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    羅伊氏菌素與兒茶素協(xié)同對變異鏈球菌的抑制作用

    2021-01-20 06:50:08王思彤曲國強(qiáng)孫雪婷付恒芳劉麗波
    食品科學(xué) 2021年1期
    關(guān)鍵詞:兒茶素生物膜鏈球菌

    王思彤,張 彤,金 曼,曲國強(qiáng),孫雪婷,付恒芳,劉麗波,*,李 春

    (1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院,乳品科學(xué)教育部重點實驗室,黑龍江 哈爾濱 150030;2.黑龍江省綠色食品科學(xué)研究院,黑龍江 哈爾濱 150028;3.國家乳制品質(zhì)量監(jiān)督檢驗中心理化室,黑龍江 哈爾濱 150028)

    變異鏈球菌在牙齒表面形成生物膜是其致齲的基本特征,牙齒生物膜是自然界中最復(fù)雜的生物膜系統(tǒng)之一[1]。變異鏈球菌通過代謝蔗糖合成胞外多糖(extracellular polysaccharide,EPS),EPS對于凝集黏附菌體細(xì)胞于牙齒表面至關(guān)重要[2],高含量的EPS也有利于提高生物膜的穩(wěn)定性和結(jié)構(gòu)完整性,并為致病菌提供保護(hù),使其免受抗菌劑和其他不良環(huán)境攻擊的影響[3]。此外,變異鏈球菌分解糖類物質(zhì)產(chǎn)有機(jī)酸,酸性環(huán)境更有利于耐酸菌株變異鏈球菌發(fā)揮生長優(yōu)勢并侵蝕牙齒,進(jìn)一步促進(jìn)齲齒形成[4-5]。

    茶多酚是綠茶中主要活性物質(zhì),而兒茶素類物質(zhì)占茶多酚總量60%~80%[6],研究表明其具有抗癌[7]、抗氧化[8]等優(yōu)良特性。兒茶素類物質(zhì)能抑制口腔中致齲細(xì)菌生長和繁殖[9-10],且對牙周炎具有良好的預(yù)防作用[11]。羅伊氏菌素是由羅伊氏乳桿菌在厭氧條件下發(fā)酵甘油產(chǎn)生的[12],在水溶液中,羅伊氏菌素是一個動態(tài)系統(tǒng),3-羥基丙醛(3-hydroxypropionaldehyde,3-HPA)最近被確定為該系統(tǒng)的主要抗菌成分[13]。據(jù)推測3-HPA可能通過與核糖核苷酸競爭結(jié)合位點或與不穩(wěn)定的巰基反應(yīng)而抑制細(xì)菌DNA合成[14-15]。3-HPA在臨床中施用具有促進(jìn)口腔健康的作用,能夠使口腔中變異鏈球菌的數(shù)量明顯減少[16],Krasse等[17]以羅伊氏乳桿菌作為益生菌錠劑,對重度牙齦炎志愿者展開臨床實驗,結(jié)果觀察到志愿者炎癥減輕明顯,牙菌斑面積也大幅度減少。

    抗菌藥物的應(yīng)用和機(jī)械去除法是防治齲齒的主要傳統(tǒng)手段,但長期使用可能使細(xì)菌產(chǎn)生耐藥性,甚至引起菌群失調(diào)。目前,有許多基于天然植物成分[18-19]替代抗真菌藥的研究已用于預(yù)防齲齒以及促進(jìn)口腔健康,也有研究發(fā)現(xiàn)天然多酚類物質(zhì)與抗真菌藥相結(jié)合[20-21]具有協(xié)同效應(yīng),且能夠降低抗真菌藥的劑量。本研究為避免化學(xué)制劑和抗生素的使用,以及降低單組分的使用劑量和副作用,增強(qiáng)對變異鏈球菌生物膜的抑制作用,探究兒茶素與羅伊氏菌素的協(xié)同效應(yīng)。為今后開發(fā)天然、安全、有益的防齲產(chǎn)品提供理論依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1 菌株與試劑

    變異鏈球菌ATCC25175購于中國微生物菌種保藏中心CGMCC;羅伊氏乳桿菌保藏于東北農(nóng)業(yè)大學(xué)教育部乳品科學(xué)重點實驗室。

