基于環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)的產(chǎn)嘔吐毒素蠟樣芽胞桿菌特異性檢測(cè)

徐曉可，郭卉，鄧梅清，張菊梅，吳清平，丁郁,

（1.廣東嶺南職業(yè)技術(shù)學(xué)院健康管理學(xué)院，廣東廣州 510663）（2.暨南大學(xué)理工學(xué)院食品科學(xué)與工程系，廣東廣州 510632）（3.廣東省微生物研究所省部共建華南應(yīng)用微生物國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東廣州 510070）

蠟樣芽胞桿菌（Bacillus cereus）是一種兼性需氧的革蘭氏陽(yáng)性菌，產(chǎn)芽胞，廣泛分布于土壤、水、空氣和各類生熟食品中[1]。食用了該菌污染的食品容易導(dǎo)致食物中毒，引起的食物中毒類型主要包括腹瀉型中毒和嘔吐型中毒，其中腹瀉型中毒主要與某些菌株分泌腸毒素相關(guān)，而嘔吐型中毒主要是由于某些菌株產(chǎn)生嘔吐毒素引起[2-4]。

國(guó)內(nèi)外均有報(bào)道蠟樣芽胞桿菌引起的食物中毒事件。1950年在挪威發(fā)表了第一起蠟樣芽胞桿菌食物中毒的報(bào)告，之后許多國(guó)家，尤其是歐洲一些國(guó)家相繼報(bào)告了類似食物中毒的爆發(fā)。挪威和荷蘭將蠟樣芽胞桿菌認(rèn)定為食品中最易檢出的病原微生物[5]。我國(guó)在上世紀(jì)70年代報(bào)道蠟樣芽胞桿菌中毒事件后，此類中毒事件的報(bào)道逐年增多。據(jù)2008～2015年我國(guó)國(guó)家食源性疾病監(jiān)測(cè)網(wǎng)統(tǒng)計(jì)資料顯示，微生物性食源性疾病占比39%，其中蠟樣芽胞桿菌引起的中毒事件占17%，在細(xì)菌性病原體中排在第三[6]，危害極為嚴(yán)重。嘔吐型蠟樣芽胞桿菌引發(fā)的食物中毒時(shí)有發(fā)生，約占蠟樣芽胞桿菌食物中毒總數(shù)的 75.9%[7]。因此，建立一種快速、特異的方法檢測(cè)食品中產(chǎn)嘔吐毒素蠟樣芽胞桿菌至關(guān)重要。

目前檢測(cè)蠟樣芽胞桿菌的方法是食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗(yàn)蠟樣芽胞桿菌（GB 4789.14-2014），主要包括增菌、分離培養(yǎng)、鏡檢、生化鑒定、生化分型。對(duì)于分離的蠟樣芽胞桿菌主要是采用PCR或熒光定量PCR的方法鑒定其是否是嘔吐毒株（嘔吐毒素合成酶基因存在與否）。環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）是一種新興的檢測(cè)技術(shù)，它以其特異性強(qiáng)、等溫靈敏、操作簡(jiǎn)單、產(chǎn)物易檢測(cè)等優(yōu)點(diǎn)在食品安全檢測(cè)等領(lǐng)域得到了日益廣泛的應(yīng)用。在食源性致病菌方面，目前已經(jīng)建立了副溶血性弧菌（Vibrio parahaemolyticus）、沙門氏菌（Salmonellaspp.）、克羅諾桿菌（Cronobacterspp.）和蠟樣芽胞桿菌等致病菌的LAMP技術(shù)，但沒(méi)有從蠟樣芽胞桿菌中區(qū)分出產(chǎn)嘔吐毒素蠟樣芽胞桿菌的LAMP檢測(cè)方法報(bào)道[8-11]。本研究旨在以產(chǎn)嘔吐毒素蠟樣芽胞桿菌基因cesB為靶基因，設(shè)計(jì)LAMP反應(yīng)特異性引物，構(gòu)建LAMP反應(yīng)體系，建立一種產(chǎn)嘔吐毒素蠟樣芽胞桿菌的特異快速檢測(cè)技術(shù)，為衛(wèi)生檢驗(yàn)和食品質(zhì)量安全提供技術(shù)保障，不斷提高我國(guó)食品安全與公共衛(wèi)生控制水平。

1 材料與方法

1.1 菌株

本試驗(yàn)收集菌株62株，所有菌株均由廣東省微生物研究所提供。

1.2 培養(yǎng)基和試劑

胰蛋白胨肉湯、LB肉湯等培養(yǎng)基：廣東環(huán)凱微生物科技有限公司；BstDNA聚合酶：NEB公司；細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒，2×PCR Mix：廣州東盛生物科技有限公司；顯色劑：廣州迪奧生物科技有限公司；dNTPs，DNA Marker2000：生工生物工程（上海）股份有限公司；MgSO4和甜菜堿：Sigma公司。

