膠質(zhì)瘤組織中miR-205-5p的表達(dá)及其對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞惡性生物學(xué)行為的影響

靳世輝張茜 羅偉濠葉友忠

作者單位：423000 郴州 1郴州市第一人民醫(yī)院神經(jīng)外科；412007 株洲 2株洲市中心醫(yī)院特需病區(qū)；423000 郴州3郴州市第一人民醫(yī)院轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究所

膠質(zhì)瘤是顱內(nèi)常見的原發(fā)惡性腫瘤，治療方法主要以手術(shù)治療為主，輔以放療、化療等綜合治療，但是治療效果欠佳，加之復(fù)發(fā)率高，致使預(yù)后較差［1-2］。miRNA作為非編碼小分子單鏈RNA，主要參與轉(zhuǎn)錄后調(diào)控，在惡性腫瘤中發(fā)揮重要的調(diào)控作用。miR-205-5p作為一種高度保守的miRNA，既往研究顯示在多種腫瘤中差異表達(dá)并參與調(diào)控腫瘤細(xì)胞增殖和侵襲，且根據(jù)腫瘤來源和侵襲性的不同miR-205-5p還可扮演不同角色，例如在乳腺癌、前列腺癌、鼻咽癌中主要發(fā)揮抑癌作用［3-7］。但對(duì)膠質(zhì)瘤生物學(xué)功能的影響及分子作用機(jī)制目前仍未明確。本課題組前期通過生物信息學(xué)分析預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn) Runt相關(guān)因子2（runt-related gene 2，Runx2）可能是miR-205-5p的靶基因，且兩者互為靶向關(guān)系，基于此本研究進(jìn)一步深入探討miR-205-5p對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖、侵襲和遷移的影響及其與Runx2的靶向關(guān)系，以期闡明膠質(zhì)瘤的發(fā)病機(jī)制及挖掘新的治療靶點(diǎn)。

1 材料和方法

1.1 臨床樣本、細(xì)胞系及主要試劑

1.1.1 臨床樣本 收集2018年6月至2019年12月于郴州市第一人民醫(yī)院神經(jīng)外科就診的58例新發(fā)神經(jīng)膠質(zhì)瘤患者的膠質(zhì)瘤組織和癌旁組織（距癌邊緣外≥2 cm）標(biāo)本。所有標(biāo)本均經(jīng)病理證實(shí)為神經(jīng)膠質(zhì)瘤，患者術(shù)前均未接受過任何有關(guān)神經(jīng)膠質(zhì)瘤的治療。本研究獲得郴州市第一人民醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，患者或家屬知情同意并自愿參加。

1.1.2 細(xì)胞系 人膠質(zhì)瘤細(xì)胞株U251、T98G和人星形膠質(zhì)細(xì)胞HA均購自中國(guó)科學(xué)院生物化學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)研究所。

1.1.3 主要試劑 miR-205-5pmimics及其陰性對(duì)照（NC mimics）由廣州銳博生物科技公司合成；miR-205-5p引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。轉(zhuǎn)染試劑 LipofectamineTM2000、RNA提取試劑TRIzol均購自Thermo Fisher公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒GoScript?Kit購自Promage公司；Real-time PCR試劑LightCycler?480 SYBR?Green I Master購自Roche公司；Transwell小室、Matrigel膠購自CORNING公司；Cell Counting Kit-8購自DOJINDO Laboratories公司；兔抗Runx2單克隆抗體、鼠抗β-actin多克隆抗體、二抗羊抗兔IgG、二抗兔抗鼠IgG均購自abcam公司；ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染

所有細(xì)胞均接種至含10%胎牛血清、100 IU/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素酶的DMEM培養(yǎng)基，并置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中，避光常規(guī)培養(yǎng)和傳代。

選取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的U251細(xì)胞和T98G細(xì)胞，用胰蛋白酶消化后，按1×105/孔接種于6孔板中常規(guī)培養(yǎng)，待細(xì)胞融合度達(dá)75%左右，按照LipofectamineTM2000（Invitrogen）轉(zhuǎn)染試劑說明書的方法，將miR-205-5p mimics及NC mimics分別轉(zhuǎn)染至U251細(xì)胞和T98G細(xì)胞，于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)12 h。收集各組細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3 qRT-PCR檢測(cè)miR-205-5p mRNA的表達(dá)水平