    兒茶素 卡邁舒(上海)生物科技有限公司(純度>98%);細(xì)菌基礎(chǔ)培養(yǎng)基(DeMan-Rogosa-Sharpe medium,MRS)、腦心浸液(brain heart infusion,BHI)培養(yǎng)基 青島高科園海博生物技術(shù)有限公司;其他試劑均為分析純。

    1.2 儀器與設(shè)備

    潔凈工作臺 力康精密科技(上海)有限公司;離心機(jī) 上海安亭科學(xué)儀器廠;酶標(biāo)儀 美谷分子儀器(上海)有限公司;紫外分光光度計 上海圣科儀器設(shè)備有限公司;掃描電子顯微鏡 上海復(fù)納科學(xué)儀器有限公司。

    1.3 方法

    1.3.1 菌種保存與活化

    將變異鏈球菌由標(biāo)準(zhǔn)菌株置于BHI液體培養(yǎng)基復(fù)蘇48 h,接著在厭氧培養(yǎng)箱中37 ℃條件下培養(yǎng)18 h,于BHI固體培養(yǎng)基劃線分離,鏡檢確定為純培養(yǎng)后,用體積分?jǐn)?shù)50%的甘油保存菌株,置于-20 ℃冰箱中保存?zhèn)溆?。取?0 ℃凍存的羅伊氏乳桿菌菌液,接種于MRS培養(yǎng)基中,37 ℃活化培養(yǎng)傳代使用。

    1.3.2 羅伊氏菌素的制備

    通過兩步發(fā)酵法[22]獲得羅伊氏菌素用于實驗。首先,將羅伊氏乳桿菌在MRS培養(yǎng)基上擴(kuò)大培養(yǎng),37 ℃厭氧生長12 h,隨后1 500×g離心5 min收獲細(xì)胞并洗滌制備饑餓細(xì)胞,在洗滌過程中使用質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.85% NaCl溶液洗滌2 次以確保沒有培養(yǎng)基殘留,饑餓時間約為1 h。然后,將洗滌后的細(xì)胞重懸浮于含有甘油的緩沖溶液中,37 ℃下培養(yǎng)2 h生產(chǎn)羅伊氏菌素。隨后將發(fā)酵液10 000 r/min離心5 min,取上清液過濾除菌,-20 ℃保存?zhèn)溆?。參照Lüthi-Peng等[23]的方法,測得粗提液3-HPA濃度為145 mmol/L。

    1.3.3 最低抑菌濃度及最小殺菌濃度的測定

    參照文獻(xiàn)[24]的方法并略作修改,在含有質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%蔗糖BHI培養(yǎng)基中制備兒茶素和3-HPA的系列梯度儲備溶液。使用96 孔板進(jìn)行微量測定,分別將100 μL每種濃度的兒茶素和3-HPA加入相應(yīng)的孔中,接著每孔加入100 μL終濃度為105~106CFU/mL的菌懸液。使兒茶素的終質(zhì)量濃度分別為8.0、4.0、2.0、1.0、0.5、0.25 mg/mL,3-HPA的終濃度分別為32、16、8、4、2、1 mmol/L。使用陰性對照(沒有加入菌液)和陽性對照(沒有任何抑菌物質(zhì)),在37 ℃下培養(yǎng)微孔板24 h后在酶標(biāo)儀上測定OD600nm。觀察變異鏈球菌生長濃度無明顯變化的最小兒茶素和3-HPA濃度即為最小抑制濃度(minimum inhibitory concentration,MIC),通過對BHI固體培養(yǎng)基進(jìn)行平板計數(shù)計算并確認(rèn)最小殺菌濃度(minimum bactericidal concentration,MBC)。一式3 份進(jìn)行測定,并進(jìn)行3 次獨立實驗。

