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    介孔碳納米粒改善格列美脲降糖效果的臨床觀察

    2021-01-15 06:58:12崔海悅范思琪李雨芳劉影劉濤
    關(guān)鍵詞:格列美介孔藥量

    崔海悅,范思琪,李雨芳,劉影,劉濤

    (錦州醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院,遼寧 錦州 121000)

    格列美脲(glimepiride,GM)是第三代磺酰脲類長效口服降血糖藥物,用于治療單純飲食和運(yùn)動(dòng)控制不能達(dá)到理想的降糖效果的2型糖尿病,該藥具有高效、長效、用藥量少、低血糖不良反應(yīng)少等優(yōu)點(diǎn)[1]。但其水中溶解度極差,藥物的溶出速率受到限制,因此,生物利用度低。據(jù)報(bào)道,在美國已上市TOP 200的藥品中大約 40%的藥物為水難溶性或者水不溶性[2-3],因此,要使更多難溶性藥物,最大限度地發(fā)揮藥效,就要提高該類藥物的溶解度和生物利用度。這是新藥創(chuàng)制和現(xiàn)有藥物功效改善領(lǐng)域需要解決的關(guān)鍵問題。無機(jī)納米多孔材料為解決這一問題提供了一種新的手段。介孔碳是納米介孔結(jié)構(gòu)材料的一種[4-5],它的孔道具有一定的特點(diǎn)如:排列有序、大小均勻、比表面積大、孔徑可調(diào)節(jié)等[6-8]。有序孔道為藥物提供貯存的場所,并限制其結(jié)晶,由此表面積增大,為增溶難溶性藥物提供了新途徑。本文以MCN為載體通過吸附法制備格列美脲介孔碳納米粒改善其水溶性,同時(shí)考察其對(duì)2型糖尿病大鼠的降糖效果。

    1 材料與方法

    1.1 細(xì)胞與試劑

    格列美脲(上海源葉生物技術(shù)有限公司,批號(hào):Y03J7C15616);聚氧乙烯聚氧丙烯醚嵌段共聚物Pluronic F127(上海阿拉丁生化科技有限公司,批號(hào):H1A2527);人Caco-2結(jié)腸癌細(xì)胞系(南京凱基生物);MTT(北京鼎國生物技術(shù)有限公司,批號(hào):83220101100);羅丹明鬼筆環(huán)肽(AAT Bioquest,批號(hào):1770273);Hoechst 33342(sigma公司,批號(hào):117m4047v);其他試劑均為分析純,市售。反應(yīng)釜(威海興盛化工機(jī)械有限公司,型號(hào):200 mL)。

    1.2 方法

    1.2.1 MCN的制備

    1.2 g苯酚、4.2 mL甲醛水溶液在攪拌下加入到30 mL 0.1 M的氫氧化鈉水溶液中,在70 ℃下攪拌30 min,加入30 mL含有1.92 g F127的水溶液,攪拌2 h后加入100 mL水,反應(yīng)18 h后,用112 mL水稀釋,然后將體系加入到反應(yīng)釜中,130 ℃反應(yīng)24 h,得到的產(chǎn)物經(jīng)水洗干燥,在氮?dú)夥諊逻M(jìn)行碳化(25~350 ℃ 1 h、350~550 ℃ 2 h、550~750 ℃ 2 h、 750~750 ℃ 1 h),得到的產(chǎn)物即MCN。

    1.2.2 載藥

    采用吸附法進(jìn)行載藥,取格列美脲1 g溶于30 mL二氯甲烷中,另取1 g MCN加入到含藥二氯甲烷中,磁力攪拌6 h,吸附完全后,離心,棄上清收集沉淀,離心濃縮去除溶劑,將合成得到的藥物粉末在45 ℃減壓干燥12 h,即得MCN包載格列美脲的載藥樣品(GM- MCN)。

    1.2.3 載藥量測定

    1.2.3.1 色譜條件 色譜條件為:色譜柱:Agilent TC C18柱(4.6×250 mm,5 μm);流動(dòng)相乙腈:0.1%磷酸二氫鈉水溶液(50∶50);檢測波長228 nm;流速1 mL/min;柱溫:30 ℃;進(jìn)樣量為10 μL。

    1.2.3.2 對(duì)照品溶液的配制 精密稱取格列美脲對(duì)照品0.6 mg,放置于1 mL容量瓶中,加少量乙腈超聲溶解后加乙腈到相應(yīng)的刻度,搖勻,作為對(duì)照品溶液,備用。

