乳清蛋白肽對(duì)衰老模型小鼠的抗氧化和學(xué)習(xí)記憶改善作用

于曉晨 李臻 劉欣然 胡佳妮 劉睿 珠娜 李勇

摘 要：目的：探討乳清蛋白肽對(duì)衰老模型C57BL/6N小鼠的抗氧化和學(xué)習(xí)記憶改善作用。方法：采用SPF級(jí)雄性C57BL/6N小鼠72只，隨機(jī)選取12只作為空白對(duì)照組，其余小鼠采用D-半乳糖100 mg/kg BW腹腔注射造模，連續(xù)造模6 w，期間空白對(duì)照組小鼠腹腔注射等量生理鹽水。6 w后內(nèi)眥取血，測(cè)定血清MDA水平，并按MDA水平隨機(jī)分為模型對(duì)照組、乳清蛋白組1.5 g/kg BW和3個(gè)乳清蛋白肽干預(yù)組（0.3、1.5、3.0 g/kg BW）。每日經(jīng)口灌胃給予受試樣品水溶液，干預(yù)周期為30 d，期間繼續(xù)維持模型對(duì)照組、乳清蛋白組及乳清蛋白肽組D-半乳糖及空白對(duì)照組生理鹽水腹腔注射造模。干預(yù)結(jié)束后，按開闊場(chǎng)實(shí)驗(yàn)、水迷宮實(shí)驗(yàn)、新物體識(shí)別實(shí)驗(yàn)順序進(jìn)行行為學(xué)實(shí)驗(yàn)。行為學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，對(duì)小鼠血清、肝臟及腦組織氧化應(yīng)激相關(guān)指標(biāo)進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果：與空白對(duì)照組相比，D-半乳糖衰老模型小鼠顯示出了運(yùn)動(dòng)、探索及學(xué)習(xí)記憶能力障礙，模型組小鼠抗氧化酶水平低于空白組、脂質(zhì)過氧化和羰基化蛋白水平高于空白組。與模型對(duì)照組相比，乳清蛋白肽可顯著改善衰老小鼠空間探索、空間及非空間學(xué)習(xí)記憶能力，并提高血清及肝臟SOD、GSH-Px活力，改善血清及腦組織脂質(zhì)過氧化物與羰基化蛋白累積水平。結(jié)論：乳清蛋白肽對(duì)衰老模型小鼠具有抗氧化和改善學(xué)習(xí)記憶作用。

關(guān)鍵詞：乳清蛋白肽;衰老模型;抗氧化;學(xué)習(xí)記憶

“衰老”是隨著年齡增加機(jī)體逐漸出現(xiàn)的退行性變化，表現(xiàn)為功能代謝水平的異常、外界環(huán)境適應(yīng)能力的降低及抵御刺激損害能力的下降[1]。據(jù)世衛(wèi)組織統(tǒng)計(jì)，60歲及以上人口的絕對(duì)數(shù)預(yù)計(jì)將從2015年的9億人增長(zhǎng)至2030年的14億及2050年的21億，并有望在2100年突破32億[2]。老年人口占比數(shù)目正在不斷增長(zhǎng)，各種與衰老相關(guān)的問題需要引起世界各國(guó)的重視。目前各界對(duì)于衰老的機(jī)制尚存爭(zhēng)議，20世紀(jì)50年代，Gerschaman提出了自由基理論[3]，該理論認(rèn)為，自由基對(duì)細(xì)胞成分或細(xì)胞間組分造成的損害，是與機(jī)體衰老相關(guān)的生理生化功能受損的主要原因。正常情況下，機(jī)體組織細(xì)胞在代謝過程中發(fā)生氧化還原狀態(tài)的可逆性改變并不斷產(chǎn)生自由基，機(jī)體含有內(nèi)源性抗氧化劑包括酶與非酶途徑，主要的抗氧化酶有超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）等，其參與了正常狀態(tài)下自由基的清除功能。當(dāng)各種內(nèi)源性和/或外源性來源的活性氧自由基產(chǎn)生過多造成累積，或機(jī)體的抗氧化清除能力下降時(shí)，內(nèi)源性防御系統(tǒng)及自由基之間的平衡將會(huì)被打破，由此產(chǎn)生氧化應(yīng)激，逐漸對(duì)細(xì)胞造成持續(xù)及累積的氧化損傷，這種損傷多表現(xiàn)在對(duì)生物大分子，如脂質(zhì)、蛋白質(zhì)及DNA的潛在危害中，在機(jī)體內(nèi)表現(xiàn)為組織及器官中脂質(zhì)過氧化物丙二醛（MDA）及羰基化蛋白（PC）的累積[4]。

