GATA4基因甲基化及GATA4對非小細(xì)胞肺癌生長的影響及其作用機(jī)制

夏宇曾敏賈斌孫峰劉雪梅王海月

作者單位：830054 烏魯木齊 1新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院呼吸與呼吸危重癥中心二病區(qū)；830011 烏魯木齊 2新疆醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院胸腹放療科

肺癌發(fā)病率和死亡率在全球癌癥中分別居第2位和第 1位［1］。非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）占肺癌的75%以上，多數(shù)NSCLC患者確診時(shí)已屬晚期，預(yù)后較差［2］。有研究顯示DNA甲基化與肺癌發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)［3］。GATA4是鋅指轉(zhuǎn)錄因子家族成員之一，其活性受翻譯后修飾調(diào)控，包括磷酸化、乙?；?、甲基化和類泛素化修飾［4］。在卵巢癌中，GATA4常因啟動子異常甲基化而被沉默［5］。也有研究顯示GATA4在NSCLC細(xì)胞中呈甲基化狀態(tài)，CD40配體通過促進(jìn)GATA4去甲基化，上調(diào)GATA4表達(dá)，介導(dǎo)NSCLC細(xì)胞DNA損傷反應(yīng)并促進(jìn)細(xì)胞衰老［6］。但是目前GATA4在NSCLC中的作用及其機(jī)制尚不明確。本研究探討GATA4在NSCLC組織中的甲基化狀態(tài)及其對NSCLC細(xì)胞生長的影響和可能的調(diào)控機(jī)制，以期明確GATA4在NSCLC中的作用，為闡明NSCLC發(fā)病機(jī)制及開發(fā)新的臨床治療靶點(diǎn)提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 組織標(biāo)本

收集2017年7月—2018年6月于新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院接受肺癌根治術(shù)的78例NSCLC患者癌組織及其癌旁組織。年齡34～77歲，平均年齡（57.7±12.9）歲，其中男性56例；肺腺癌 46例，肺鱗狀細(xì)胞癌32例。納入標(biāo)準(zhǔn)：⑴經(jīng)組織病理學(xué)診斷為NSCLC；⑵順利行肺癌根治術(shù)；⑶術(shù)前未接受放療、化療、生物療法等抗癌治療。排除標(biāo)準(zhǔn)：⑴合并其他惡性腫瘤者；⑵合并嚴(yán)重心、肝、腎等重要臟器功能損傷或其他嚴(yán)重基礎(chǔ)疾病者。本研究經(jīng)新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院倫理委員會審批通過，患者知情同意并簽署知情同意書。

1.2 主要材料

人肺癌細(xì)胞株 A549、HCC827、NCI-H1299 和人正常肺上皮細(xì)胞BEAS-2B購自中國科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會細(xì)胞庫，用含10%FBS的RPMI 1640培養(yǎng)基，于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。血液、細(xì)胞、組織基因組DNA提取試劑盒購自天根生化科技（北京）有限公司；DNA重亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化試劑盒購自英國沃特曼；GATA4、p-ERK、ERK和p38抗體購自英國Abcam公司；p-p38抗體購自美國Cell Signaling Technology公司；GAPDH抗體購自武漢三鷹生物技術(shù)有限公司；GATA4干擾（sh-GATA4-1和sh-GATA4-2）及其陰性對照（sh-NC）、GATA4過表達(dá)載體（pLV-GATA4）及其空載體對照的慢病毒液（pLV-NC）購自武漢金開瑞生物工程有限公司；CCK-8檢測試劑盒購自美國MedChem Express公司；Annexin V-FITC/PI熒光雙染細(xì)胞凋亡檢測試劑盒購自武漢普諾賽生命科技有限公司。