    1.2.3.3 供試品溶液的配制 在1 mL容量瓶中精密稱取GM-MCN 5 mg,加乙腈溶解并定容至刻度,搖勻,作為供試品溶液,備用。

    1.2.3.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制 分別精密稱取格列美脲對(duì)照品適量,加乙腈配制成濃度分別為0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mg/mL的系列溶液,按1.2.4.1色譜條件分別進(jìn)樣分析。以溶液濃度為橫坐標(biāo),峰面積為縱坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

    1.2.3.5 精密度考察 精密吸取對(duì)照品溶液10 μL,按1.2.4.1色譜條件進(jìn)樣分析,進(jìn)樣次數(shù)為6次,測定格列美脲的峰面積,同時(shí)計(jì)算峰面積的RSD值。

    1.2.3.6 載藥量測定 對(duì)制備的3批樣品經(jīng)HPLC進(jìn)行載藥量測定,按上述色譜條件進(jìn)樣分析,每次10 μL,測定格列美脲峰面積,同時(shí)計(jì)算載藥量,根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算藥物含量。

    1.2.4 透射電鏡(TEM)表征

    透射電鏡觀察MCN形態(tài)及介孔結(jié)構(gòu),檢測電壓為200 kV。

    1.2.5 差示掃描量熱法(DSC)表征

    格列美脲在MCN載體載藥前后的狀態(tài)變化用差示掃描量熱儀來測定。取適量的樣品放置在儀器中調(diào)節(jié)氮?dú)饬魉贋?50 mL/min、設(shè)定掃描速度為10 ℃/min、掃描范圍50~350 ℃。

    1.2.6 MCN 載體對(duì)Caco-2細(xì)胞的毒性研究

    人結(jié)腸癌細(xì)胞Caco-2細(xì)胞培養(yǎng)條件:培養(yǎng)基為DMEM,胎牛血清濃度為10%,溫度為37 ℃,CO2濃度為5%。取處于對(duì)數(shù)生長期的細(xì)胞經(jīng)消化后接種在96孔板上,每孔1 × 106個(gè),在上述培養(yǎng)條件下繼續(xù)培養(yǎng)24 h后,將培養(yǎng)液吸出,取不同濃度的MCN 溶液(濃度分別為5、10、50、100、250、500 μg/mL)200 μL分別加入到相應(yīng)的孔中,每個(gè)濃度重復(fù)6次,繼續(xù)培養(yǎng)48 h,培養(yǎng)結(jié)束后每孔加入5 mg/mL MTT 20 μL,繼續(xù)培養(yǎng)4 h后,吸出孔中的液體,每孔加DMSO 200 μL,于搖床上震搖10 min。于酶標(biāo)儀(波長492 nm)檢測各孔的光密度值(OD值)。按對(duì)照組細(xì)胞存活率為100% 計(jì)算相應(yīng)指標(biāo)。細(xì)胞存活率% =(OD測定 /OD對(duì)照)× 100%。

    1.2.7 Caco-細(xì)胞MCN對(duì)攝取研究

    將處于對(duì)數(shù)增長期的人結(jié)腸癌細(xì)胞Caco-2細(xì)胞接種在共聚焦板中,細(xì)胞數(shù)濃度在 1 ×105個(gè),在37 ℃,5% CO2的孵箱培養(yǎng)24 h后,加入的50 μg/mL含有 FITC 標(biāo)記的 MCN,其制備方法為500 mg MCN粉末置于250 mL 錐形瓶中,在100 ℃下油浴反應(yīng) 30 min,在250 mL的三頸燒瓶中放入干燥后的MCN粉末,加無水乙醇入50 mL,3-氨丙基三乙氧基硅烷2 mL,整個(gè)系統(tǒng)通氮?dú)猓?7 ℃加熱攪拌,回流10 h,反應(yīng)后,濾過離心,取沉淀用無水乙醇洗滌3次,減壓干燥,收集粉末為氨基化后的MCN。稱取1 mg FITC放置于西林瓶中,加入1 mL 的無水乙醇使其溶解,再向西林瓶中加入氨基化后的MCN粉末100 mg,靜置吸附3 h,離心收集沉淀,得到含有 FITC 標(biāo)記的 MCN。分別培養(yǎng)1、2 、3 h后,分別吸出培養(yǎng)液,PBS洗3次,4%多聚甲醛溶液室溫固定10 min。PBS洗3次,用0.1%的Triton X-100 4 ℃孵育10 min。PBS洗3次,1%白蛋白封閉液37 ℃封閉30 min后染色。1 μg/mLHoechst 33342對(duì)細(xì)胞核進(jìn)行染色10 min,1 μg/mL羅丹明鬼筆環(huán)肽對(duì)細(xì)胞骨架染色30 min。染色結(jié)束PBS洗3次,激光共聚焦顯微鏡下觀察載藥體系的細(xì)胞攝取過程。

