紅參水煎液對(duì)斑馬魚血管生長(zhǎng)干預(yù)作用的實(shí)驗(yàn)研究

石秀娟，邱伯雍，魏易洪，吳 瓊，鄧 兵，湯 諾，周 端，唐靖一

心肌缺血是多種心血管疾病發(fā)生發(fā)展的重要機(jī)制，血管新生可促進(jìn)血管側(cè)支循環(huán)建立，改善心肌血供，是治療缺血性心臟疾病的重要研究方向[1]。目前認(rèn)為人參可有效抗心肌缺血，具有很好的心臟保護(hù)作用[2]。而作為人參炮制品的紅參，是否具有促進(jìn)血管生長(zhǎng)的作用目前尚不清楚。

斑馬魚是一種較好的模式動(dòng)物，廣泛用于各項(xiàng)藥理研究中，亦用于血管生長(zhǎng)的研究。既往研究發(fā)現(xiàn)，生曬參水煎液雖然不能促進(jìn)斑馬魚正常的血管生長(zhǎng)，但在較低濃度時(shí)可以抑制血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子酪氨酸酶抑制劑Ⅱ(VEGF receptor kinase inhibitor Ⅱ，VRI)誘導(dǎo)的血管損傷，說明生曬參有一定的促進(jìn)血管生長(zhǎng)作用[3]。本研究以紅參為研究對(duì)象，建立斑馬魚正常血管生長(zhǎng)模型和血管損傷模型，使用紅參水煎液進(jìn)行干預(yù)，觀察其對(duì)血管生長(zhǎng)的藥理作用，為后續(xù)的研究奠定相關(guān)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物 轉(zhuǎn)基因斑馬魚(Fli1a-EGFP)由上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬龍華醫(yī)院斑馬魚實(shí)驗(yàn)室提供，使用自動(dòng)循環(huán)系統(tǒng)進(jìn)行喂養(yǎng)，方法同文獻(xiàn)[3]。

1.2 藥物、試劑及儀器

1.2.1 藥物 紅參飲片購自上海雷允上藥業(yè)有限公司(批號(hào)：1712010)，使用10倍于生藥的蒸餾水，大火煎煮至沸騰，小火微沸濃縮后再次加入蒸餾水，紗布過濾后，煎煮濃縮，制備成1 g/mL紅參儲(chǔ)備液，于-20 ℃冰箱保存。

1.2.2 試劑 二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)購自美國(guó)Sigma公司；VRI購自德國(guó)Calbiochem公司，用DMSO溶解成50 mmol/L儲(chǔ)備液，-20 ℃冰箱保存。

1.2.3 儀器 培養(yǎng)箱購自德國(guó)Heraues公司；Ti-U熒光倒置顯微鏡購自日本Nikon公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 紅參水煎液對(duì)正常斑馬魚模型的作用 選擇3～12個(gè)月齡的成熟斑馬魚，進(jìn)食2 h后按照雌雄1∶1或者1∶2放入產(chǎn)卵缸中，用隔板隔開，適應(yīng)一晚后，第2天亮燈前抽去隔板，使斑馬魚產(chǎn)卵。將受精卵放入裝有胚胎培養(yǎng)液(embryo medium，EM)的培養(yǎng)皿中，于28.5 ℃培養(yǎng)箱孵育24 h，選擇狀態(tài)良好的斑馬魚胚胎，顯微鑷下攝去胚胎卵殼。

紅參水煎液各濃度組采用EM水將紅參儲(chǔ)備液稀釋至不同濃度(1 μg/mL、3 μg/mL、10 μg/mL、30 μg/mL、100 μg/mL)，按照每孔1 mL加入24孔板后，加入斑馬魚幼魚每孔8條，空白對(duì)照組為1 mL培養(yǎng)液，孵育24 h后更換培養(yǎng)液及藥液，繼續(xù)孵育24 h后熒光顯微鏡觀察腸下血管。

