TRPM8對(duì)肝細(xì)胞癌Huh7細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移的影響及其作用機(jī)制

赫曉磊 克拉熱·阿合買(mǎi)提 張志強(qiáng)

作者單位：830054 烏魯木齊 新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院消化二科

肝細(xì)胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是全球范圍內(nèi)最常見(jiàn)的惡性腫瘤，也是癌癥相關(guān)死亡的重要誘因［1］。手術(shù)是HCC主要的治療手段，但術(shù)后5年生存率并不理想，其中高復(fù)發(fā)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移是預(yù)后不良的主要原因。上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）是上皮細(xì)胞失去典型的上皮特性并獲得間質(zhì)細(xì)胞表型的過(guò)程，被認(rèn)為是腫瘤進(jìn)展的病理過(guò)程，也是侵襲和轉(zhuǎn)移的主要機(jī)制［2］。EMT受多種信號(hào)傳導(dǎo)途徑調(diào)節(jié)，包括PI3K/AKT、NF-κB及AKT/GSK-3β/Snail等均已被報(bào)道在腫瘤EMT過(guò)程中發(fā)揮重要作用，且參與腫瘤轉(zhuǎn)移［3-4］。近年來(lái)，瞬時(shí)受體電位（TRP）通道在癌癥靶向治療領(lǐng)域備受關(guān)注［5］，在癌細(xì)胞中該通道常發(fā)生變化，其正常功能一旦被破壞可通過(guò)影響多種信號(hào)通路而導(dǎo)致惡性腫瘤進(jìn)展及生長(zhǎng)［6-7］。TRPM8是TRP家族中的一員，也被發(fā)現(xiàn)與EMT有關(guān)，在癌癥進(jìn)展中發(fā)揮重要作用［8］。本研究利用shRNA轉(zhuǎn)染肝細(xì)胞癌Huh7細(xì)胞構(gòu)建穩(wěn)定沉默細(xì)胞株，同時(shí)構(gòu)建裸鼠移植瘤模型，在體內(nèi)外探討沉默 TRPM8是否通過(guò)AKT/GSK-3β/Snail信號(hào)通路參與HCC遷移、侵襲、轉(zhuǎn)移，為明確TRPM8在HCC進(jìn)展中的重要性及分子機(jī)制，以及作為新的治療靶標(biāo)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要材料與試劑

1.1.1 臨床樣本 收集2017年3月—2019年12月于本院行肝癌切除術(shù)的20例HCC患者的癌組織及其相應(yīng)癌旁組織，置于-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩１狙芯拷?jīng)本院倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)。

1.1.2 細(xì)胞系 正常肝細(xì)胞系LO2和人HCC細(xì)胞系（Huh7、SK-hep1、HCCLM3 和 MHCC-97H）均購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞生物學(xué)研究所，用含10%胎牛血清、100 IU/mL青霉素和100 IU/mL鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基，于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每2 d換液1次，待細(xì)胞生長(zhǎng)融合至90%時(shí)用胰酶進(jìn)行消化、傳代，選取傳至第3代的細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.1.3 動(dòng)物 20只SPF級(jí)雄性BALB/C無(wú)胸腺裸鼠（4～6周齡）購(gòu)自新疆醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心；飼養(yǎng)于SPF室超凈層流架內(nèi)，動(dòng)物房?jī)?nèi)12 h白天/12 h晚上交替，正常飲水飲食，適應(yīng)環(huán)境1周后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)嚴(yán)格經(jīng)過(guò)本院倫理委員會(huì)審查。

1.1.4 主要試劑 DMEM培養(yǎng)基和胎牛血清購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；免疫組織化學(xué)試劑盒購(gòu)自北京索萊寶生物科技有限公司；TRIzol試劑、PrimeScriptTM1st Strand cDNA Synthesis Kit試劑盒和SYBR?Premix EX TaqⅡ試劑盒購(gòu)自日本TaKaRa公司；shTRPM8及其陰性對(duì)照（shcontrol）、LV-shTRPM8重組質(zhì)粒及其陰性對(duì)照重組質(zhì)粒（LV-shNC）均由Genepharma公司合成；LipofectamineTM3000購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司；8 μm孔徑的Transwell小室購(gòu)自美國(guó)promega公司；RIPA裂解液、BCA試劑盒購(gòu)自美國(guó)Abcam公司；SC79激動(dòng)劑購(gòu)自美國(guó)Selleck公司；TRPM8抗體購(gòu)自美國(guó)Santa cruz公司；p-AKT抗體、AKT抗體、p-GSK-3β 抗體、GSK-3β 抗體、Snail抗體、GAPDH 抗體和IgG抗體購(gòu)自美國(guó)Cell Signaling Technology公司。