1.3 MSP檢測組織和細(xì)胞GATA4基因甲基化狀態(tài)

按照DNA提取試劑盒說明書提取各組細(xì)胞和組織中的總DNA，并測定DNA濃度及純度。參照DNA重亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化試劑盒說明書的操作步驟進(jìn)行DNA重亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化及DNA純化。根據(jù)GATA4基因序列信息，利用Methyl Primer Express v1.0軟件設(shè)計(jì)GATA4基因的甲基化引物和去甲基化引物然后進(jìn)行PCR反應(yīng)。甲基化上游引物為5′-GTATAGTTTCGTAGTTTGCGTTTAGC-3′，下游引物為 5′-AACTCGCGACTCGAATCCCCG-3′；去甲基化上游引物為 5′-TTTGTATAGTTTTGTAGTTTGTGTTTAGT-3′，下游引物為 5′-CCCAACTCACAACTCAAATCCCCA-3′。PCR擴(kuò)增條件：95℃3 min；95 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，共 40個循環(huán)；72 ℃10 min。反應(yīng)結(jié)束后，PCR產(chǎn)物用2%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測。PCR產(chǎn)物大小為140 bp。

1.4 qMSP檢測組織中GATA4基因甲基化程度

參考文獻(xiàn)［7］，應(yīng)用qMSP檢測組織中GATA4基因甲基化程度。按照步驟1.3進(jìn)行組織DNA提取、DNA重亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化及DNA純化。制備非甲基化DNA作為陰性對照，完全甲基化DNA為陽性對照，兩者以不同比例混合，分別配制成0、10%、25%、50%、75%、90%和100%DNA甲基化標(biāo)準(zhǔn)樣本，進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。將已處理的組織DNA作為模板進(jìn)行RT-PCR實(shí)驗(yàn)，計(jì)算GATA4基因甲基化程度（%）。GATA4上游引物為5′-ATAAAGCTGACCCTGGGCAC-3′，下游引物為 5′-GGGTGAATTCAGCTGCTCCT-3′。

1.5 RT-PCR檢測GATA4 mRNA表達(dá)

用Trizol試劑提取各組細(xì)胞和組織中的總RNA，并逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。按照SYBR?RPremix Ex TaqTMⅡ試劑盒說明書的操作步驟進(jìn)行RT-PCR實(shí)驗(yàn)。反應(yīng)條件：95 ℃、30 s；95 ℃、5 s，60 ℃、34 s，40 個循環(huán)。以GAPDH為內(nèi)參，采用 2-ΔΔCt法計(jì)算 mRNA表達(dá)。GATA4上游引物為5′-ATAAAGCTGACCCTGGGCAC-3′，下游引物為 5′-GGGTGAATTCAGCTGCTCCT-3′；GAPDH 上游引物為 5′-TGGGTGTGAACCATGAGAAG-3′，下游引物為5′-GTGTCGCTGTTGAAGTCAGA-3′。

1.6 Western blot檢測 GATA4、p-ERK、ERK、p-p38和p38蛋白表達(dá)

用RIPA裂解液裂解細(xì)胞或組織，取上清液，并根據(jù)BCA法測定蛋白濃度。取30 μg蛋白進(jìn)行SDS-PAGE分離，用濕轉(zhuǎn)法將蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜上，10%脫脂奶粉室溫封閉 3 h 后，分別加入 GATA4 抗體（1∶5 000）、p-ERK 抗體（1∶1 000）、ERK 抗體（1∶1 000）、p-p38 抗體（1∶1 000）、p38 抗體（1∶2 000）和 GAPDH 抗體（1∶5 000），4℃孵育過夜；次日加入HRP標(biāo)記的二抗（1∶5 000），室溫孵育1 h。加入ECL發(fā)光液，顯色、暗室曝光。用Image J軟件測定蛋白條帶的灰度值，以GAPDH為內(nèi)參進(jìn)行目的蛋白相對定量。

1.7 慢病毒感染細(xì)胞

將對數(shù)期生長的A549細(xì)胞接種于6孔板中，接種密度為4×105/mL，于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，更換培養(yǎng)基為含6 μg/mL polybrene的2 mL新鮮培養(yǎng)基，將MOI=70的GATA4干擾sh-GATA4-1和sh-GATA4-2慢病毒液（sh-GATA4組）、干擾載體陰性對照慢病毒液（sh-NC組）、GATA4過表達(dá)載體慢病毒液（pLV-GATA4組）及其空載體對照慢病毒液（pLV-NC組）加至細(xì)胞中，同時(shí)設(shè)置空白對照組（Blank組），轉(zhuǎn)染48 h后，進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.8 CCK-8實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞活力