伴隨增齡正常老年人客觀上存在腦老化，腦衰老會(huì)造成神經(jīng)系統(tǒng)的退行性改變，嚴(yán)重時(shí)可引起輕度認(rèn)知障礙、阿爾茲海默病等老年常見疾病，其表現(xiàn)為不同程度的學(xué)習(xí)記憶能力受損及認(rèn)知障礙。學(xué)習(xí)記憶能力是指人和動(dòng)物根據(jù)已經(jīng)獲得的經(jīng)驗(yàn)改變自身行為活動(dòng)以適應(yīng)環(huán)境變化的過程，其功能的正常維持被認(rèn)為與海馬結(jié)構(gòu)及大腦中神經(jīng)元、突觸間的相互作用與相互聯(lián)系有關(guān)[5]。伴隨衰老腦組織內(nèi)需氧量不斷提升，且對(duì)外界氧化應(yīng)激敏感程度較高，使得腦組織內(nèi)易發(fā)生過量的自由基堆積，無法有效地進(jìn)行自我清除，進(jìn)而導(dǎo)致神經(jīng)干細(xì)胞及神經(jīng)元損傷，致使正常神經(jīng)功能嚴(yán)重破壞，最終導(dǎo)致學(xué)習(xí)記憶能力的下降[6]。因此探尋天然抗氧化劑，更安全有效地通過干預(yù)氧化應(yīng)激損傷來延緩腦老化，并減緩衰老相關(guān)海馬神經(jīng)元損傷改善學(xué)習(xí)記憶障礙，對(duì)實(shí)現(xiàn)健康老齡化，并提升老年人生活福祉至關(guān)重要。

乳清是牛乳副產(chǎn)品奶酪及酪蛋白生產(chǎn)過程中主要的副產(chǎn)物，占乳總體積的85%～95%，約含有一半牛乳營(yíng)養(yǎng)。據(jù)悉，每年乳清產(chǎn)量超過1.6億t[7]，不當(dāng)處理方式不但會(huì)引起污染問題也會(huì)造成資源的流失，因此合理處理回收利用乳清已成為研究熱點(diǎn)。乳清中的蛋白質(zhì)成分乳清蛋白屬于優(yōu)質(zhì)蛋白，含有人類所需的8種必需氨基酸，受益于其各種有效組分，如β-乳球蛋白、α-乳白蛋白、乳鐵蛋白等，其已被應(yīng)用于健身及醫(yī)療保健等多種行業(yè)當(dāng)中[8]。

生物活性肽是由食品蛋白質(zhì)經(jīng)酶解產(chǎn)生的分子結(jié)構(gòu)介于氨基酸及蛋白質(zhì)之間的化合物，多數(shù)含有2～20個(gè)氨基酸，通常富含疏水性氨基酸。從食物蛋白質(zhì)成分中提取的生物活性肽，通常對(duì)胃腸消化酶具有天然抗性[9]，經(jīng)口服攝取的生物活性肽可以確保生物利用度，并使其有機(jī)會(huì)發(fā)揮生理效用，且具有高吸收、不易過敏、耗能低、無競(jìng)爭(zhēng)抑制等特點(diǎn)[10]。乳清蛋白肽是乳清蛋白的酶解產(chǎn)物，作為食物提取的生物活性肽其在安全無副作用的前提下，具有多種生物活性，如降血糖[11]、改善血脂[12]、免疫調(diào)節(jié)[13]等。但目前關(guān)于乳清蛋白肽對(duì)衰老相關(guān)抗氧化及學(xué)習(xí)記憶改善作用研究的文獻(xiàn)報(bào)道較少，故本實(shí)驗(yàn)使用D-半乳糖進(jìn)行衰老模型造模，應(yīng)用不同劑量的乳清蛋白肽對(duì)小鼠進(jìn)行灌胃干預(yù)，通過行為學(xué)實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)其對(duì)衰老個(gè)體的學(xué)習(xí)記憶改善的作用，同時(shí)對(duì)氧化應(yīng)激相關(guān)指標(biāo)進(jìn)行檢測(cè)，探討乳清蛋白肽改善衰老相關(guān)氧化應(yīng)激及學(xué)習(xí)記憶功能的可能機(jī)制，為乳清蛋白肽的功能開發(fā)利用提供理論及實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

乳清蛋白肽（WHP），乳白色固體粉末，是通過特殊錯(cuò)流過濾工藝從乳清中提取蛋白濃縮物，后經(jīng)生物酶解技術(shù)從乳清蛋白中分離得到的小分子生物活性肽類混合物。本研究使用Hilmar公司生產(chǎn)的WHP 8350。WHP 8350水解度為12.5%，蛋白質(zhì)含量82%，分子量小于1 000 Da的低聚肽占40.5%，分子量小于5 000 Da的低聚肽占67.2%，其中谷氨酸、天冬氨酸、亮氨酸、賴氨酸含量較多。

