m6A結(jié)合蛋白IGF2BP1在肝細(xì)胞癌中的基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)分析

周子寒 周先果陳佩琴林秋伶 馮世雄 溫秋萍 龔文峰 馬良 余紅平

作者單位：530021 南寧 1廣西醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院；2廣西醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院

原發(fā)性肝癌（簡(jiǎn)稱肝癌）是全球第六大常見惡性腫瘤，其死亡率居全部癌癥的第四位［1］。肝細(xì)胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是肝癌最常見的病理組織學(xué)類型，約占肝癌的90%以上。近年來(lái)，雖然HCC診斷和治療方面取得較大進(jìn)步，但其復(fù)發(fā)率和轉(zhuǎn)移率均較高，患者術(shù)后5年生存率仍較低［2］。目前肝癌的發(fā)病機(jī)制尚不完全清楚，給臨床上有效防治造成了巨大困難。

N6-甲基腺嘌呤（N6-methyladenosine，m6A）修飾是真核生物信使RNA（mRNAs）中最普遍、最豐富且最保守的內(nèi)部修飾［3］。m6A甲基化修飾主要發(fā)生在mRNA的終止密碼子和3′非翻譯區(qū)（3′UTR）位置上，可以影響RNA的轉(zhuǎn)錄、加工和翻譯等過(guò)程［4-5］。m6A修飾過(guò)程主要由甲基化轉(zhuǎn)移酶（Writers）、去甲基化酶（Erasers）和閱讀器（Readers）介導(dǎo)［6］。Writers是將甲基化修飾“寫入”RNA，即介導(dǎo)RNA的甲基化修飾過(guò)程，最常見的分子是METTL3和METTL14。Erasers能將RNA甲基化修飾信號(hào)“擦除”，即介導(dǎo)RNA的去甲基化修飾過(guò)程，如脂肪量和肥胖相關(guān)蛋白（FTO）和AlkB同源物5（ALKBH5）。Readers則是負(fù)責(zé)“讀取”RNA甲基化修飾的信息，并參與下游RNA的翻譯、降解等過(guò)程，如YTH家族蛋白YTHDF1-3、RNA結(jié)合蛋白異質(zhì)核蛋白A2B1（HNRNPA2B1）和真核轉(zhuǎn)錄起始因子 3（EIF3）。

胰島素樣生長(zhǎng)因子2-mRNA結(jié)合蛋白家族（insulinlike growth factor 2 mRNA-binding protein，IGF2BPs）是近年新發(fā)現(xiàn)的一類 m6A“reader”，包含 IGF2BP1～3。該蛋白家族可通過(guò)識(shí)別靶mRNA上的m6A修飾，增強(qiáng)靶mRNA穩(wěn)定性并促進(jìn)其翻譯［7］。其中，IGF2BP1的致癌作用最強(qiáng)，可以增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的增殖、轉(zhuǎn)移等能力［8］。有研究表明IGF2BP1可作為癌基因MYC轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)子，促進(jìn)其穩(wěn)定和翻譯［9］。此外，IGF2BP1還可以作用于靶mRNA的3′UTR端，干擾miRNA對(duì)mRNA的調(diào)控作用，例如可以削弱miRNA對(duì)LIN28B、SIRT1和MAPK6等基因的降解作用［8］。這些研究表明IGF2BP1可能是參與腫瘤發(fā)生發(fā)展的重要調(diào)控因子之一。然而，其在HCC發(fā)生發(fā)展中的潛在作用機(jī)制尚不完全清楚。本研究擬通過(guò)分析m6A閱讀器IGF2BP1在HCC中的表達(dá)水平及其對(duì)HCC患者預(yù)后的影響，并采用生物信息學(xué)的方法預(yù)測(cè)IGF2BP1依賴m6A甲基化促進(jìn)靶mRNA表達(dá)的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，探討IGF2BP1在HCC發(fā)生發(fā)展中的作用及其潛在機(jī)制。

1 資料和方法

1.1 研究對(duì)象

收集2019年10月在廣西醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院首診行肝癌肝切除術(shù)的HCC患者，共5例。入組標(biāo)準(zhǔn)：病理診斷為HCC，均為HBV陽(yáng)性患者，術(shù)前未接受過(guò)放療、化療等抗腫瘤治療。所有患者均簽署知情同意書。本研究經(jīng)廣西醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。收集患者癌及相應(yīng)癌旁組織，提取總RNA，由上海云序公司進(jìn)行mRNA測(cè)序。

從 TCGA 數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//tcga-data.nci.Nih.gov/tcga/）下載LIHC數(shù)據(jù)集，包括371例HCC癌組織及50例癌旁組織的mRNA測(cè)序數(shù)據(jù)（mRNA-seq）。