將各組轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞以5×103/孔接種于96孔板，每組設(shè)置3個復(fù)孔，分別于細(xì)胞培養(yǎng)0 h、24 h、48 h和72 h時(shí)，向每孔加入10 μL CCK-8溶液，于37℃條件下孵育3 h后，采用酶標(biāo)儀測定波長450 nm處的光密度（OD）值。以O(shè)D值為縱坐標(biāo)，時(shí)間為橫坐標(biāo)，繪制細(xì)胞生長曲線。

1.9 細(xì)胞克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞增殖情況

用0.25%胰酶消化對數(shù)期生長的A549細(xì)胞，并制成單細(xì)胞懸液。取5 mL含200個A549細(xì)胞懸液接種于60 mm培養(yǎng)皿中，于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2周，用PBS清洗，4%多聚甲醛固定，0.1%結(jié)晶紫染液染色1 h，流水緩慢洗去染液，空氣干燥。

1.10 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡

將轉(zhuǎn)染后的各組A549細(xì)胞以2.5×106/mL密度接種于6孔培養(yǎng)板，培養(yǎng)24 h后加入300 μL的1×Binding Buffer重懸細(xì)胞。加入 5 μL的 Annexin V-FITC染液，混勻，室溫避光孵育15 min。隨后加入5 μL 的 PI染液，補(bǔ)加 200 μL 的 1×Binding Buffer，上流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測。

1.11 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 21.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，GATA4在 NSCLC 組織和癌旁組織中的甲基化水平差異以及GATA4基因甲基化狀態(tài)與患者臨床病理特征的關(guān)系采用χ2檢驗(yàn)；GATA4基因甲基化程度與GATA4 mRNA表達(dá)，GATA4、p-ERK、p-p38和Bcl-2蛋白表達(dá)的相關(guān)性采用Spearman相關(guān)分析；NSCLC組織和癌旁組織間比較采用配對樣本t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析，若組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，則采用LSD-t檢驗(yàn)進(jìn)行多重比較。以雙側(cè)P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 GATA4在NSCLC組織和細(xì)胞中的表達(dá)及甲基化情況

NSCLC組織中GATA4基因甲基化率為74.4%，高于癌旁組織的 16.7%（χ2=22.941，P ＜0.001）；GATA4 mRNA和蛋白表達(dá)低于癌旁組織（P＜0.001）。GATA4基因甲基化程度與GATA4 mRNA和蛋白表達(dá)呈負(fù)相關(guān)（r=-0.736，-0.643，均 P＜0.001），見圖 1。GATA4 基因在A549和HCC827細(xì)胞中呈完全甲基化狀態(tài)，在NCI-H1299細(xì)胞中呈未完全甲基化，而在BEAS-2B細(xì)胞中呈去甲基化。A549、HCC827和NCI-H1299細(xì)胞中GATA4 mRNA和蛋白表達(dá)低于BEAS-2B細(xì)胞（均P＜0.01），其中在A549細(xì)胞中表達(dá)最低，因此選取A549細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。見圖2。

2.2 NSCLC組織中GATA4基因甲基化狀態(tài)與患者臨床病理特征的關(guān)系

NSCLC組織中GATA4基因甲基化狀態(tài)與TNM分期和腫瘤大小有關(guān)（均P＜0.05），但與年齡、性別和病理學(xué)類型無關(guān)（均P＞0.05），見表1。

2.3 GATA4基因甲基化對NSCLC組織中p-ERK、p-p38、Bax和Bcl-2表達(dá)的影響

Western blot檢測結(jié)果顯示，NSCLC組織中p-ERK、p-p38、Bcl-2蛋白表達(dá)均高于癌旁組織（均P＜0.001），Bax蛋白表達(dá)低于癌旁組織（P＜0.001）。GATA4基因甲基化程度與p-ERK、p-p38和Bcl-2蛋白表達(dá)呈正相關(guān)（P=0.008；P=0.011；P=0.007），與 Bax蛋白表達(dá)呈負(fù)相關(guān)（P=0.005）。見圖3。