健康SPF級(jí)C57BL/6N近交系小鼠，雄性，72只，6月齡，體重（40±10）g。由北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。飼養(yǎng)于屏障級(jí)動(dòng)物室，溫度范圍為（22±2）℃，相對(duì)濕度為 50%～60%，晝：夜明暗交替時(shí)間為 12 h：12 h。由北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供（實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào)：SYXK（京）2011-0039;實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（京）2011-0012）。

紫外分光光度計(jì)，UV-2000（UNIC）;全自動(dòng)生化儀，AU480貝克曼（美國(guó)）;總超氧化物歧化酶（SOD）測(cè)定試劑盒（WST-1法）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-PX）測(cè)定試劑盒（比色法）、丙二醛（MDA）測(cè)定試劑盒（TBA法）、蛋白質(zhì)羰基含量測(cè)定試劑盒（紫外比色法），南京建成生物科技。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物分組及處理 小鼠飼養(yǎng)在北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科學(xué)部，實(shí)驗(yàn)期間自由飲食、飲水。動(dòng)物適應(yīng)性喂養(yǎng)1 w后，隨機(jī)選取12只小鼠作為空白對(duì)照組。除空白對(duì)照組外，其余動(dòng)物用D-半乳糖100 mg/kg BW腹腔注射造模，注射量為0.1 mL/10 g，空白對(duì)照組用等量生理鹽水腹腔注射，每日1次連續(xù)造模6 w。6 w后采用尾靜脈取血，以3 000 r/10 min的轉(zhuǎn)速分離血清，測(cè)定血清中MDA含量，并按MDA水平隨機(jī)分組。分組后各模型組比較MDA水平均無顯著性差異，但與空白對(duì)照組相比MDA均有顯著性差異。

模型建立后基于各小鼠血清MDA水平，將其隨機(jī)分為1個(gè)模型對(duì)照組，1個(gè)乳清蛋白組（1.5 g/kg BW）和3個(gè)乳清蛋白肽干預(yù)組（0.3、1.5、3.0 g/kg BW）。每日經(jīng)口灌胃給予受試樣品，空白對(duì)照組和模型對(duì)照組給予高壓消毒蒸餾水，乳清蛋白組和乳清蛋白肽組給予相應(yīng)濃度受試物，溶液均用蒸餾水配制。在給予受試樣品的同時(shí)，模型對(duì)照組、乳清蛋白組和各劑量組繼續(xù)給予相同劑量D-半乳糖腹腔注射，空白對(duì)照組給予生理鹽水腹腔注射。動(dòng)物每周稱重兩次，按體重調(diào)整受試樣品劑量。受試樣品給予時(shí)間30 d。實(shí)驗(yàn)過程中每周觀察各組小鼠的一般情況，包括毛色、精神狀態(tài)、攝食及日常活動(dòng)情況等。30 d干預(yù)結(jié)束后，進(jìn)行行為學(xué)實(shí)驗(yàn)及相關(guān)指標(biāo)的測(cè)定。

1.2.2 行為學(xué)實(shí)驗(yàn) 連續(xù)干預(yù)30 d后，于第31天按照開闊場(chǎng)實(shí)驗(yàn)、Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)、新物體識(shí)別實(shí)驗(yàn)的順序依次開始行為學(xué)實(shí)驗(yàn)。為減小系統(tǒng)誤差、保證實(shí)驗(yàn)前后觀察的一致性，所有實(shí)驗(yàn)均由固定人員負(fù)責(zé)、實(shí)驗(yàn)全程減少人員走動(dòng)、保持安靜。每?jī)蓚€(gè)行為學(xué)實(shí)驗(yàn)之間至少間隔2 d，以消除干擾。