1.3 主要儀器

低溫高速離心機(jī)：SIGMA 3K30，德國(guó)sigma公司；酶標(biāo)儀：EPOCH2，美國(guó)BioTek公司；PCR儀：Mini3220，杭州朗基科學(xué)儀器有限公司；電泳儀：DDR-6B，北京六一生物科技有限公司；凝膠成像系統(tǒng)：Tanon-4600SF，上海天能科技有限公司；移液槍：德國(guó)Eppendorf公司；生化培養(yǎng)箱：SPX-150B-Z，上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；恒溫水浴鍋：XMTD-8222，上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司。

1.4 方法

1.4.1 細(xì)菌培養(yǎng)

將菌株接種至在胰蛋白胨肉湯（TSB）培養(yǎng)，36±1 ℃培養(yǎng) 16～18 h。

1.4.2 DNA抽提

試劑盒法：按照試劑盒說(shuō)明書提取細(xì)菌基因組DNA。

煮沸法：取1 mL菌液或樣品增菌液于12000 r/min離心5 min，棄上清。加入200 μL無(wú)菌水洗滌1次后，用100 μL TE懸浮混勻，于100 ℃水浴10 min，冰浴3 min，12000 r/min離心5 min，取上清備用。

1.4.3 引物設(shè)計(jì)

表1 本研究所用引物序列Table 1 The sequence of primers

（1）LAMP引物設(shè)計(jì)：以產(chǎn)嘔吐毒素蠟樣芽胞桿菌cesB為靶基因，設(shè)計(jì)LAMP引物，引物序列見(jiàn)表1，由上海生物工程公司合成。

（2）PCR引物：參考文獻(xiàn)序列[12]，由上海生物工程公司合成。

1.4.4 LAMP擴(kuò)增

LAMP 反 應(yīng) 體 系 25 μL， 包 括 2.5 μL 10×Thermopol反應(yīng)緩沖液、1.6 mmol/L dNTPs、0.2 μmol/L上游外引物F3、0.2 μmol/L下游外引物B3、1.6 μmol/L上游內(nèi)引物FIP、1.6 μmol/L下游內(nèi)引物BIP、6 mmol/L MgSO4、1 mol/L甜菜堿、8 UBstDNA聚合酶、3 μL細(xì)菌DNA模板，加dd H2O至體積25 μL，加入顯色劑在PCR管蓋。擴(kuò)增反應(yīng)條件：63 ℃恒溫水浴1 h，不用開(kāi)蓋，通過(guò)顏色直接觀察結(jié)果。

1.4.5 PCR擴(kuò)增

PCR反應(yīng)體系和PCR擴(kuò)增程序參考張志鴻等的報(bào)道[10]。用1×TAE電泳緩沖液配制2%瓊脂糖凝膠，上樣5 μL，100 V電壓下30 min電泳，用凝膠成像系統(tǒng)觀察電泳結(jié)果并進(jìn)行分析。

1.4.6 LAMP特異性驗(yàn)證

將表2中所有菌株接種至TSB增菌液中37 ℃培養(yǎng)16～18 h后，取1 mL菌液用煮沸法提取DNA，然后進(jìn)行LAMP擴(kuò)增，驗(yàn)證LAMP反應(yīng)體系的特異性。

1.4.7 LAMP靈敏度評(píng)價(jià)

1.4.7.1 基因組靈敏度

將產(chǎn)嘔吐毒素蠟樣芽胞桿菌F4810/72在TSB增菌液中37 ℃培養(yǎng)16～18 h后，取1 mL菌液，用DNA抽提試劑盒抽提DNA，用酶標(biāo)儀測(cè)定DNA濃度。將上述DNA進(jìn)行梯度稀釋，進(jìn)行LAMP擴(kuò)增，評(píng)價(jià)該方法的DNA靈敏度。

1.4.7.2 純菌靈敏度

將產(chǎn)嘔吐毒素蠟樣芽胞桿菌F4810/72在TSB增菌液中37 ℃培養(yǎng)16～18 h后，取1 mL菌液，進(jìn)行梯度稀釋，用DNA抽提試劑盒抽提不同稀釋度的DNA，進(jìn)行LAMP擴(kuò)增，評(píng)價(jià)該方法的純菌靈敏度。同時(shí)對(duì)含不同稀釋度的菌液進(jìn)行平板計(jì)數(shù)。

1.4.8 人工污染樣品檢測(cè)