2.4 sh-GATA4對A549細(xì)胞的干擾作用

RT-PCR和Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，sh-GATA4-1和sh-GATA4-2組細(xì)胞中GATA4 mRNA和蛋白表達(dá)低于 sh-NC 組（P＜0.001；P=0.008），其中 sh-GATA4-1組表達(dá)最低，因此選取sh-GATA4-1進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)（記為sh-GATA4組）。見圖4。

圖1 GATA4在NSCLC組織和癌旁組織中的表達(dá)Fig.1 Expression of GATA4 in NSCLC tissues and paracancerous tissues

圖2 GATA4在肺癌細(xì)胞和正常肺上皮細(xì)胞中的表達(dá)Fig.2 Expression of GATA4 in lung cancer cells and normal lung epithelial cells

圖3 GATA4基因甲基化對肺癌組織中p-ERK、p-p38、Bax和Bcl-2表達(dá)的影響Fig.3 The effect of GATA4 gene methylation on the expression of p-ERK,p-p38,Bax and Bcl-2 in lung cancer tissues

2.5 GATA4過表達(dá)抑制NSCLC細(xì)胞增殖

pLV-GATA4組細(xì)胞中GATA4 mRNA和蛋白表達(dá)高于 pLV-NC 組（均 P＜0.001），24 h、48 h、72 h細(xì)胞活力和細(xì)胞克隆數(shù)均低于pLV-NC組（均P<0.05）；sh-GATA4組細(xì)胞中GATA4 mRNA和蛋白表達(dá)低于sh-NC 組（均 P＜0.001），24 h、48 h、72 h細(xì)胞活力和細(xì)胞克隆數(shù)高于sh-NC組（均P<0.05），見圖5。

2.6 GATA4過表達(dá)促進(jìn)NSCLC細(xì)胞凋亡

圖4 sh-GATA4對A549細(xì)胞的干擾作用Fig.4 Interference of sh-GATA4 on A549 cells

表1 NSCLC組織中GATA4基因甲基化狀態(tài)與患者臨床病理特征的關(guān)系（n）Tab.1 Relationship between the methylation status of GATA4 gene in NSCLC tissues and the clinicopathological characteristics of patients（n）

流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果顯示，pLV-GATA4組細(xì)胞凋亡率高于pLV-NC組（P＜0.001），sh-GATA4組細(xì)胞凋亡率低于sh-NC組（P=0.007），見圖6。

2.7 GATA4過表達(dá)抑制MAPK通路活化

Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，pLV-GATA4組細(xì)胞p-ERK/ERK和p-p38/p38蛋白表達(dá)低于pLV-NC組（P=0.005；P＜0.001），sh-GATA4 組 p-ERK/ERK 和 p-p38/p38蛋白表達(dá)高于sh-NC組（P＜0.001；P=0.007）。見圖7。

圖5 GATA4過表達(dá)抑制NSCLC細(xì)胞增殖Fig.5 Overexpression of GATA4 inhibited the proliferation of NSCLC cells

3 討論

圖6 GATA4過表達(dá)促進(jìn)NSCLC細(xì)胞凋亡Fig.6 Overexpression of GATA4 promoted the apoptosis of NSCLC cells

圖7 GATA4過表達(dá)抑制MAPK通路活化Fig.7 Overexpression of GATA4 inhibited MAPK pathway activation