1.3.2 紅參水煎液對(duì)VRI誘導(dǎo)血管損傷斑馬魚模型的作用 選擇在恒溫箱中孵育24 h、發(fā)育相近的斑馬魚胚胎，用顯微鑷攝去胚胎卵殼。VRI(50 mmol/L)用EM水稀釋至0.2 μmol/mL，按照每孔1 mL加入24孔板后，加入斑馬魚幼魚每孔8條，空白對(duì)照組加入1 mL培養(yǎng)液，VRI組加入1 mL的0.2 μmol/mL VRI，于恒溫箱中孵育24 h，24 h后，抽棄原飼養(yǎng)液，紅參水煎液各濃度組用EM水將紅參儲(chǔ)備液稀釋至不同濃度(1 μg/mL、3 μg/mL、10 μg/mL、30 μg/mL、100 μg/mL)，按每孔1 mL加入24孔板，空白對(duì)照組、VRI組各加入1 mL EM水，放回恒溫箱中繼續(xù)孵育24 h后，熒光顯微鏡觀察脊背節(jié)間血管。

1.4 觀察指標(biāo)及方法 將孵育好的斑馬魚放置于載玻片上，吸去多余水分，于熒光倒置顯微鏡下觀察血管。正常斑馬魚模型：觀察腸下血管條數(shù)、交叉及出芽，計(jì)算平均出芽數(shù)(出芽數(shù)/該組斑馬魚數(shù))、平均交叉數(shù)(交叉數(shù)/該組斑馬魚數(shù))，ImageJ測(cè)量血管直徑。VRI誘導(dǎo)血管損傷斑馬魚模型：觀察脊背節(jié)間血管個(gè)數(shù)(完整血管和缺陷血管)。方法參照文獻(xiàn)[3]。

2 結(jié) 果

2.1 紅參水煎液對(duì)斑馬魚腸下靜脈的作用 與空白對(duì)照組相比，紅參水煎液3 μg/mL組、30 μg/mL組、100 μg/mL組平均出芽數(shù)明顯增多(P<0.01)，紅參水煎液各濃度組平均交叉數(shù)比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，紅參水煎液10 μg/mL組腸下血管直徑有所增加(P<0.05)。詳見表1、圖1。

表1 各組平均出芽數(shù)、平均交叉數(shù)、血管直徑比較

圖1 紅參水煎液對(duì)斑馬魚腸下血管的作用

2.2 紅參水煎液對(duì)VRI誘導(dǎo)斑馬魚血管損傷模型的作用 與空白對(duì)照組相比，VRI組及紅參水煎液各濃度組完整血管明顯減少，缺陷血管增多，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；與VRI組相比，紅參水煎液1 μg/mL組完整型血管有所增多(P<0.05)，紅參水煎液3 μg/mL組、10 μg/mL組、30 μg/mL組、100 μg/mL組完整型血管明顯增多(P<0.01)，紅參水煎液10 μg/mL組、100 μg/mL組缺陷血管明顯減少(P<0.01)。詳見表2及圖2。

表2 各組完整血管、缺陷血管比較(±s) 單位：條

圖2 紅參水煎液對(duì)斑馬魚節(jié)間血管的作用

3 討 論

紅參是由人參經(jīng)高溫蒸制等工序加工后得到，在化學(xué)成分上較生曬參更為豐富，并產(chǎn)生人參皂苷Rg3等特有的化合物[4]，具有很好的藥理作用。在抗疲勞、抗衰老等方面，黃寶亮等[5]發(fā)現(xiàn)紅參中的精氨酸雙糖苷可改善小鼠力竭性游泳所致疲勞及免疫功能，具有抗疲勞及增強(qiáng)免疫的功效；曾露露等[6]使用紅參提取物干預(yù)D-半乳糖所致亞急性衰老小鼠，發(fā)現(xiàn)紅參提取物有明顯的抗衰老作用，機(jī)制可能與增強(qiáng)機(jī)體免疫能力、清除自由基和炎性因子有關(guān)。此外，紅參還有很多其他功效，如金光日等[7]使用紅參水提物對(duì)哮喘小鼠氣管炎癥進(jìn)行治療，發(fā)現(xiàn)紅參水提物可以抑制氣管炎癥，且可能通過抑制NF-κB p65等核轉(zhuǎn)錄因子來調(diào)節(jié)Th2；金玲等[8]發(fā)現(xiàn)紅參皂苷Rg5可以降低1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氫吡啶離子(MPP+)誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞活性氧族(ROS)和酪氨酸羥化酶表達(dá)水平，改善神經(jīng)細(xì)胞氧化應(yīng)激狀態(tài)；梁鈺彬等[9]發(fā)現(xiàn)紅參提取物可以促進(jìn)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞合成與一氧化氮釋放，降低內(nèi)皮素-1含量，發(fā)揮舒張血管作用。由此可見，紅參藥效的多效性值得深入研究。