稱取經(jīng)國(guó)標(biāo)方法檢驗(yàn)不含蠟樣芽胞桿菌的新鮮米飯樣品25 g至225 mL LB培養(yǎng)基中，接種計(jì)數(shù)的產(chǎn)嘔吐毒素的蠟樣芽胞桿菌F4810/72菌液，人工模擬樣品的最終濃度分別為100cfu/g、101cfu/g、102cfu/g和103cfu/g，37 ℃靜置培養(yǎng)，在0、2、4和6 h后分別從增菌培養(yǎng)基中取1 mL上清液于無(wú)菌離心管中，提取DNA進(jìn)行LAMP檢測(cè)。同時(shí)對(duì)含不同稀釋度的菌液進(jìn)行平板計(jì)數(shù)。

表2 特異性試驗(yàn)所用菌株及實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 2 The specific detection of strains

1.4.9 食品中產(chǎn)嘔吐毒素蠟樣芽胞桿菌的檢測(cè)

購(gòu)買各大超市和快餐店的食品 72份，其中熟食24份，水產(chǎn)品24份，奶制品24份。每份樣品平均分成2份，一份按GB 4789.14-2014分離檢測(cè)；另一份直接用胰酪胨大豆多黏菌素肉湯培養(yǎng)基增菌培養(yǎng)，取1.5 mL增菌液按上述煮沸法提取DNA，進(jìn)行LAMP檢測(cè)。

2 結(jié)果與討論

2.1 LAMP特異性

為了驗(yàn)證所建立產(chǎn)嘔吐毒素蠟樣芽孢桿菌LAMP方法的特異性，本研究將設(shè)計(jì)的LAMP引物分別擴(kuò)增2株產(chǎn)嘔吐毒素蠟樣芽胞桿菌、19株蠟樣芽胞桿菌和41株非蠟樣芽胞桿菌的基因組DNA，檢測(cè)結(jié)果如表2所示。其中2株產(chǎn)嘔吐毒素蠟樣芽胞桿菌均為陽(yáng)性，顯色反應(yīng)呈現(xiàn)綠色；19株蠟樣芽胞桿菌和41株非蠟樣芽胞桿菌均為陰性，顯色反應(yīng)呈現(xiàn)橙色。說(shuō)明該LAMP引物僅針對(duì)產(chǎn)嘔吐毒素蠟樣芽孢桿菌cesB基因產(chǎn)生特異性擴(kuò)增，對(duì)蠟樣芽胞桿菌、蘇云金桿菌(Bacillus thuringiensis)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、單增李斯特菌(Listeria monocytogenes)、沙門氏菌等的DNA未產(chǎn)生擴(kuò)增反應(yīng)，LAMP擴(kuò)增的特異性良好，可用于產(chǎn)嘔吐毒素蠟樣芽孢桿菌的特異檢測(cè)。

2.2 LAMP靈敏度

2.2.1 DNA靈敏度

圖1 LAMP DNA靈敏度實(shí)驗(yàn)結(jié)果Fig.1 Sensitivity of the LAMP assay with genomic DNA

用DNA抽提試劑盒抽提產(chǎn)嘔吐毒素蠟樣芽胞桿菌F4810/72基因組DNA，用酶標(biāo)儀測(cè)定DNA的濃度為124 ng/μL。將上述DNA進(jìn)行梯度稀釋，進(jìn)行LAMP擴(kuò)增結(jié)果表明，LAMP的靈敏度為1.49 pg/μL（圖1）。這與徐匆等（2020）建立的單增李斯特菌的LAMP基因組靈敏度相當(dāng)[13]。

2.2.2 純菌靈敏度

培養(yǎng)產(chǎn)嘔吐毒素蠟樣芽胞桿菌F4810/72，純菌原始濃度為 5.0×108cfu/mL，梯度稀釋，分別取不同稀釋度菌懸液提取DNA，LAMP檢出情況見(jiàn)圖2。LAMP純菌靈敏度為 5.0×103cfu/mL。楊滴等建立了蠟樣芽胞桿菌的實(shí)時(shí)熒光定量PCR，其純菌靈敏度為1.0×103cfu/mL[14]，與本研究的靈敏度相當(dāng)。周巍等建立了LAMP技術(shù)檢測(cè)酸乳中蠟樣芽孢桿菌，其純菌靈敏度為6.4 cfu/mL，高于本研究的靈敏度[15]。

圖2 LAMP純菌靈敏度實(shí)驗(yàn)結(jié)果Fig.2 Sensitivity of the LAMP assay in pure culture

2.3 人工污染樣品檢測(cè)