（1）開闊場(chǎng)實(shí)驗(yàn)：開闊場(chǎng)實(shí)驗(yàn)在長(zhǎng)×寬×高為45 cm×45 cm×45 cm的木質(zhì)箱內(nèi)進(jìn)行，內(nèi)襯黑色墊紙，底部為白色，并畫有5×5正方格。實(shí)驗(yàn)開始時(shí)將小鼠輕輕放入中央格中，記錄5分鐘內(nèi)小鼠的跨格次數(shù)、站立次數(shù)、進(jìn)入中央格的次數(shù)、中央格停留時(shí)間、外周格停留時(shí)間和糞粒個(gè)數(shù)。（2）Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)：整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程分為定位航行實(shí)驗(yàn)和空間探索實(shí)驗(yàn)兩部分。①定位航行實(shí)驗(yàn)：用于評(píng)估小鼠在水迷宮中的學(xué)習(xí)和記憶能力。實(shí)驗(yàn)總用時(shí)為6 d，測(cè)試期間，將平臺(tái)置于圓池內(nèi)第一象限中央，固定于水下1～1.5 cm，水溫保持在（21±1）℃，每天小鼠分別從東、西、南、北4個(gè)象限面向池壁輕輕放入水中，記錄小鼠從入水到找到平臺(tái)所需的時(shí)間記為逃避潛伏期，并同時(shí)記錄游泳路程和游泳速度。每次測(cè)試間隔5 min，4次成績(jī)的平均值作為當(dāng)日最終成績(jī)記錄。如果動(dòng)物在60 s內(nèi)未找到平臺(tái)，則將由實(shí)驗(yàn)者將其引導(dǎo)至平臺(tái)并在平臺(tái)上停留10 s，逃避潛伏期記為60 s。②空間探索實(shí)驗(yàn)：用于測(cè)量小鼠對(duì)平臺(tái)空間位置學(xué)習(xí)的記憶保持能力。實(shí)驗(yàn)第7天，將平臺(tái)從實(shí)驗(yàn)裝置中移除，將小鼠從第三象限任一入水點(diǎn)置于水中。記錄小鼠從入水到第一次到達(dá)平臺(tái)所在位置的時(shí)間記為逃避潛伏期，并同時(shí)記錄60 s內(nèi)小鼠在目標(biāo)象限（定位航行實(shí)驗(yàn)中平臺(tái)所在象限）的停留時(shí)間、目標(biāo)象限游泳路程及準(zhǔn)確穿越平臺(tái)所在位置的次數(shù)。（3）新物體識(shí)別實(shí)驗(yàn)：新物體識(shí)別實(shí)驗(yàn)在一個(gè)曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)裝置（40 cm×40 cm×40 cm）中進(jìn)行。實(shí)驗(yàn)中準(zhǔn)備A、B、C 3個(gè)物體，其中A及B為相同物體，C與A、B形狀及大小均不相同，所有物體保證重量足夠以防止小鼠推動(dòng)。實(shí)驗(yàn)分為適應(yīng)、訓(xùn)練、檢測(cè)三個(gè)步驟：①適應(yīng)期：將小鼠置于曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)裝置中央，并不放置任何物體，自行適應(yīng)性活動(dòng)5 min。②訓(xùn)練期：在適應(yīng)期后1 d，曠場(chǎng)內(nèi)放入A及B兩個(gè)相同物體，分別與裝置兩側(cè)壁間隔10 cm。將小鼠背對(duì)物體，從距物體等距離處放入，觀察5 min，記錄小鼠探索A及B物體的時(shí)間。③檢測(cè)期：與適應(yīng)期實(shí)驗(yàn)間隔5 h，用物體C替換物體B置于曠場(chǎng)內(nèi)相同位置，同樣將小鼠背對(duì)物體，從盒中距物體等距離處放入，觀察5 min，記錄小鼠探索A及C物體時(shí)間。以小鼠鼻子或嘴巴觸及物體的次數(shù)和距離物體2 cm范圍內(nèi)探究的時(shí)間記為T，前爪觸及物體、嗅、舔、咬等均記錄為小鼠對(duì)物體的探索過程，爬上物體或攀越物體的時(shí)間不算在T內(nèi)。使用文獻(xiàn)中的公式計(jì)算新物體識(shí)別指數(shù)（NOI）：新物體識(shí)別指數(shù)=探索新物體的時(shí)間/（探索新物體時(shí)間+探索舊物體時(shí)間）×100%[14]。

1.3 氧化應(yīng)激相關(guān)指標(biāo)的測(cè)定

行為學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)束后進(jìn)行眼球采血，并使用頸椎脫臼法處死小鼠，分離肝臟及腦組織備用。血液于4 ℃冰箱放置3 h待凝固，2 000 r/min離心15 min，分離血清。采用試劑盒測(cè)定血清、肝臟及腦組織氧化應(yīng)激相關(guān)指標(biāo)（血清及肝臟SOD、GSH-Px、MDA及PC水平;腦組織MDA及PC水平）。

1.4 統(tǒng)計(jì)方法

正態(tài)及非正態(tài)分布的連續(xù)變量分別以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示;分類變量以個(gè)數(shù)（百分?jǐn)?shù)）表示。采用SPSS 24.0軟件進(jìn)行單因素方差分析，采用LSD法進(jìn)行兩組間比較;方差不齊時(shí)采用Tamhane和Dunnett法進(jìn)行post-hoc分析。P<0.05表示有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 乳清蛋白肽對(duì)衰老模型小鼠開闊場(chǎng)實(shí)驗(yàn)跨格次數(shù)及站立次數(shù)的影響