促進(jìn)血管生長(zhǎng)是治療心血管疾病的主要研究方向，而紅參是否具有促進(jìn)血管生長(zhǎng)作用的報(bào)道不多。本研究在正常斑馬魚模型中發(fā)現(xiàn)，紅參水煎液雖然不能增加斑馬魚腸下靜脈的交叉數(shù)，但在一定濃度時(shí)可增加腸下靜脈的出芽數(shù)和增加斑馬魚腸下靜脈的直徑。而在VRI誘導(dǎo)的血管損傷模型中，使用VRI進(jìn)行血管損傷模型構(gòu)建。VRI可以阻斷血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)信號(hào)通路，而后者主要通過VEGF/VEGF受體(VEGFR)通路發(fā)揮促進(jìn)血管生長(zhǎng)的作用，是重要的生長(zhǎng)因子[10]，亦是重要的干預(yù)對(duì)象。本研究發(fā)現(xiàn)，紅參水煎液各濃度均有一定的恢復(fù)血管生長(zhǎng)的作用，并且10 μg/mL時(shí)效果最好。這些結(jié)果均說明紅參有一定的促進(jìn)血管生長(zhǎng)作用，并且與前期生曬參水煎液比較[3]，紅參水煎液促進(jìn)血管生長(zhǎng)的效果似乎更穩(wěn)定和明顯。孫娜等[11]將近20年中國(guó)知網(wǎng)、萬方、維普等數(shù)據(jù)庫中關(guān)于人參及炮制品的文獻(xiàn)資料進(jìn)行總結(jié)后發(fā)現(xiàn)，在人參加工成紅參過程中，產(chǎn)生了紅參特有成分，包括人參皂苷Rh2、Rs1等，并使人參在抗腫瘤、抗疲勞、抗衰老及促進(jìn)組織血液循環(huán)方面的活性增強(qiáng)。張淼等[12]亦認(rèn)為，人參經(jīng)過加工炮制后，所含有效成分如皂苷類、揮發(fā)油、糖類等均發(fā)生復(fù)雜變化，并同時(shí)伴有新的物質(zhì)生成。當(dāng)然，紅參與生曬參到底有哪些物質(zhì)成分差異，其藥效有哪些異同還需更多的研究證實(shí)，并且此次研究中，紅參促進(jìn)血管生長(zhǎng)的藥效較生曬參似乎更好，是否與炮制過程中的物質(zhì)變化有關(guān)需要進(jìn)一步研究。而趙遠(yuǎn)等[13]建立的大鼠脾氣虛證模型，采用生曬參之四君子湯與紅參之四君子湯進(jìn)行觀察比較，發(fā)現(xiàn)兩組均有較好的血管保護(hù)作用，但以生曬參更優(yōu)。這說明紅參與生曬參各有治療側(cè)重點(diǎn)，在臨床應(yīng)用中還是要靈活機(jī)變，辨證論治，達(dá)到最好療效。

總之，本研究發(fā)現(xiàn)紅參具有一定的促進(jìn)血管生長(zhǎng)作用，并且可能與VEGF有關(guān)。在后續(xù)研究中可以使用小鼠或大鼠進(jìn)一步進(jìn)行觀察和驗(yàn)證，以得到更強(qiáng)有力的證據(jù)。