    1.3.4 兒茶素和3-HPA對變異鏈球菌的聯(lián)合抑菌作用測定

    采用棋盤稀釋法[25]評估兒茶素和3-HPA對變異鏈球菌的抑菌作用能力:根據(jù)兒茶素和3-HPA對變異鏈球菌的單獨使用時MIC,將2 種藥液分別依次對比稀釋,稀釋濃度分別為2 MIC、MIC、1/2 MIC、1/4 MIC、1/8 MIC、1/16 MIC。取50 μL兒茶素倍比稀釋液,分別加在96 孔板的第2~7列,取50 μL 3-HPA倍比稀釋液,分別加在96 孔板的第2~7行。接著每孔再加入100 μL變異鏈球菌懸液,使菌液終濃度為105~106CFU/mL,以不接種菌液或無抑菌物質(zhì)的孔作為對照。微孔板37 ℃下培養(yǎng)24 h后測定OD600nm。沒有明顯生長的最低濃度被認(rèn)為是MIC。根據(jù)單獨與聯(lián)合抑菌情況,按下式計算分級抑制濃度指數(shù)(fractional inhibitory concentration index,F(xiàn)ICI),從而定量評價兩者的抗菌作用關(guān)系。

    FICI=(兒茶素聯(lián)合作用時MIC/兒茶素單獨作用時MIC)+(3-HPA聯(lián)合作用時MIC/3-HPA單獨時MIC)

    當(dāng)FICI≤0.5時表示協(xié)同作用,0.5<FICI≤1時表示相加作用,1<FICI≤2時表示無關(guān)作用,F(xiàn)ICI>2時表示拮抗作用。實驗一式3 份進(jìn)行測定。

    1.3.5 變異鏈球菌生物膜量的測定

    參照Li Bingchun等[26]的方法,略作改動。在96 孔板中加入200 μL含有1%蔗糖的BHI培養(yǎng)基,并接種適宜濃度的變異鏈球菌菌液,37 ℃培養(yǎng)48 h后。小心地吸出浮游細(xì)菌,用無菌磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline,PBS)洗滌平板上的生物膜。將200 μL稀釋到適宜濃度的兒茶素及3-HPA加入到96 孔中,設(shè)置空白對照組。繼續(xù)溫育5、30 min,6、12、24、48 h后,將96 孔板取出,小心地除去培養(yǎng)基,無菌PBS洗滌2 次,每孔添加200 μL體積分?jǐn)?shù)95%甲醇溶液固定微量滴定板中的生物膜,室溫下放置20 min。除去甲醇并洗滌,接著向孔中加入0.1%結(jié)晶紫125 μL在室溫下溫育15 min。無菌PBS洗滌3 次,37 ℃干燥2 h后,每孔加200 μL 95%乙醇溶液,振蕩脫色15 min,以充分釋放結(jié)晶紫,手動混合孔中的內(nèi)容物,最后每孔75 μL轉(zhuǎn)移到新的96 孔板中,并用分光光度計測定OD600nm。

    1.3.6 EPS含量的測定

    參照Goc等[27]方法,略作如下改動:向24 孔板中加入3 mL含有質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%蔗糖的BHI培養(yǎng)基,接種2%菌液,37 ℃下培養(yǎng)48 h以形成變異鏈球菌生物膜,除去浮游細(xì)菌,用無菌PBS洗滌生物膜2 次。接著用兒茶素及3-HPA處理生物膜5、30 min,6、12、24、48 h后吸出培養(yǎng)液,用細(xì)胞刮刀將生物膜刮下轉(zhuǎn)移到1.5 mL離心管中,用1 mL蒸餾水將生物膜重懸,4 ℃、6 000 r/min離心10 min,收集上清液,重新懸浮生物膜沉淀,洗滌2 次,再次以6 000 r/min離心10 min,合并上清液,檢測水溶性多糖(water-soluble glucan,WSG)含量。水洗后的沉淀加1 mL 0.5 mol/L NaOH溶液洗滌,離心3 次,合并上清液,測定水不溶性多糖(water-insoluble glucan,WIG)含量。兩部分上清液各取l mL,分別加入3 mL無水乙醇,4 ℃冰箱放置過夜,離心,棄水相,沉淀分別加入1 mL蒸餾水、1 mL 0.l mol/L NaOH溶液溶解,用蒽酮法分別測定水溶性及水不溶性葡聚糖含量。