1.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染及分組

將Huh7細(xì)胞按照1×105/孔接種于24孔板中，待細(xì)胞生長(zhǎng)融合至60%時(shí)，按照LipofectamineTM3000轉(zhuǎn)染試劑說(shuō)明書(shū)的方法分別轉(zhuǎn)染shcontrol、shTRPM8以及 shTRPM8+SC9，記為 shcontrol組、shTRPM8組和shTRPM8+SC97組。培養(yǎng)48 h后取對(duì)數(shù)期且生長(zhǎng)狀態(tài)良好的細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3 qRT-PCR檢測(cè)TRPM8 mRNA的表達(dá)水平

用TRIzol試劑提取總RNA并用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)總RNA的純度和含量。使用PrimeScriptTM 1st Strand cDNA Synthesis Kit試劑盒將提取的RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，然后用SYBR Premix EX TaqTMⅡ試劑盒進(jìn)行qRT-PCR。PCR反應(yīng)條件：95℃4 min（1個(gè)循環(huán)），95 ℃ 30 s、59 ℃ 30 s、68 ℃ 35 s、72 ℃ 30 s（40個(gè)循環(huán)）。PCR 引物序列：TRPM8 Forward為 5′-TATCTTACTGAACACCTGTAGTCCCAG-3′，Reverse 為 5′-TGAGTTTATAGTGTATTCAAAGCTGAGAA-3′；β-actinForward為 5′-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3′，Reverse為 5′-CCACCACCCTGTTGCTGTAG-3′。采用 2-△△Ct法，以 β-actin為內(nèi)參計(jì)算TRPM8 mRNA的相對(duì)表達(dá)水平。

1.4 免疫組化檢測(cè)TRPM8和AFP的表達(dá)

組織經(jīng)固定、包埋、石蠟切片、脫水、緩沖液清洗后，用3%過(guò)氧化氫溶液去除內(nèi)源性過(guò)氧化物酶，滴加非免疫動(dòng)物血清 20 min，滴加一抗［TRPM8（1∶100），AFP（1∶100）］，用 PBS 沖洗；滴加二抗（1∶500）、沖洗后加ABC復(fù)合物，DAB顯色，在400倍顯微鏡下觀察并拍照，其中TRPM8和AFP的陽(yáng)性表達(dá)在組織中呈棕黃色表達(dá)。

1.5 Transwell小室實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移和侵襲能力

將轉(zhuǎn)染48 h后的各組細(xì)胞用胰酶消化后制成密度為1×106/mL的單細(xì)胞懸液。在Transwell小室上室加入100 μL細(xì)胞懸液，下室加入500 μL含10%FBS的完全培養(yǎng)基，置于37℃、5%CO2、飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育8 h，取出聚碳酸酯微孔膜，用棉簽擦去表面細(xì)胞，用中性甲醛固定，蘇木素染色。在顯微鏡下選取5個(gè)視野觀察細(xì)胞遷移的數(shù)量。Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)中用聚碳酸酯微孔膜包被人工基底膠，其余方法同遷移實(shí)驗(yàn)。

1.6 劃痕愈合實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移能力

將轉(zhuǎn)染后的各組細(xì)胞鋪于60 mm培養(yǎng)皿中，待細(xì)胞融合度達(dá)90%時(shí)，用10 μL無(wú)菌槍頭沿培養(yǎng)皿底直線(xiàn)劃痕，PBS沖洗3遍，加入不含血清的培養(yǎng)基培養(yǎng)。在顯微鏡下觀察0 h、48 h時(shí)細(xì)胞的愈合程度并拍照，測(cè)量劃痕兩側(cè)細(xì)胞的遷移距離。