1.2 IGF2BP1對(duì)HCC總生存期的影響

TCGA-LIHC數(shù)據(jù)集中包含了371例HCC患者的臨床隨訪資料。在371例HCC患者的臨床隨訪數(shù)據(jù)中僅保留生存時(shí)間≥30 d的患者，最終共納入343例HCC患者。IGF2BP1表達(dá)水平的最佳截?cái)嘀担╟utoff=5.739）由 R 軟件（3.5.2版本）“survminer”程序包中的“surv_cutpoint”函數(shù)計(jì)算，并根據(jù)cutoff值將HCC患者分為IGF2BP1高表達(dá)組和IGF2BP1低表達(dá)組?？偵嫫趶氖中g(shù)日至任何原因?qū)е滤劳龅臅r(shí)間。采用Kaplan-Meier法及l(fā)og-rank檢驗(yàn)分析IGF2BP1表達(dá)水平對(duì)HCC患者總生存期的影響，P<0.05表示IGF2BP1高表達(dá)組和IGF2BP1低表達(dá)組患者的總存期存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

1.3 差異mRNA分析

采用R軟件（3.5.2版本）中的edgeR程序包用于5對(duì)HCC癌及相應(yīng)癌旁組織mRNA-seq的進(jìn)行差異差異分析；DEseq2程序包用于TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中HCC癌及癌旁組織mRNA-seq的差異分析。差異倍數(shù)（fold change，F(xiàn)C）=癌中基因表達(dá)/癌旁中基因表達(dá)，log2FC用于評(píng)估基因在HCC癌及癌旁之間的差異表達(dá)水平，log2FC>3且P<0.001表示基因在HCC中高表達(dá)，log2FC<-3且P<0.001表示基因在HCC中低表達(dá)。

1.4 IGF2BP1的基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)分析

1.4.1 IGF2BP1的共表達(dá)網(wǎng)絡(luò) 基于TCGA-LIHC的mRNA-seq篩選在HCC癌及癌旁中差異表達(dá)的mRNA，使用Pearson分析差異mRNA和IGF2BP1之間的共表達(dá)關(guān)系，篩選與IGF2BP1表達(dá)密切相關(guān)的mRNA（|r|>0.3，P<0.05）。

1.4.2 IGF2BP1與基因m6A甲基化的關(guān)聯(lián)分析 m6Avar數(shù)據(jù)庫(kù)是RNA甲基化研究常用的數(shù)據(jù)庫(kù)之一。通過(guò)m6Avar數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)mRNA的m6A甲基化位點(diǎn)及其RNA結(jié)合蛋白等信息，分析IGF2BP1參與調(diào)控的關(guān)鍵基因及其m6A甲基化過(guò)程，應(yīng)用Cytoscape軟件構(gòu)建IGF2BP1在HCC中的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。

2 結(jié)果

2.1 IGF2BP1在HCC中的表達(dá)水平

基于5對(duì)HCC癌和相應(yīng)癌旁組織的mRNA測(cè)序數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)，IGF2BP1基因在HCC癌組織中呈高表達(dá)（log2FC=10.684，P<0.001）。同時(shí)對(duì) TCGA-LIHC的mRNA測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)IGF2BP1基因在HCC組織中亦呈高表達(dá)（log2FC=7.032，P<0.001）。肝癌樣本mRNA測(cè)序數(shù)據(jù)與TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)分析結(jié)果均顯示，IGF2BP1基因在HCC癌及癌旁組織間的差異倍數(shù)均高于其他m6A相關(guān)基因，見表1。

2.2 IGF2BP1對(duì)HCC患者總生存時(shí)間的影響

進(jìn)一步利用TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中的343例HCC患者的臨床隨訪資料，分析IGF2BP1基因表達(dá)水平與HCC患者總生存期的關(guān)系。結(jié)果顯示，IGF2BP1低表達(dá)患者的中位生存時(shí)間為5.84年，IGF2BP1高表達(dá)患者的中位生存時(shí)間為4.44年，IGF2BP1基因高表達(dá)可縮短患者的總生存期（P=0.011），見圖1。

表1 m6A相關(guān)基因在HCC中的表達(dá)情況Tab.1 The expression of m6A-associated gene in HCC

圖1 IGF2BP1表達(dá)水平與HCC患者總生存期的關(guān)系Fig.1 The relationship between IGF2BP1 expression and overall survival of HCC patients

2.3 IGF2BP1的基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)分析

為了探討IGF2BP1在HCC發(fā)生發(fā)展中的潛在作用機(jī)制，進(jìn)一步預(yù)測(cè)其在HCC中的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，本課題組基于TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)篩選出在HCC癌及癌旁組織中差異表達(dá)的基因（篩選標(biāo)準(zhǔn)：|log2FC|>3且P<0.001），共696個(gè)。采用Pearson法分析IGF2BP1基因與其他695個(gè)基因的共表達(dá)關(guān)系，結(jié)果發(fā)現(xiàn)108個(gè)基因與IGF2BP1基因的表達(dá)水平密切相關(guān)（相關(guān)系數(shù)|r|>0.3，P<0.05）。進(jìn)一步通過(guò)m6Avar網(wǎng)站預(yù)測(cè)含有m6A修飾位點(diǎn)的mRNA，發(fā)現(xiàn)上述的108個(gè)基因中有93.5%的mRNA存在m6A位點(diǎn)，其中22個(gè)基因與IGF2BP1蛋白存在結(jié)合關(guān)系，見表2。分析這22個(gè)基因表達(dá)量對(duì)HCC患者總生存期的影響，結(jié)果篩選出16個(gè)mRNA與HCC預(yù)后相關(guān)，其中HMGA2等15個(gè)mRNA高表達(dá)水平可縮短患者的總生存期，而RHO的高表達(dá)可延長(zhǎng)患者的總生存期，見圖2～3。