    蒽酮法:取樣品1.0 mL,加蒽酮試劑3 mL,95 ℃水浴煮沸6 min,冷卻,測其625 nm波長處的吸光度,根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線及稀釋倍數(shù)計算樣品中多糖的含量。

    1.3.7 產(chǎn)酸能力的測定

    參考邵旭媛等[28]方法并略作改動。將兒茶素及3-HPA溶解于初始pH值為7.4的BHI培養(yǎng)基中。實驗組菌液與藥液按1∶10(V/V)接種變異鏈球菌,在37 ℃條件下分別溫育5、30 min以及6、12、24、48 h后,培養(yǎng)物經(jīng)6 000 r/min離心5 min,取上清液,測定上清液的pH值,并計算培養(yǎng)前后pH值的變化值(ΔpH)。

    1.3.8 掃描電子顯微鏡觀察生物膜結(jié)構(gòu)

    使用掃描電子顯微鏡觀察變異鏈球菌生物膜結(jié)構(gòu)的改變[29],在6 孔板中置入細(xì)胞爬片,每孔中分別加入3 mL單一兒茶素、3-HPA和協(xié)同濃度組并接入細(xì)菌培養(yǎng)液,對照組只接入菌液。37 ℃培養(yǎng)24 h,接著用戊二醛在4 ℃固定細(xì)胞2 h,PBS沖洗2 次,再分別用梯度體積分?jǐn)?shù)(50%、70%、90%、100%)乙醇脫水,最后將樣品冷凍干燥,噴金鍍膜,掃描電子顯微鏡觀察。

    1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

    采用Origin 2018軟件作圖,運用SPSS Statistics 20軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行處理分析,組間差異顯著性采用單因素方差分析進(jìn)行比較(P<0.05表示差異顯著)。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 兒茶素和3-HPA的MIC及MBC

    經(jīng)測定,兒茶素和3-HPA對變異鏈球菌的MIC分別為1 mg/mL及8 mmol/L,MBC分別為2 mg/mL及10 mmol/L。

    2.2 兒茶素和3-HPA對變異鏈球菌的協(xié)同作用

    如表1所示,兒茶素對變異鏈球菌單獨用時MIC為1 mg/mL,3-HPA單獨使用時MIC為8 mmol/L。計算各標(biāo)記(-)的聯(lián)合使用的FICI,選取最優(yōu)聯(lián)用組合。表中標(biāo)記(-)*處顯示兒茶素的MIC為0.125 mg/mL,3-HPA的MIC為2 mmol/L。兩抑菌物質(zhì)聯(lián)用時MIC明顯低于單獨使用時MIC,將得到的MIC代入FICI公式,計算并進(jìn)行判斷:FICI=0.125/1+2/8=0.375<0.5,表明兒茶素和3-HPA具有協(xié)同作用,因此采用(-)*處質(zhì)量濃度組合進(jìn)行后續(xù)實驗。

    表1 兒茶素和3-HPA對變異鏈球菌聯(lián)合藥敏實驗結(jié)果Table 1 Inhibitory effect of catechin combined with 3-HPA against S.mutans

    2.3 變異鏈球菌生物膜量的測定結(jié)果

    蔗糖可影響齲齒的生物膜特性,培養(yǎng)基中添加1%~5%的蔗糖可提高變異鏈球菌生物膜積累量和生物膜結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性,由此可能增加其致齲的風(fēng)險[30]。本實驗采用質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%蔗糖的BHI培養(yǎng)基來進(jìn)行生物膜測定實驗。在變異鏈球菌成熟生物膜上測試了3 組抑菌物質(zhì)的抑菌作用效果。圖1為單一兒茶素(MIC)或3-HPA(MIC)以及它們協(xié)同使用(兒茶素(1/8 MIC)+3-HPA(1/4 MIC))時對不同處理時間變異鏈球菌生物膜生成量的影響。6 h時僅3-HPA單獨作用和協(xié)同作用顯示出對目標(biāo)菌株的抑制作用。在培養(yǎng)12、24 h及48 h時兒茶素或3-HPA單獨及聯(lián)合使用都顯示出對變異鏈球菌生物膜顯著的抑制作用,僅用MIC兒茶素處理時生物膜量降低了19%、23.8%和21.4%,而協(xié)同組合降低了27.4%、33.5%和34.3%生物膜的量(P<0.05),這與Gabe等[31]研究沒食子酸辛酯對變形鏈球菌生物膜形成結(jié)果相似。而短時間10 min及30 min處理未見有顯著抑制作用(P>0.05)。