GATA鋅指轉(zhuǎn)錄因子家族由6個成員（GATA1～6）組成。其中GATA4在心臟和肺發(fā)育中起關(guān)鍵作用［8］，其異常表達(dá)也與腫瘤發(fā)生和惡性進(jìn)展相關(guān)，被認(rèn)為是癌癥治療的重要候選基因［9］。在口腔鱗狀上皮細(xì)胞癌組織和細(xì)胞中GATA4啟動子高度甲基化，且其甲基化狀態(tài)與患者總體生存率相關(guān)［10］。幾乎所有乳腺癌細(xì)胞系中也都存在GATA4基因甲基化，在乳腺癌組織和細(xì)胞系中GATA4表達(dá)降低還與預(yù)后不良相關(guān)，而GATA4過表達(dá)可降低乳腺癌細(xì)胞存活率、侵襲遷移能力及上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化，誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯和凋亡［11］。本研究在NSCLC組織和細(xì)胞中同樣發(fā)現(xiàn)GATA4基因啟動子高度甲基化，GATA4呈低表達(dá)，相關(guān)分析發(fā)現(xiàn)GATA4基因甲基化程度與GATA4 mRNA表達(dá)和蛋白表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，此外GATA4基因甲基化水平還與患者TNM分期和腫瘤大小相關(guān)。說明GATA4基因啟動子高度甲基化可導(dǎo)致GATA4表達(dá)降低，從而參與NSCLC疾病進(jìn)展。

細(xì)胞凋亡是細(xì)胞發(fā)育和程序性死亡的主要機(jī)制［12］。而細(xì)胞凋亡途徑受Bcl-2家族調(diào)控，該家族由促凋亡成員（如 Bax、Bak、Bad、Bcl-xs、Bid、Bik、Bim、HRK、Noxa和 PUMA）和抗凋亡成員（如 Bcl-2、Bcl-xl、Bcl-W、BFL-1和 MCL-1）組成［13］。DNA損傷、能量饑餓和缺氧等細(xì)胞應(yīng)激反應(yīng)可使促凋亡蛋白去磷酸化和裂解，致使其移位到線粒體，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡［14］。既往研究顯示Bcl-2家族蛋白在NSCLC中表達(dá)異常，Bcl-2上調(diào)及Bax下調(diào)與臨床耐藥有關(guān)［15］。本研究檢測肺癌組織中促凋亡蛋白Bax和抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)Bax蛋白表達(dá)下調(diào)而Bcl-2蛋白上調(diào)，且GATA4基因甲基化程度與Bcl-2蛋白表達(dá)呈正相關(guān)，而與Bax蛋白表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，說明GATA4基因甲基化與細(xì)胞凋亡呈負(fù)相關(guān)。進(jìn)一步采用慢病毒載體構(gòu)建過表達(dá)GATA4和干擾GATA4的肺癌A549細(xì)胞株，發(fā)現(xiàn)過表達(dá)GATA4可抑制細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，而敲低GATA4則反之，說明過表達(dá)GATA4在NSCLC中發(fā)揮抗腫瘤作用。

MAPK家族由ERK1/2、p38和JNK三個主要成員組成，可以調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、分化和凋亡等多種細(xì)胞過程［16］。既往研究報(bào)道激活MAPK通路中的ERK、JNK和p38可增強(qiáng)肺癌細(xì)胞抵抗放射線及對DNA損傷修復(fù)的能力［17］。在GATA4過表達(dá)細(xì)胞中也發(fā)現(xiàn)顯著差異表達(dá)的基因部分富集在MAPK通路［18］，且過表達(dá)GATA4可抑制MAPK通路激活［19］。本研究結(jié)果顯示，p-ERK和p-p38蛋白在肺癌組織中表達(dá)上調(diào)，且與GATA4基因甲基化程度呈正相關(guān)，提示GATA4基因甲基化可能激活MAPK通路。為了驗(yàn)證GATA4與MAPK通路的關(guān)系，進(jìn)一步進(jìn)行細(xì)胞驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)過表達(dá)GATA4可降低ERK和p38磷酸化水平，抑制MAPK通路活化；而干擾GATA4則提高了ERK和p38磷酸化水平，促進(jìn)MAPK通路活化。說明GATA4可能通過抑制MAPK通路下游靶標(biāo)ERK和p38磷酸化而在NSCLC細(xì)胞中發(fā)揮抗腫瘤作用。

綜上所述，GATA4在NSCLC組織和細(xì)胞中均呈高度甲基化，上調(diào)GATA4可能通過調(diào)控MAPK通路抑制NSCLC細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。GATA4可能是NSCLC治療的潛在靶點(diǎn)。