如表1所示，開闊場(chǎng)實(shí)驗(yàn)中，模型對(duì)照組小鼠跨格次數(shù)及站立次數(shù)與空白對(duì)照組比較顯著減少（P<0.05）。乳清蛋白肽中、高劑量組小鼠跨格次數(shù)顯著高于模型對(duì)照組（P<0.05）;與模型對(duì)照組相比，乳清蛋白組、乳清蛋白肽低、中、高劑量組小鼠的站立次數(shù)顯著提高（P<0.05）;各組小鼠進(jìn)入中央格次數(shù)、中央格停留時(shí)間及糞便個(gè)數(shù)無顯著性差異。

2.2 乳清蛋白肽對(duì)衰老模型小鼠Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)定位航行及空間探索的影響

如表2、圖1所示，隨著訓(xùn)練天數(shù)的增加，各組小鼠逃避潛伏期時(shí)長(zhǎng)呈下降趨勢(shì)，在第6天定位航行實(shí)驗(yàn)中，與第1天相比空白對(duì)照組、乳清蛋白組及乳清蛋白肽低、中、高劑量組小鼠逃避潛伏期顯著縮短（P<0.05），而模型對(duì)照組小鼠第6天逃避潛伏期與第1天無顯著性差異。與空白對(duì)照組相比，模型對(duì)照組小鼠游泳速度在第1、3、6天均顯著減?。≒<0.05）;各組游泳路程無顯著性差異。如表3所示，在空間探索實(shí)驗(yàn)中，模型對(duì)照組小鼠逃避潛伏期、穿越平臺(tái)次數(shù)、目標(biāo)象限停留時(shí)間及目標(biāo)象限路程均顯著小于空白對(duì)照組（P<0.05）;乳清蛋白組目標(biāo)象限路程顯著大于模型對(duì)照組（P<0.05），乳清蛋白肽高劑量組逃避潛伏期、目標(biāo)象限停留時(shí)間及目標(biāo)象限路程均顯著大于模型對(duì)照組（P<0.05）。如圖2所示，空白對(duì)照組、乳清蛋白肽中、高劑量組小鼠在平臺(tái)所在象限運(yùn)動(dòng)占比較高，停留時(shí)間較長(zhǎng)，模型對(duì)照組小鼠運(yùn)動(dòng)較少時(shí)間圍繞平臺(tái)及經(jīng)過平臺(tái)所在象限。

2.3 乳清蛋白肽對(duì)衰老模型小鼠新物體探索時(shí)間識(shí)別指數(shù)的影響

如表4所示，各組訓(xùn)練期辨別指數(shù)NOI’均無顯著性差異。模型對(duì)照組小鼠檢測(cè)期辨別指數(shù)NOI顯著低于空白對(duì)照組（P<0.05）;乳清蛋白肽中劑量組檢測(cè)期辨別指數(shù)NOI顯著高于模型對(duì)照組（P<0.05）。

2.4 乳清蛋白肽對(duì)小鼠抗氧化相關(guān)指標(biāo)的影響

如表5、表6所示，與空白對(duì)照組相比，模型對(duì)照組血清及肝臟SOD、GSH-Px活力均顯著下降（P<0.05）。與模型對(duì)照組相比，乳清蛋白組血清SOD活力顯著升高（P<0.05），乳清蛋白肽中、高劑量組小鼠血清、肝臟SOD活力均明顯升高（P<0.05）。與模型對(duì)照組相比，乳清蛋白組血清GSH-Px活力顯著提高（P<0.05），乳清蛋白肽中、高劑量組小鼠血清、肝臟GSH-Px活力分別有顯著提升（P<0.05）。

2.5 乳清蛋白肽對(duì)小鼠MDA及羰基化蛋白水平影響

如表7、表8所示，與空白對(duì)照組相比，模型對(duì)照組血清及腦組織內(nèi)MDA含量均顯著提升（P<0.05），模型對(duì)照組血清、肝臟及腦組織內(nèi)羰基化蛋白PC含量也均顯著高于空白對(duì)照組（P<0.05）。與模型對(duì)照組相比，乳清蛋白肽中、高劑量組小鼠血清、腦組織MDA含量分別有顯著降低（P<0.05）。與模型對(duì)照組相比，乳清蛋白肽高劑量組小鼠血清及腦組織PC含量均顯著減少（P<0.05）。