1.7 免疫熒光檢測(cè)E-cadherin和vimentin的表達(dá)水平

將轉(zhuǎn)染后的各組細(xì)胞用4%多聚甲醛固定10 min，置于0.1%Triton X-100中，室溫透化20 min，加入E-cadherin、vimentin 一抗（1∶100），4 ℃下孵育過(guò)夜；加入熒光二抗（1∶500），室溫下孵育1 h，用PBS洗滌3次，DAPI復(fù)染。在熒光顯微鏡下觀察E-cadherin和vimentin的陽(yáng)性表達(dá)情況（細(xì)胞質(zhì)呈紅色表達(dá)）并拍照。

1.8 Western blot檢測(cè) TRPM8、p-AKT、AKT、p-GSK-3β、GSK-3β和Snail蛋白的表達(dá)水平

用RIPA裂解提取各組細(xì)胞中的總蛋白，并按照BCA方法進(jìn)行定量，取等量蛋白樣品上樣，進(jìn)行SDS-PAGE電泳、轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉封閉，加入一抗［TRPM8 抗體（1∶1 000）、p-AKT 抗體（1∶1 000）、AKT抗體（1∶1 000）、p-GSK-3β 抗體（1∶1 000）、GSK-3β抗體（1∶1 000）、Snail抗體（1∶1 000）和 GAPDH 抗體（1∶2 000）］，4℃下孵育過(guò)夜，加入山羊抗兔 IgG 抗體（1∶2 000）室溫繼續(xù)孵育1 h，清洗后用ECL顯影。采用Image-Pro Plus圖像分析系統(tǒng)對(duì)蛋白條帶的灰度值進(jìn)行分析。

1.9 觀察裸鼠體內(nèi)HCC細(xì)胞的轉(zhuǎn)移能力

20只雄性BALB/C無(wú)胸腺裸鼠隨機(jī)分為兩組，每組10只。按照方法1.2的轉(zhuǎn)染方式用LV-shNC重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染Huh7細(xì)胞記為Huh7-LV-shNC細(xì)胞模型，轉(zhuǎn)染LV-shTRPM8的Huh7細(xì)胞記為Huh7-LV-shTRPM8細(xì)胞模型，通過(guò)尾靜脈注射200 μL Huh7-LV-shTRPM8細(xì)胞懸液構(gòu)建的裸鼠模型為實(shí)驗(yàn)組（LV-shTRPM8組），以注射Huh7-LV-shNC細(xì)胞建立的裸鼠模型為對(duì)照組（LV-shNC組），6周后，測(cè)量裸鼠腫瘤體積（腫瘤體積=長(zhǎng)徑×短徑2/2），脫頸處死后取肺組織并包埋在石蠟中進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色，觀察肺轉(zhuǎn)移情況。

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

統(tǒng)計(jì)學(xué)分析用SPSS 19.0軟件進(jìn)行，至少取3次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)結(jié)果，正態(tài)分布數(shù)據(jù)資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用Tukey檢驗(yàn)，兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 TRPM8在HCC組織和細(xì)胞中的表達(dá)

免疫組化檢測(cè)結(jié)果顯示，TRPM8表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)，HCC組織中TRPM8陽(yáng)性表達(dá)率高于癌旁組織（P<0.01），見(jiàn)圖1A；qRT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，TRPM8 mRNA在HCC組織中的表達(dá)也高于癌旁組織（P<0.01），見(jiàn)圖1B。與正常肝細(xì)胞系LO2相比，TRPM8蛋白和mRNA在HCC細(xì)胞系中的表達(dá)水平均增加（均P<0.05），其中Huh7細(xì)胞TRPM8表達(dá)水平最高，見(jiàn)圖1C～D。因此，選擇Huh7細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖1 TRPM8在HCC組織和細(xì)胞系中的表達(dá)Fig.1 Expression of TRPM8 in HCC tissues and cell lines

2.2 轉(zhuǎn)染后Huh7細(xì)胞中TRPM8的表達(dá)情況

qRT-PCR和Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示，與shcontrol組比較，shTRPM8組細(xì)胞中TRPM8 mRNA和蛋白的表達(dá)水平均明顯下調(diào)（P<0.01），見(jiàn)圖2。

2.3 沉默TRPM8對(duì)Huh7細(xì)胞遷移和侵襲能力的影響

Transwell小室實(shí)驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果顯示，與shcontrol組相比，shTRPM8組細(xì)胞遷移數(shù)目和侵襲數(shù)目均明顯減少（P<0.01），見(jiàn)圖3A；劃痕愈合實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，shTRPM8組細(xì)胞遷移率低于shcontrol組（P<0.01），見(jiàn)圖3B。

