使植物組織受到破壞，加重褐變程度。所以北美海棠的外植體組培時不宜采用清水浸泡或維生素C浸泡預(yù)處理。

[HS2][HT8.5H]參考文獻(xiàn)：[HT8.SS][HJ1.75mm]

[1]趙志新. 北美海棠微扦插繁殖試驗[J]. 天津農(nóng)業(yè)科學(xué)，2012，18（1）：123-125.

[2]徐基平，李艷紅，胡秀琴. 克拉瑪依地區(qū)北美海棠的引種栽培及推廣應(yīng)用研究[J]. 園藝與種苗，2011（1）：51-53.

[3]郭 蕾，鄭大睿，仇蘭芬，等. 不同北美海棠品種抗螨性調(diào)查[J]. 廣東農(nóng)業(yè)科學(xué)，2008（12）：103-104.

[4]趙志新. 北美海棠組培快繁技術(shù)[J]. 農(nóng)業(yè)科技通訊，2011，17（12）：186-187.

[5]鄒英寧，吳強(qiáng)盛. 果樹組織培養(yǎng)中褐變現(xiàn)象及其抑制研究進(jìn)展[J]. 長江大學(xué)學(xué)報B：自然科學(xué)版，2007，4（3）：47-50.

[6]Torre A M，Mau-Lastovicka T，Rezzaiyan R. Total phenolics and high performance liquid Chromatograp-hy of phenolics acids of avocado[J]. Agric Food Chem，1987，35： 921-925.

[7]羅麗華. 板栗組織培養(yǎng)及褐變研究[D]. 長沙：中南林學(xué)院 中南林業(yè)科技大學(xué)，2004：9-17.

[8]王明華，李光晨，李正應(yīng). 芭蕾蘋果微繁殖中抑制褐化的研究[C]. 北京： 北京農(nóng)業(yè)大學(xué)出版社，1995：365-369.

[9]豐鋒. 龍眼組織培養(yǎng)褐變抑制研究[J]. 中國南方果樹，2004，33（6）：49-51.

[10]王法章，張春梅. 培養(yǎng)基種類及成分對核桃葉片組織培養(yǎng)褐變的影響[J]. 吉林農(nóng)業(yè)，2016（1）：87-88.

[11]鄒英寧，李國懷，樊青峰，等. 不同抗氧化劑對中國李莖段培養(yǎng)的影響[J]. 華中農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，2006，25（1）：84-86.

[12]李桂榮，孫麗，孫俊逢. 油桃組織培養(yǎng)過程中防止褐變的研究[J]. 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2005，33（5）：827-828.

[13]付影，榮俊冬，陳禮光，等. 植物組織培養(yǎng)中褐變問題研究進(jìn)展[J]. 亞熱帶農(nóng)業(yè)研究，2007，3（3）：190-195.

[14]張偉，程蕾潔，洪 波.植物組織培養(yǎng)中克服外植體褐變的研究[J]. 河北農(nóng)業(yè)科技，2008（8）：55-56.

[15]高汝勇. 植物組織培養(yǎng)中褐變產(chǎn)生的因素和預(yù)防措施[J]. 科技風(fēng)，2009（10）：83-84.

[16]杜敬然，趙斌，李英麗，等. 紅掌組織培養(yǎng)過程中外植體褐變的研究[J]. 北方園藝，2010（9）：160-162.