    圖1 兒茶素和3-HPA單用及其聯(lián)合使用對變異鏈球菌生物膜的影響Fig.1 Effect of catechin and/or 3-HPA on S. mutans biofilm

    2.4 EPS含量的測定結(jié)果

    圖2 兒茶素和3-HPA單用及其聯(lián)合使用對變異鏈球菌WSG(A)和WIG(B)的影響Fig.2 Effect of catechin and/or 3-HPA on contents of water-soluble glucan (A) and water-insoluble glucan (B) in S.mutans

    變異鏈球菌利用蔗糖分泌兩種EPS,WSG被釋放到培養(yǎng)上清液中為細(xì)菌提供能量,WIG黏附在牙齒表面并參與菌斑基質(zhì)的形成,EPS含量是衡量變異鏈球菌致齲性能的重要指標(biāo)[32]。如圖2A所示,WSG在6~12 h時分泌能力最強(qiáng),其含量顯著增加,這與早期生物膜形成需要大量的能源物質(zhì)與代謝底物有關(guān)[33],之后在12~48 h時分泌量以基本穩(wěn)定的趨勢不斷提高。用3 組抑菌物質(zhì)處理變異鏈球菌6 h后開始起到明顯的抑制作用,在處理24 h和48 h后,與對照組相比,協(xié)同組WSG分泌量分別顯著降低50.3%、45.2%,而單一兒茶素組WSG分泌量分別降低了27.8%、27.3%(P<0.05)。短時處理10 min后,單一藥物處理組及協(xié)同組與對照組相比差異不顯著(P>0.05)。

    如圖2B所示,對照組WIG在30 min~12 h時分泌量明顯增加,這與此階段需要大量WIG來維持生物膜結(jié)構(gòu)的形成有關(guān)[34],之后12~48 h WIG合成能力有所下降,分泌量增加趨勢趨于和緩平穩(wěn)。因此,抑菌物質(zhì)主要在30 min~12 h時施用抑制作用最為明顯,這與黃曉晶等[35]發(fā)現(xiàn)的在不同時間段變異鏈球菌體外EPS合成能力不同的結(jié)論相似。3 組抑菌物質(zhì)的WIG分泌量在30 min~48 h時與對照組相比差異顯著(P<0.05),且在24~48 h時協(xié)同組WIG分泌量顯著低于兩個單一用藥組(P<0.05),這一結(jié)果與2.3節(jié)3 組抑菌物質(zhì)對變異鏈球菌生物膜量的抑制結(jié)果相似。而在短時處理10 min后各抑菌用藥組與對照組相比未見有統(tǒng)計學(xué)上差異(P>0.05),這可能由于作用時間較短,單一兒茶素(MIC)或3-HPA(MIC)及協(xié)同組未對變異鏈球菌起到有效抑制作用。

    2.5 產(chǎn)酸能力的測定結(jié)果

    3 組抑菌物質(zhì)處理不同時間后對變異鏈球菌產(chǎn)酸能力的影響如圖3所示,在6~48 h時3 組抑菌物質(zhì)之間酸度變化均有顯著差異(P<0.05),按照抑制產(chǎn)酸能力由大到小的順序排列為:協(xié)同組(兒茶素(1/8 MIC)+3-HPA(1/4 MIC))>3-HPA(MIC)>兒茶素(MIC)。0~6 h與0~12 h時協(xié)同組對上清液中酸度影響最為明顯,6、12 h時,協(xié)同組作用后pH值分別降低0.53±0.02、0.81±0.08,與對照組相比,協(xié)同組分別抑制了76%、73%有機(jī)酸的產(chǎn)生。這可能也與此階段抑制了WSG的分泌,從而減少了產(chǎn)酸途徑中代謝底物量有關(guān)。在處理30 min時,僅單一兒茶素(MIC)組與空白對照組之間ΔpH值無顯著性差異(P>0.05),短時間處理10 min各組之間ΔpH值均無統(tǒng)計學(xué)上意義(P>0.05),處理6~48 h時各抑制物質(zhì)組與對照組相比均有顯著差異(P<0.05)。