圖2 轉(zhuǎn)染后Huh7細(xì)胞中TRPM8的表達(dá)情況Fig.2 Expression of TRPM8 in Huh7 cells after transfection

圖3 沉默TRPM8對(duì)Huh7細(xì)胞遷移和侵襲能力的影響Fig.3 Effect of silencing TRPM8 on the migration and invasion of Huh7 cells

2.4 沉默TRPM8對(duì)Huh7細(xì)胞EMT的影響

免疫熒光檢測(cè)結(jié)果顯示，shTRPM8組的E-cadherin陽(yáng)性表達(dá)率高于shcontrol組（P<0.001），而vimentin陽(yáng)性表達(dá)率低于shcontrol組（P<0.001），見(jiàn)圖4。

圖4 沉默TRPM8對(duì)Huh7細(xì)胞上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化的影響（×200）Fig.4 Effect of silencing TRPM8 on epithelial-mesenchymal transition of Huh7 cell（×200）

2.5 沉默TRPM8對(duì)AKT/GSK-3β/Snail信號(hào)途徑的影響

Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示，與shcontrol組相比，shTRPM8組TRPM8和Snail蛋白表達(dá)水平均下調(diào)（P<0.001），AKT和GSK-3β蛋白磷酸化程度均降低（P<0.001），見(jiàn)圖 5。

2.6 SC79激動(dòng)劑對(duì)Huh7細(xì)胞EMT的影響

Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示，與shcontrol組相比，shTRPM8組細(xì)胞的E-cadherin蛋白表達(dá)上調(diào)（P<0.001），而vimentin蛋白表達(dá)下調(diào)（P<0.01）；與 shTRPM8組相比，shTRPM8+SC79組細(xì)胞E-cadherin蛋白表達(dá)下調(diào)（P<0.01），而 vimentin蛋白表達(dá)水平上調(diào)（P<0.05），見(jiàn)圖6。

圖5 沉默TRPM8對(duì)AKT/GSK-3β/Snail信號(hào)途徑的影響Fig.5 Effect of silencing TRPM8 on the AKT/GSK-3β/Snail signal pathway

圖6 SC79激動(dòng)劑對(duì)Huh7細(xì)胞EMT的影響Fig.6 Effect of SC79 agonist on EMT of Huh7 cells

2.7 沉默TRPM8對(duì)裸鼠移植瘤肺細(xì)胞轉(zhuǎn)移的影響

裸鼠成瘤實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，全組未見(jiàn)死亡，成瘤率均為100%。LV-shTRPM8組裸鼠腫瘤體積較LV-shNC組顯著降低［（106.21±11.37）mm3vs（437.32±22.43）mm3，P<0.001］，肺轉(zhuǎn)移率及肺轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)數(shù)量亦較LV-shNC組降低（P<0.001），見(jiàn)圖7A～B。免疫組化檢測(cè)結(jié)果顯示，與LV-shNC組相比，LV-shTRPM8組肺組織中AFP和TRPM8的陽(yáng)性表達(dá)率均降低（65.32%vs 12.43%，P<0.01；45.12%vs 14.74%，P<0.01），見(jiàn)圖7C～D。

圖7 沉默TRPM8對(duì)裸鼠移植瘤肺轉(zhuǎn)移的影響Fig.7 Effect of silencing TRPM8 on lung metastasis of transplanted tumor in nude mice