采用TRIzol Regent（Invitrogen）提取膠質(zhì)瘤組織和細(xì)胞中的總RNA，并用NanoDrop 2000檢測(cè)樣品的濃度和純度。按照GoScriptrTM逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書的操作步驟，將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，使用SYBR Prime Script miRNA RT PCR試劑盒在LC480系統(tǒng)檢測(cè)miR-205-5p表達(dá)水平。PCR反應(yīng)序列：miR-205-5p上游引物為 5′-TCCACCGGAGTCTGTCTCAT-3′，下游引物為 5′-GCTGTCAACGATACGCTACG-3′；U6 snRNA上游引物為 5′-GGGTGCTCGTTCGGC-3′，下游引物為5′-TGGTGTCGTGAGTCG-3′。PCR 反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性 1 min；95 ℃變性 10 s，60 ℃延伸 30 s，40個(gè)循環(huán)。以 U6 snRNA 為內(nèi)參，用 2-ΔΔCt法計(jì)算 miR-205-5p mRNA的相對(duì)表達(dá)水平。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.4 CCK-8法檢測(cè)U251和T98G細(xì)胞的增殖能力

將轉(zhuǎn)染12 h后的U251和T98G細(xì)胞按1×103/孔的密度接種至4個(gè)96孔板，每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔，并置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。分別于鋪板12 h、24 h、48 h和72 h取出1板，向每孔加入20 μL CCK-8溶液，繼續(xù)孵育2 h，用酶標(biāo)儀測(cè)定450 nm波長(zhǎng)處的光密度（OD）值，并以O(shè)D值為縱坐標(biāo)，時(shí)間為橫坐標(biāo)，繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.5 平板克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)U251和T98G細(xì)胞的克隆形成率

將轉(zhuǎn)染12 h后的U251細(xì)胞和T98G細(xì)胞以500/孔的密度接種至6孔板，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，并于37℃、5%CO2中培養(yǎng)。待克隆形成后，用PBS洗滌，4%多聚甲醛固定20 min，0.5%結(jié)晶紫染色20 min，自來水洗滌并干燥后，再用PBS清洗，拍照、計(jì)數(shù)大于50個(gè)細(xì)胞的克隆數(shù)并計(jì)算克隆形成率?？寺⌒纬陕?（克隆數(shù)/接種細(xì)胞數(shù)）×100%。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.6 劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)U251和T98G細(xì)胞的遷移能力

將轉(zhuǎn)染后的U251和T98 G細(xì)胞分別接種于12孔板，待細(xì)胞融合至80%～90%時(shí)，用無菌的10 μL槍頭在各組細(xì)胞中劃出3～5條等距平行線，然后在無血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h。分別于0 h和24 h用光學(xué)顯微鏡拍攝圖像，記錄每個(gè)時(shí)間點(diǎn)的劃痕面積，計(jì)算細(xì)胞的劃痕愈合率。

1.7 Transwell小室實(shí)驗(yàn)檢測(cè)U251和T98G細(xì)胞的侵襲能力

轉(zhuǎn)染24 h后的U251和T98G細(xì)胞用無血清培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞密度至5×104/mL，取100 μL加入含Matrigel膠的Transwell小室上室，在下室中加入600 μL含血清的培養(yǎng)基。常規(guī)培養(yǎng)48 h后，侵襲細(xì)胞用4%多聚甲醛固定，0.5%結(jié)晶紫染色，在光學(xué)顯微鏡下隨機(jī)選擇5個(gè)視野計(jì)數(shù)侵襲細(xì)胞數(shù)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.8 雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)驗(yàn)證miR-205-5p和Runx2的靶向關(guān)系

通過生物信息學(xué)軟件TargetScan 7.2預(yù)測(cè)miR-205-5p與Runx2的結(jié)合位點(diǎn)。將預(yù)測(cè)的Runx2 mRNA 3′UTR區(qū)域與miR-205-5p的結(jié)合位點(diǎn)片段（WT）和突變片段（MUT）合成并克隆到psiCHECK-2雙熒光素酶報(bào)告基因載體，構(gòu)建重組質(zhì)粒Runx2-3′UTR-WT和Runx2-3′UTR-MUT。將上述兩種重組質(zhì)粒與NC mimics或miR-205-5p mimics共轉(zhuǎn)染至U251細(xì)胞，于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)36 h。裂解細(xì)胞30 min后，取10 μL細(xì)胞裂解液加入96孔熒光檢測(cè)板中，按照雙熒光素酶檢測(cè)系統(tǒng)操作步驟檢測(cè)細(xì)胞的熒光素酶活性。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.9 Western blot檢測(cè)U251和T98G細(xì)胞中Runx2蛋白的表達(dá)水平