3 討論

衰老伴隨的生理生化功能衰退是每個(gè)個(gè)體不可避免的，增齡會(huì)導(dǎo)致大腦功能出現(xiàn)不同程度上的損傷，典型表現(xiàn)為學(xué)習(xí)及記憶功能的障礙。本研究采用了多種行為學(xué)實(shí)驗(yàn)方法針對(duì)乳清蛋白肽干預(yù)衰老模型小鼠的學(xué)習(xí)記憶功能進(jìn)行評(píng)價(jià)，開闊場(chǎng)實(shí)驗(yàn)用于評(píng)價(jià)小鼠的自發(fā)空間探索能力，Morris水迷宮是英國(guó)心理學(xué)家Morris于20世紀(jì)80年代初設(shè)計(jì)并應(yīng)用于腦空間學(xué)習(xí)記憶機(jī)制研究的一種實(shí)驗(yàn)手段，目前被廣泛應(yīng)用于衰老相關(guān)實(shí)驗(yàn)當(dāng)中[15]，新物體識(shí)別實(shí)驗(yàn)是通過記錄小鼠對(duì)物體的探索時(shí)間，檢測(cè)小鼠非空間記憶能力的精密、敏感的行為學(xué)檢測(cè)方法[16]。三種行為學(xué)結(jié)果表明，D-半乳糖衰老模型小鼠在開闊場(chǎng)實(shí)驗(yàn)、Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)及新物體識(shí)別實(shí)驗(yàn)中，均體現(xiàn)了不同程度的運(yùn)動(dòng)、探索及學(xué)習(xí)記憶能力障礙。而研究顯示，通過不同劑量的乳清蛋白肽對(duì)衰老模型小鼠進(jìn)行干預(yù)，能夠顯著提高其開闊場(chǎng)實(shí)驗(yàn)中小鼠的跨格次數(shù)及站立次數(shù)，縮短定位航行試驗(yàn)中小鼠的逃避潛伏期，增加小鼠空間探索實(shí)驗(yàn)中目標(biāo)象限停留時(shí)間及目標(biāo)象限路程，并改善NOR實(shí)驗(yàn)中小鼠對(duì)新物體識(shí)別認(rèn)知的非空間學(xué)習(xí)記憶能力，證實(shí)乳清蛋白肽具有改善衰老相關(guān)學(xué)習(xí)記憶障礙的作用。

自由基理論認(rèn)為，與衰老相關(guān)的生化及生理衰退是由細(xì)胞代謝過程中活性氧自由基形成對(duì)細(xì)胞的氧化損傷積累引起的，伴隨年齡增長(zhǎng)細(xì)胞產(chǎn)生自由基及自身抗氧化防御/損傷修復(fù)機(jī)制出現(xiàn)不平衡，這種不平衡成為了衰老背后的驅(qū)動(dòng)力[17]。這與本研究結(jié)果相符，D-半乳糖腹腔注射構(gòu)造的衰老模型小鼠顯示出了內(nèi)源性抗氧化酶SOD及GSH-Px活力的下降，其血清、肝臟及腦組織中表現(xiàn)出了不同程度的脂質(zhì)過氧化物丙二醛及蛋白質(zhì)過氧化物羰基化蛋白水平的累積。超氧化物歧化酶SOD及谷胱甘肽過氧化物酶GSH-Px是機(jī)體抵御活性氧自由基損傷的內(nèi)源性防御措施，SOD能夠?qū)2轉(zhuǎn)化為H2O2后在過氧化氫酶的作用下分解為水和氧，在組織羥基自由基的清除中起到重要作用。GSH-px可以通過將還原性谷胱甘肽氧化為谷胱甘肽二硫化物，再通過谷胱甘肽還原酶還原成為谷胱甘肽，從而將過氧化物及羥基自由基轉(zhuǎn)化為無毒形式[4]。本研究結(jié)果顯示，與模型對(duì)照組相比，乳清蛋白肽中劑量組小鼠血清SOD、肝臟SOD及血清GSH-Px活力升高，高劑量組小鼠肝臟SOD及GSH-Px活力顯著提升，顯示出了乳清蛋白肽具有提升衰老模型小鼠內(nèi)源性抗氧化酶的作用。