對(duì)22個(gè)基因的m6A位點(diǎn)進(jìn)行注釋分析，結(jié)果顯示，HMGA2、PEG10、CEP55、RHO、CDC6 和 KIF23 基因中的m6A位點(diǎn)位于mRNA 3′UTR端的miRNA結(jié)合區(qū)域，通過(guò)miRanda和Targetscan在線網(wǎng)站預(yù)測(cè)出了6個(gè)mRNA在m6A相關(guān)區(qū)域內(nèi)存在靶向結(jié)合關(guān)系的miRNA。根據(jù)上述結(jié)果預(yù)測(cè)IGF2BP1在miRNA-mRNA機(jī)制中的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，如圖2所示。

表2 IGF2BP1的共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)Tab.2 The co-expression network of IGF2BP1

圖2 IGF2BP1在HCC中的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)Fig.2 The regulatory network of IGF2BP1 in HCC

圖3 HMGA2、PEG10、CEP55、RHO、CDC6 和 KIF23 基因表達(dá)水平與HCC患者總生存期的關(guān)系Fig.3 The relationship between the expression levels of HMGA2，PEG10，CEP55，RHO，CDC6 and KIF23 genes and overall survival of HCC patients

3 討論

RNA結(jié)合蛋白IGF2BP1可作為轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控轉(zhuǎn)錄，調(diào)控與腫瘤細(xì)胞增殖、侵襲轉(zhuǎn)移過(guò)程密切相關(guān)的mRNA表達(dá)，在多種癌癥中表達(dá)上調(diào)，并與患者的不良預(yù)后密切相關(guān)，如肺癌、食管癌和HCC等［10-11］。本研究基于5對(duì)HCC癌和癌旁組織的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)及TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)的mRNA測(cè)序數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)IGF2BP1在HCC中表達(dá)上調(diào)，且其高表達(dá)可縮短患者的總生存期，與既往研究結(jié)果一致，再次證明IGF2BP1在HCC中發(fā)揮促癌作用。進(jìn)一步利用TCGA和m6Avar數(shù)據(jù)庫(kù)共篩選出22個(gè)基因與IGF2BP1基因存在靶向結(jié)合關(guān)系，并與其表達(dá)水平呈正相關(guān)。通過(guò)分析這22個(gè)基因?qū)CC患者預(yù)后的影響，發(fā)現(xiàn)HMGA2等15個(gè)基因的高表達(dá)水平可以縮短HCC患者總生存期。其中，HMGA2［12］、PEG10［13］、PRAME［14］、DLX2［15］、CEP55［16］、ZIC5［17］、CDC6［18］、CDCA2［19］、MCM10［20］和 KIF23［21］基因在HCC中的表達(dá)及其對(duì)預(yù)后影響的報(bào)道與本研究結(jié)果一致。以上研究結(jié)果再次表明IGF2BP1可以促進(jìn)癌基因的表達(dá)，并與HCC的不良預(yù)后密切相關(guān)。

2019年，MULLER等［22］研究發(fā)現(xiàn)血清反應(yīng)因子SRF的3′UTR端存在m6A修飾位點(diǎn)，IGF2BP1通過(guò)m6A甲基化增強(qiáng)SRF的轉(zhuǎn)錄活性，并削弱miRNA靶向結(jié)合SRF 3′UTR端而降解mRNA的能力，從而增加SRF的表達(dá)水平，促進(jìn)卵巢癌、肝癌和肺癌細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移。此外，該研究還篩選出與IGF2BP1/SRF表達(dá)呈正相關(guān)的35個(gè)mRNA，最終構(gòu)建了由37個(gè)基因組成的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)且發(fā)現(xiàn)其高表達(dá)均可降低腫瘤患者的總生存期。本研究發(fā)現(xiàn) HMGA2、PEG10、CEP55、RHO、CDC6和KIF23基因中的m6A甲基化位點(diǎn)位于mRNA 3′UTR端的miRNA結(jié)合區(qū)域，提示m6A甲基化可能影響mRNA與miRNA的靶向結(jié)合關(guān)系，而且IGF2BP1可能在其中起重要的調(diào)控作用。以上結(jié)果提示在HCC中IGF2BP1可能通過(guò)拮抗miRNA對(duì)mRNA的調(diào)控作用，從而促進(jìn)癌基因的表達(dá)，但這一結(jié)論仍需進(jìn)一步的細(xì)胞功能學(xué)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

綜上所述，IGF2BP1在HCC中高表達(dá)，且其高表達(dá)水平導(dǎo)致患者總生存期縮短，潛在機(jī)制可能是通過(guò)m6A甲基化及miRNA抑制作用增加mRNA的表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)HCC的發(fā)生并導(dǎo)致不良預(yù)后。