收集各組細(xì)胞并提取細(xì)胞總蛋白，用BCA法測(cè)定蛋白濃度后，加入loading buffer，沸水孵育5 min后，各組取等量蛋白質(zhì)樣品，用10%SDS-PAGE分離，轉(zhuǎn)至PDVF膜，5% 的脫脂牛奶4℃封閉1 h，加入 Runx2 一抗（1∶1 000）和 β-actin 一抗（1∶2 000）并于4℃孵育過夜后，用PBST沖洗3次，再加入標(biāo)記了辣根過氧化物酶的二抗并于室溫孵育2 h，用PBST沖洗3次，加入ECL發(fā)光試劑，曝光、顯影，用凝膠成像儀成像，并掃描灰度值以計(jì)算蛋白相對(duì)表達(dá)水平。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，膠質(zhì)瘤組織與癌旁組織中miR-205-5p的表達(dá)水平比較采用配對(duì)t檢驗(yàn)。膠質(zhì)瘤細(xì)胞U251和T98G與人星形膠質(zhì)細(xì)胞HA中miR-205-5p的表達(dá)水平比較采用單因素方差分析，若組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，進(jìn)一步采用Dunnett檢驗(yàn)進(jìn)行多重比較。各細(xì)胞處理組與對(duì)照組的比較均采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。生長(zhǎng)曲線比較采用重復(fù)測(cè)量方差分析。miR-205-5p表達(dá)水平與臨床特征的關(guān)系采用χ2檢驗(yàn)，以雙側(cè)P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 miR-205-5p在膠質(zhì)瘤組織和細(xì)胞系中的表達(dá)

qRT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，膠質(zhì)瘤組織中miR-205-5p表達(dá)水平低于癌旁組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=7.922，P＜0.01），見圖 1；HA、U251 和 T98G 細(xì)胞中 miR-205-5p的表達(dá)水平差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=245.232，P<0.001）；與HA細(xì)胞相比，U251和T98G細(xì)胞中miR-205-5p的表達(dá)均降低（均P<0.01），見圖1B。

2.2 miR-205-5p表達(dá)水平與膠質(zhì)瘤患者臨床病理特征的關(guān)系

根據(jù)膠質(zhì)瘤組織中miR-205-5p的表達(dá)均值（1.23）將患者分為 miR-205-5p高表達(dá)組（23例）和低表達(dá)組（35例）。miR-205-5p的表達(dá)水平與腫瘤直徑和病理分級(jí)均有關(guān)（均 P＜0.05），而與患者年齡、性別無關(guān)（均 P>0.05），見表 1。

圖1 miR-205-5p在膠質(zhì)瘤組織和細(xì)胞系中的表達(dá)Fig.1 Expression of miR-205-5p in glioma tissues and cell lines

表1 miR-205-5p表達(dá)與膠質(zhì)瘤患者臨床病理特征的關(guān)系［n（%）］Tab.1 Correlation between the expression of miR-205-5p and clinicopathological features in patients with glioma［n（%）］

2.3 過表達(dá)miR-205-5p抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖、克隆形成、遷移和侵襲能力

qRT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染miR-205-5p mimics后，U251細(xì)胞和T98G細(xì)胞中miR-205-5p表達(dá)水平均高于 NC mimics組（t=7.393，P=0.002；t=22.480，P<0.001），見圖2A。CCK-8、平板克隆形成、劃痕和Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果顯示，與NC mimics組比較，過表達(dá)miR-205-5p可抑制U251和T98G細(xì)胞的增殖（F=12.137、14.223，均 P<0.001）、克隆形成（t=3.983，P=0.016；t=4.240，P=0.013）、遷移（t=4.965，P=0.007；t=3.161，P=0.034）和侵襲（t=5.889，P=0.004；t=4.918，P=0.007）能力，見圖 2B～F。

圖2 miR-205-5p對(duì)U251和T98G細(xì)胞增殖、克隆形成、遷移和侵襲能力的影響Fig.2 Effects of miR-205-5p expression on the proliferation,clone formation,migration and invasion of U251 and T98G cells

2.4 miR-205-5p靶向調(diào)控Runx2的表達(dá)