國(guó)內(nèi)外研究顯示，氧化應(yīng)激損傷與衰老相關(guān)學(xué)習(xí)記憶障礙密切相關(guān)。大腦是神經(jīng)系統(tǒng)的最高中樞，相較于其他器官其自身遭受自由基損害的風(fēng)險(xiǎn)增加，更易受到活性氧自由基造成的損傷，原因在于：（1）大腦高能活動(dòng)的正常維持需要大量的能量及氧氣供應(yīng)，消耗呼吸系統(tǒng)提供的約20%氧氣，神經(jīng)元作為大腦的基本功能單元，其代謝率高于其他細(xì)胞更容易受到氧化損傷。（2）與其他組織相比，腦組織抗氧化防御酶的含量相對(duì)較低。（3）腦組織內(nèi)含有諸多有助于氧化還原循環(huán)的過渡金屬。（4）大腦脂質(zhì)中具有高含量的多不飽和脂肪酸，可與活性氧相互作用，導(dǎo)致脂質(zhì)過氧化及破壞分子自傳遞級(jí)聯(lián)反應(yīng)，其氧化易產(chǎn)生具有神經(jīng)毒性大過氧化產(chǎn)物如MDA等[18-19]。除了自由基對(duì)脂質(zhì)大分子的損害外，氧化應(yīng)激對(duì)老齡人學(xué)習(xí)記憶功能的損傷還表現(xiàn)在蛋白質(zhì)的氧化上，研究顯示，羰基化蛋白水平隨年齡的增長(zhǎng)而增加，是代表大腦衰老的重要標(biāo)志，蛋白質(zhì)的氧化修飾會(huì)削弱其功能，導(dǎo)致蛋白質(zhì)穩(wěn)態(tài)失衡，誘導(dǎo)蛋白質(zhì)錯(cuò)誤折疊、異常剪切的發(fā)生，進(jìn)而表現(xiàn)為學(xué)習(xí)及記憶功能的障礙[20-21]。在本研究中，D-半乳糖衰老模型小鼠血清及腦組織顯示出了較高的MDA累積水平，同時(shí)血清、肝臟及腦組織中羰基化蛋白水平也顯著高于空白對(duì)照組，說明了模型組小鼠出現(xiàn)了腦老化相關(guān)的氧化應(yīng)激損傷表現(xiàn)。然而，在乳清蛋白肽的干預(yù)下，與模型對(duì)照組相比，中劑量組小鼠顯示出了較低的血清MDA水平，高劑量組小鼠則表現(xiàn)出了血清及腦組織MDA累積水平的降低，同時(shí)血清及腦組織PC水平均顯著下降，說明了乳清蛋白肽具有改善衰老小鼠血清及腦組織氧化應(yīng)激水平的作用，同時(shí)與行為學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果結(jié)合分析，提示乳清蛋白肽干預(yù)學(xué)習(xí)記憶障礙的作用可能與降低氧化應(yīng)激損傷并改善機(jī)體抗氧化水平相關(guān)，其具體機(jī)制仍需根據(jù)進(jìn)一步研究進(jìn)行探討。

4 結(jié)論

綜上所述，乳清蛋白肽能夠改善D-半乳糖模型小鼠在開闊場(chǎng)實(shí)驗(yàn)的空間探索能力、水迷宮實(shí)驗(yàn)及新物體識(shí)別實(shí)驗(yàn)的學(xué)習(xí)與記憶能力，具有顯著的干預(yù)衰老相關(guān)學(xué)習(xí)記憶障礙效用，其作用機(jī)制可能與改善機(jī)體內(nèi)源性抗氧化酶活性，降低脂質(zhì)過氧化及蛋白質(zhì)過氧化水平相關(guān)。本實(shí)驗(yàn)為乳清蛋白肽的開發(fā)利用提供科學(xué)依據(jù)?！?/p>

參考文獻(xiàn)

[1]Lee H C，Wei Y H.Role of mitochondria in human aging[J].Journal of Biomedical Science，1997，4（6）：319-326.

[2]世界衛(wèi)生組織.第六十九屆世界衛(wèi)生大會(huì).通過生命全程方法促進(jìn)健康老齡化的多部門行動(dòng)：老齡化與健康全球戰(zhàn)略和行動(dòng)計(jì)劃草案秘書處的報(bào)告.2016.

[3]Denham H.Aging：a theory based on free radical and radiation chemistry[J].Journal of Gerontology，1956，11（3）：298-300.

[4]Ilaria L，Gennaro R，F(xiàn)rancesco C，et al.Oxidative stress，aging，and diseases[J].Clinical Interventions in Aging，2018（13）：757-772.

[5]周洪莉，張祚，周吉銀.GABA能神經(jīng)系統(tǒng)與學(xué)習(xí)記憶的研究進(jìn)展[J].國(guó)際精神病學(xué)雜志，2019，46（6）：961-963、970.

[6]林庚庭，唐興州，孟玲.老年腦梗死恢復(fù)期記憶障礙與自由基關(guān)系的研究[J].現(xiàn)代康復(fù)，2001（1）：84.

[7]Aspasia A，Chatzipaschali and Anastassios G，Stamati. Biotechnological utilization with a focus on anaerobic treatment of cheese whey：current status and prospects[J].Energies，2012，5（12）：3492-3525.

[8]劉永峰，張薇，劉婷婷，等.乳蛋白中乳清蛋白與酪蛋白組成、特性及應(yīng)用的研究進(jìn)展[J].食品工業(yè)科技，2020，41（23）：354-358.

[9]Majumder K，Wu J.Purification and characterisation of angiotensin I converting enzyme（ACE）inhibitory peptides derived from enzymatic hydrolysate of ovotransferrin[J].Food Chemistry，2011，126（4）：1614-1619.

[10]Daliri B M，Lee B H，Oh D H.Current trends and perspectives of bioactive peptides[J].Critical Reviews in Food Science & Nutrition，2017：2273-2284.