培養(yǎng)產(chǎn)嘔吐毒素蠟樣芽胞桿菌F4810/72，人工污染米飯的接種濃度分別為2.0×100、2.0×101、2.0×102、2.0×103cfu/g，0、2、4和6 h后分別取樣品增菌液用試劑盒和煮沸法提取 DNA，LAMP檢出情況見(jiàn)表 3和圖3。當(dāng)起始污染菌量為2 cfu/g時(shí)，37 ℃增菌培養(yǎng)6 h，用試劑盒法和煮沸法提取的DNA，都可以檢出產(chǎn)嘔吐毒素蠟樣芽胞桿菌。Martina（2007）等建立了產(chǎn)嘔吐毒素蠟樣芽胞桿菌的實(shí)時(shí)熒光定量PCR。產(chǎn)嘔吐毒素蠟樣芽胞桿菌人工污染米飯，經(jīng)過(guò)6 h增菌，煮沸法提取DNA，靈敏度為100cfu/g[16]，本研究建立的LAMP體系靈敏度與其相當(dāng)。張志鴻等（2014）同樣建立了產(chǎn)嘔吐毒素蠟樣芽胞桿菌的實(shí)時(shí)熒光定量PCR，產(chǎn)嘔吐毒素蠟樣芽胞桿菌人工污染米飯，經(jīng)過(guò)2 h增菌，靈敏度為100cfu/g[12]，高于本研究中的2 cfu/g，但該研究需要使用特定的熒光定量PCR儀器和專業(yè)人員操作，不利于在基層檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室大規(guī)模推廣使用，無(wú)法滿足現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)的要求。當(dāng)起始污染菌量大于2.0×103cfu/g時(shí)，不用經(jīng)過(guò)增菌培養(yǎng)，LAMP可直接檢測(cè)出產(chǎn)嘔吐毒素蠟樣芽胞桿菌。Zhang（2014）等建立了產(chǎn)嘔吐毒素和非嘔吐毒素的蠟樣芽胞桿菌多重PCR，人工污染食品，不用經(jīng)過(guò)增菌培養(yǎng)，其靈敏度為3.6×103cfu/g[17]，與本研究的靈敏度相當(dāng)。

綜上所述，在大批量實(shí)際樣品檢測(cè)時(shí)，可以采用煮沸法提取DNA，從而節(jié)省時(shí)間和試劑。當(dāng)產(chǎn)嘔吐毒素蠟樣芽胞桿菌污染食品的濃度超過(guò)103cfu/g時(shí)，不需要增菌培養(yǎng)過(guò)程，可以直接檢出，從而縮短了檢測(cè)周期。由于食用蠟樣芽胞桿菌數(shù)量大于105cfu/g時(shí)有可能引起食物中毒甚至死亡，因此可以用本研究開(kāi)發(fā)的 LAMP方法直接快速篩查產(chǎn)嘔吐毒素蠟樣芽胞桿菌，排查其風(fēng)險(xiǎn)。

表3 產(chǎn)嘔吐毒素蠟樣芽胞桿菌人工污染米飯不同濃度不同增菌時(shí)間的LAMP檢測(cè)Table 3 Effects of different levels and pre-incubation times of artificially contaminated rice on sensitivity of the LAMP detection of emetic B. cereus

圖3 產(chǎn)嘔吐毒素蠟樣芽胞桿菌人工污染米飯不同濃度不同增菌時(shí)間的LAMP檢測(cè)結(jié)果Fig.3 Results of different levels and pre-incubation times of artificially contaminated rice on sensitivity of the LAMP detection of emetic B. cereus

2.4 食品中產(chǎn)嘔吐毒素蠟樣芽胞桿菌的檢測(cè)

72份食品樣品用傳統(tǒng)方法檢出2份產(chǎn)嘔吐毒素蠟樣芽胞桿菌陽(yáng)性樣品，包括一份熟食和一份巴氏奶。直接用LAMP檢測(cè)72份食品樣品，也檢出2份產(chǎn)嘔吐毒素蠟樣芽胞桿菌陽(yáng)性樣品，且同傳統(tǒng)方法一致，但比傳統(tǒng)方法的檢測(cè)時(shí)間大大縮短。

3 結(jié)論

本研究首次建立了基于cesB基因的產(chǎn)嘔吐毒素蠟樣芽胞桿菌LAMP檢測(cè)方法。建立的方法具有特異性強(qiáng)、快速的優(yōu)點(diǎn)。在基因組DNA水平的靈敏度為1.49 pg/μL，純菌靈敏度為5.0×103cfu/mL。人工污染米飯樣品，當(dāng)起始污染量為2 cfu/g時(shí)，37 ℃增菌培養(yǎng)6 h，即可檢出。當(dāng)產(chǎn)嘔吐毒素蠟樣芽胞桿菌污染食品的濃度超過(guò)103cfu/g時(shí)，不需要增菌培養(yǎng)過(guò)程，亦可以直接檢出。本研究建立的LAMP技術(shù)可應(yīng)用于食品樣品中產(chǎn)嘔吐毒素蠟樣芽胞桿菌的快速篩查檢測(cè)，簡(jiǎn)便快捷，具有較好的推廣應(yīng)用前景。