3 討論

近年來(lái)HCC的診斷和治療都取得了較大進(jìn)展，但預(yù)后仍不理想，其中復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移是影響預(yù)后最主要的因素［9］。因此，闡明HCC轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制，有助于尋找逆轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)移新靶點(diǎn)，改善其治療策略。既往研究已證實(shí)EMT與HCC進(jìn)展和預(yù)后相關(guān)［10］，有效抑制HCC細(xì)胞EMT可能是有效治療的關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一。TRPM8離子通道是一種非選擇性陽(yáng)離子通道，主要存在于細(xì)胞膜或細(xì)胞器膜上，最初作為一種前列腺特異性蛋白被克隆出來(lái)。之后TRPM8在細(xì)胞生長(zhǎng)與調(diào)控方面的作用備受關(guān)注，已證實(shí)在胰腺癌、食管癌等多種惡性腫瘤發(fā)生、發(fā)展中起重要作用［11-13］。目前在多種惡性腫瘤研究中也發(fā)現(xiàn)TRPM8可影響EMT。黃維等［14］報(bào)道沉默TRPM8可使腎癌A498細(xì)胞遷移和侵襲能力下降，可能是通過(guò)調(diào)節(jié)EMT的上游信號(hào)分子Snail和WNT-5a表達(dá)而調(diào)控EMT，從而影響細(xì)胞遷移及侵襲。但是TRPM8在HCC中的作用及其與HCC細(xì)胞EMT的關(guān)系尚不明確。本研究檢測(cè)TRPM8在HCC組織和細(xì)胞中的表達(dá)發(fā)現(xiàn)均呈高表達(dá)；選取TRPM8表達(dá)最高的Huh7細(xì)胞并采用RNA干擾技術(shù)成功構(gòu)建沉默TRPM8的HCC細(xì)胞，以進(jìn)一步觀察TRPM8對(duì)HCC細(xì)胞的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)沉默TRPM8可使Huh7細(xì)胞遷移能力和侵襲能力減弱。通過(guò)給裸鼠尾靜脈注射Huh7-LV-shNC細(xì)胞或Huh7-LV-shTRPM8細(xì)胞構(gòu)建裸鼠移植瘤以觀察TRPM8在體內(nèi)的作用，同樣發(fā)現(xiàn)沉默TRPM8后裸鼠肺轉(zhuǎn)移率降低，肺轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)數(shù)量也減少，肺組織中AFP的表達(dá)下降，說(shuō)明沉默TRPM8能抑制HCC轉(zhuǎn)移。此外，在EMT過(guò)程中，細(xì)胞表型常發(fā)生變化，且主要表現(xiàn)為喪失上皮表型如E-cadherin，而獲得間質(zhì)表型如vimentin等，其中E-cadherin表達(dá)的丟失被認(rèn)為是EMT最顯著的特征［15］。因此，本研究在沉默TRPM8的細(xì)胞中進(jìn)一步檢測(cè)E-cadherin和vimentin的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)沉默TRPM8可增加E-cadherin的表達(dá)并降低vimentin表達(dá)，提示TRPM8可能在HCC細(xì)胞中誘導(dǎo)EMT，從而在HCC的侵襲和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮作用。

作為EMT的調(diào)節(jié)劑，鋅指蛋白被報(bào)道可通過(guò)與E-box基序結(jié)合而直接在轉(zhuǎn)錄水平上促進(jìn)E-cadherin的阻遏，導(dǎo)致細(xì)胞黏附力喪失，從而致使細(xì)胞遷移和轉(zhuǎn)移［3］。EMT期間的細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化也與多種鋅指蛋白有關(guān)，包括 Snail、Slug 等［16-17］。AKT/GSK-3β/Snail信號(hào)途徑在多種腫瘤中發(fā)揮著重要作用，在HCC EMT中也發(fā)揮關(guān)鍵作用，其中AKT/GSK-3β信號(hào)通路可以調(diào)節(jié)Snail的穩(wěn)定性［18-20］。為進(jìn)一步探索TRPM8作用的分子機(jī)制，本研究檢測(cè)EMT上游信號(hào)分子的表達(dá)情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)沉默TRPM8可使AKT蛋白磷酸化程度降低，抑制GSK-3β和Snail的表達(dá)，而使用SC79激動(dòng)劑使AKT/GSK-3β/Snail途徑激活，會(huì)下調(diào)E-cadherin蛋白表達(dá)并上調(diào)vimentin蛋白表達(dá)。因此認(rèn)為T(mén)RPM8可能是通過(guò)調(diào)節(jié)EMT的上游信號(hào)分子Akt、GSK-3β、Snail的表達(dá)調(diào)控EMT，最終影響HCC細(xì)胞的遷移及侵襲。

綜上所述，TRPM8在HCC組織和細(xì)胞系中表達(dá)上調(diào)，沉默TRPM8可抑制HCC侵襲與轉(zhuǎn)移，其作用機(jī)制可能是通過(guò)調(diào)控AKT/GSK-3β/Snail信號(hào)途徑而促進(jìn)HCC的EMT過(guò)程?？蔀橹委烪CC提供新的靶點(diǎn)和思路。