[11]Morato PN，Lollo PC，Moura CS，et al.A dipeptide and an amino acid present in whey protein hydrolysate increase translocation of GLUT-4 to the plasma membrane in Wistar rats[J].Food Chem，2013，139（1-4）：853-859.

[12]張宇，李曉東，劉璐，等.乳清蛋白降膽固醇肽的制備及活性研究[J].食品科技，2019，44（3）：14-20.

[13]Saint-Sauveur D，Gauthier S F，Boutin Y，et al. Immunomodulating properties of a whey protein isolate，its enzymatic digest and peptide fractions[J].International Dairy Journal，2008，18（3）：260-270.

[14]石輝，原麗，張軍，等.APPswe/PS1dE9雙轉(zhuǎn)基因阿爾茨海默病模型小鼠的行為學(xué)及病理學(xué)特征研究[J].神經(jīng)解剖學(xué)雜志，2016，32（4）：499-506.

[15]唐靚，李林子，胡文敏，等.吡咯喹啉醌對(duì)衰老大鼠學(xué)習(xí)記憶的影響及機(jī)制研究[J].中國(guó)食品衛(wèi)生雜志，2017，29（4）：407-411.

[16]白鑫宇，劉萍，楊帆，等.補(bǔ)陰益智湯配方顆粒對(duì)東莨菪堿所致小鼠學(xué)習(xí)記憶損傷的保護(hù)作用[J].中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2017，23（12）：138-144.

[17]Krishnan，Venkataraman，Sandhya，et al.Oxidative stress in aging-matters of the heart and mind.[J].International Journal of Molecular Sciences，2013，14（9）：17897-17925.

[18]Perluigi M，Swomley A M，Butterfield D A.Redox proteomics and the dynamic molecular landscape of the aging brain[J].Ageing Res Rev，2014，（13）：75-89.

[19]Chen Z，Zhong C.Oxidative stress in Alzheimer’s disease[J].Neurosci Bull，2014，30（2）：271-81.

[20]Garaschuk O，Semchyshyn H M，Lushchak V I.Healthy brain aging：Interplay between reactive species，inflammation and energy supply[J].Ageing Res Rev，2018，43：26-45.

[21]Wyss-Coray T.Ageing，neurodegeneration and brain rejuvenation[J].Nature，2016，539（7628）：180-186.

Effects of Whey Protein Peptide on Antioxidant and Learning and Memory Improvement in Aging Model Mice

YU Xiao-chen，LI Zhen，LIU Xin-ran，HU Jia-ni，LIU Rui，ZHU Na，LI Yong

（Department of Nutrition and Food Hygiene，School of Public Health，Peking University，Beijing 100191，China）

Abstract：Objective To investigate the antioxidant and learning and memory improvement effects of whey protein peptide on aging model C57BL/6N mice.Method Using 72 SPF male C57BL/6N mice，among them，12 mice were randomly selected as the blank control group，and the remaining mice were modeled by intraperitoneal injection of D-galactose 100 mg/kg BW.The models were made for 6 weeks，during which the mice in the blank control group were injected with the same amount of normal saline.After 6 weeks，blood was taken from the inner canthus and the serum MDA level was measured.According to the MDA level，the 60 mice were randomly divided into a model control group，a whey protein group 1.5 g/kg BW and 3 whey protein peptide intervention groups（0.3，1.5，3.0 g/kg BW）.The test sample aqueous solution was given by oral gavage every day.The intervention period was 30 days.During this period，the model control group，whey protein group and whey protein peptide group were maintained as D-galactose and the blank control group were injected intraperitoneally with normal saline.After the intervention，conduct behavioral experiments in the order of open-field test，Morris Water Maze experiment，and Novel Object Recognition experiment.After the behavioral experiment is over，the oxidative stress related indicators of mouse serum，liver，and brain tissue are tested.Result Compared with the blank control group，D-galactose aging model mice showed obstacles in exercise，exploration，learning and memory.The level of antioxidant enzymes in the model group was lower than that of the blank group，and the levels of malondialdehyde and protein carbonyln were higher.Compared with the model control group，whey protein peptide can significantly improve the spatial exploration，spatial and non-spatial learning and memory abilities of aging mice，increase the activity of serum and liver SOD，GSH-Px，and improve the accumulation of malondialdehyde and carbonylated protein in serum and brain tissue.Conclusion Whey protein peptide has anti-oxidation and improved learning and memory in aging mice.

Keywords：whey protein peptide;aging model;antioxidant;learning and memory

作者簡(jiǎn)介：于曉晨（1996— ），女，碩士研究生，研究方向：營(yíng)養(yǎng)與疾病。

通信作者：李 勇（1958— ），男，教授，博士，研究方向：營(yíng)養(yǎng)與疾病。