    圖3 兒茶素和3-HPA單用及其聯(lián)合使用對變異鏈球菌產(chǎn)酸能力的影響Fig.3 Effect of catechin and/or 3-HPA on acid-producing capacity of S.mutans

    2.6 生物膜結(jié)構(gòu)的掃描電子顯微鏡觀察結(jié)果

    圖4 為對照組和經(jīng)3 組抑菌物質(zhì)處理后變異鏈球菌的掃描電子顯微鏡圖,未經(jīng)任何處理的變異鏈球菌菌體表面光滑呈短桿狀(圖4A1、B1),各個細(xì)體緊密相連,層層疊加,由密集的生物膜基質(zhì)緊緊包裹圍繞,形成密集均勻的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu),也因此其生物膜具有一定的厚度。而圖中致密生物膜基質(zhì)的形成是由于菌株培養(yǎng)基中添加了1%的蔗糖,蔗糖被變異鏈球菌利用生成更多葡聚糖,增強(qiáng)菌體黏附力的同時增加生物膜胞外基質(zhì)的量[36]。觀察經(jīng)過3 組抑菌物質(zhì)處理的電子顯微鏡圖,可發(fā)現(xiàn)變異鏈球菌菌體表面粗糙,有褶皺存在;菌體細(xì)胞數(shù)量明顯減少,菌落之間連接較為松散,生物膜結(jié)構(gòu)出現(xiàn)明顯改變,生物膜胞外基質(zhì)粗糙稀疏,網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)孔隙變大,出現(xiàn)不規(guī)則管道結(jié)構(gòu),生物膜厚度降低明顯(圖4)。

    圖4 兒茶素和3-HPA單用及其聯(lián)合使用時的變異鏈球菌掃描電子顯微鏡圖像Fig.4 Scanning electron microscopic image of S. mutans treated and not treated with catechin and/or 3-HPA

    3 討 論

    本實驗通過二步發(fā)酵法,利用羅伊氏乳桿菌轉(zhuǎn)化甘油生產(chǎn)3-HPA粗提液。采用棋盤稀釋法分析得到當(dāng)兒茶素(1/8 MIC)和3-HPA(1/4 MIC)聯(lián)合使用時其具有協(xié)同作用,因此采用此時的協(xié)同濃度組合與單一兒茶素(MIC)和3-HPA(MIC)相對比進(jìn)行抑菌機(jī)理的探討。結(jié)果表明協(xié)同組抑菌效果優(yōu)于單一用藥組,協(xié)同處理能顯著減少變異鏈球菌生物膜的生成、降低膜外基質(zhì)EPS的分泌、抑制產(chǎn)有機(jī)酸的能力,可看出其能夠有效抑制菌體在齒面的聚集與黏附,并參與底物代謝提高酸度,維持有益菌生存的口腔環(huán)境。3 組抑菌物質(zhì)處理組的掃描電子顯微鏡圖也可看出菌體數(shù)量減少,生物膜結(jié)構(gòu)改變,膜厚度降低,進(jìn)一步驗證了兒茶素及3-HPA對變異鏈球菌的抑菌機(jī)理。Wasfi等[37]對乳酸桿菌發(fā)酵上清液抑制變異鏈球菌作用機(jī)理均得到類似結(jié)論。Yang Ning等[21]將表沒食子兒茶素沒食子酸酯與抗真菌藥協(xié)同作用口腔念珠菌,觀察發(fā)現(xiàn)處理組能夠顯著降低生物膜的生成量,且協(xié)同使用增強(qiáng)了抑菌效果,降低了抑菌藥物的劑量,本實驗得出的結(jié)論與其研究相似。本研究為安全、新型的抑齲產(chǎn)品的開發(fā)提供了理論依據(jù)。但值得注意的是,在實際應(yīng)用于齲齒治療中,還應(yīng)當(dāng)考慮適宜的作用時間,形成便捷有效的預(yù)防措施。

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