通過生物信息學(xué)軟件TargetScan 7.2分析和預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)，miR-205-5p可與 Runx2 mRNA的 3′-UTR結(jié)合，見圖3A。雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)測(cè)定結(jié)果表明，與NC mimics組相比，miR-205-5p mimics與Runx2-3′UTR-WT共轉(zhuǎn)染可抑制U251細(xì)胞的熒光素酶活性（t=5.543，P=0.005），而與 Runx2-3′UTR-MUT共轉(zhuǎn)染時(shí)的熒光素酶活性無明顯變化（t=0.563，P=0.603），表明miR-205-5p直接與Runx2 mRNA的3′UTR 相互作用，見圖3B。Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示，與NC mimics組相比，過表達(dá)miR-205-5p可下調(diào)U251和T98G細(xì)胞的Runx2的蛋白表達(dá)水平（t=14.102、12.325，均 P＜0.001），見圖 3C。

圖3 miR-205-5p靶向調(diào)控Runx2的表達(dá)Fig.3 miR-205-5p targeted the expression of Runx2

3 討論

膠質(zhì)瘤生長(zhǎng)迅速，侵襲性強(qiáng)，手術(shù)后易復(fù)發(fā)等特點(diǎn)是其預(yù)后較差的主要原因。miRNA作為生命過程的重要調(diào)控分子，近年來已被證實(shí)在細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖、凋亡、遷移、能量代謝及免疫功能等過程中起重要的調(diào)控作用［8］。在膠質(zhì)瘤中miRNA也發(fā)揮重要作用，如miR-93-5p通過靶向MMP2可抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移［9］，而miR-125a-3p通過靶向抗氧化基因NRG1抑制膠質(zhì)瘤進(jìn)展［10］。MENG 等［11］在膠質(zhì)瘤組織中發(fā)現(xiàn)miR-205-5p呈低表達(dá)且與其惡性程度相關(guān)，而過表達(dá)miR-205-5p抑制了膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖能力。本研究同時(shí)檢測(cè)miR-205-5p在膠質(zhì)瘤組織和細(xì)胞系中的表達(dá)，同樣發(fā)現(xiàn)miR-205-5p呈低表達(dá)，且低表達(dá)患者的惡性程度更高。進(jìn)一步構(gòu)建miR-205-5p過表達(dá)的膠質(zhì)瘤U251和T98G細(xì)胞模型，也發(fā)現(xiàn)過表達(dá)miR-205-5p能顯著抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞生長(zhǎng)、克隆形成、遷移和侵襲的能力，提示在膠質(zhì)瘤中miR-205-5p主要發(fā)揮抑癌基因功能而參與其進(jìn)展，可能是膠質(zhì)瘤潛在的診斷及治療靶點(diǎn)。

Runx2是Runx轉(zhuǎn)錄因子家族中的成員之一，作為一種轉(zhuǎn)錄因子最早被發(fā)現(xiàn)能通過激活Wnt信號(hào)通路促進(jìn)骨肉瘤的發(fā)生發(fā)展［12］，隨后發(fā)現(xiàn)在乳腺癌、結(jié)直腸癌、非小細(xì)胞肺癌等發(fā)生發(fā)展中Runx2也發(fā)揮重要的調(diào)控作用［13］。近年來研究也顯示Runx2可能參與調(diào)控膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖和侵襲轉(zhuǎn)移。Runx2在膠質(zhì)瘤組織中高表達(dá)，可通過cAMP/PKA信號(hào)通路促進(jìn)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的惡性表型［14］，目前已被認(rèn)為是多種miRNA的靶點(diǎn)調(diào)控膠質(zhì)瘤的發(fā)生發(fā)展，如miR-122［15］、miR-152［16］、miR-217［17］等。本研究通過生物信息學(xué)預(yù)測(cè)miR-205-5p與Runx2 mRNA存在結(jié)合位點(diǎn)，提示Runx2可能是miR-205-5p的靶標(biāo)；雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)證實(shí)miR-205-5p可與Runx2的3′UTR區(qū)域結(jié)合，且在膠質(zhì)瘤細(xì)胞中過表達(dá)miR-205-5p能下調(diào)Runx2蛋白的表達(dá)水平，說明miR-205-5p靶向調(diào)控Runx2的表達(dá)，提示miR-205-5p可能通過靶向Runx2調(diào)控膠質(zhì)瘤的發(fā)生發(fā)展。

綜上所述，miR-205-5p在膠質(zhì)瘤組織和細(xì)胞系中低表達(dá)，過表達(dá)miR-205-5p可抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲，其機(jī)制可能與靶向調(diào)控Runx2有關(guān)，有望成為膠質(zhì)瘤診斷和治療的新靶點(diǎn)。