    1.2.8 GM-MCN降糖效果研究

    30只雄性SD大鼠正常喂養(yǎng)1 w后,隨機(jī)抽取6只為正常對(duì)照組,其余動(dòng)物制備二型糖尿病模型。普通大鼠飼料喂養(yǎng)正常對(duì)照組大鼠,其余大鼠高脂高糖飼料喂養(yǎng)8 w,按照25 mg/kg的劑量腹腔注射鏈脲佐菌素(STZ)2次,正常對(duì)照組腹腔注射等體積檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液(pH=4.4)。注射72 h后剪尾取血,測定血糖,連續(xù)3 d,血糖穩(wěn)定后,血糖>11.1 mmol/L的大鼠作為造模成功大鼠。將造模成功的大鼠隨機(jī)分為模型組、MG-MCN組和上市藥物組,每組6只,給藥劑量0.3 mg/kg,灌胃給藥,正常對(duì)照組和模型組分別灌服生理鹽水,連續(xù)給藥1 w,分別在0、3、7 d剪尾測空腹血糖,觀察血糖變化。

    1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

    使用 SPSS 19.0 軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,兩組間比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn),多組樣本之間的均數(shù)比較采用單因素方差分析,以P<0.05 為結(jié)果有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

    2.1 透射電鏡觀察載體結(jié)構(gòu)

    透射電鏡結(jié)果顯示MCN呈規(guī)則的球形,清晰可見其納米級(jí)介孔結(jié)構(gòu),粒徑約為100 nm,見圖1。

    2.2 差示掃描量熱法(DSC)表征結(jié)果

    使用差示掃描量熱法(DSC)對(duì)載體進(jìn)行表征結(jié)果顯示MCN 沒有相轉(zhuǎn)變溫度,為無定形態(tài)。格列美脲(GM)的熔點(diǎn)為212.2 ℃,在210 ℃左右出現(xiàn)吸收峰;MCN沒有出現(xiàn)吸收峰;PM為藥物與載體物理混合物,出現(xiàn)的吸收峰為藥物與載體共同作用產(chǎn)生的;GM-MCN吸收峰消失,說明藥物的晶型狀態(tài)改變,在 MCN 孔隙中的藥物存在形式為以無定型狀態(tài),見圖2。

    圖1 MCN透射電鏡圖

    圖2 GM-MCN、PM、MCN和GM的 DSC曲線

    2.3 載藥量測定結(jié)果

    2.3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線

    以藥物濃度為橫坐標(biāo) X,峰面積為縱坐標(biāo) Y,繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,計(jì)算回歸方程為Y= 293.8X+22946(r=0.9996)。結(jié)果表明格列美脲的含量在0.2~1.2 mg/mL范圍內(nèi)與峰面積呈良好線性關(guān)系。

    2.3.2 精密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果

    結(jié)果顯示保留時(shí)間穩(wěn)定,峰面積的RSD=0.53%(n=6),表明儀器精密度良好。

    2.3.3 載藥量測定結(jié)果

    經(jīng)HPLC法對(duì)3批樣品按上述色譜條件進(jìn)行載藥量測定,最終載藥量結(jié)果為(19.3±0.35)%。

    2.4 MCN 對(duì)Caco-2細(xì)胞的毒性研究

    通過MTT實(shí)驗(yàn)考察MCN對(duì)Caco-2細(xì)胞的毒性,結(jié)果顯示當(dāng)載體濃度達(dá)到500 μg/mL時(shí)細(xì)胞的存活率為89%,表明MCN 基本無細(xì)胞毒性,適合作為載體材料,見圖3。

    2.5 Caco-2細(xì)胞對(duì)MCN攝取實(shí)驗(yàn)

    通過激光共聚焦顯微鏡觀察人結(jié)腸癌Caco-2細(xì)胞對(duì)MCN攝取情況,結(jié)果顯示綠色熒光為FITC 標(biāo)記的 MCN,Hoechst 33342染料將細(xì)胞核染成藍(lán)色熒光。羅丹明鬼筆環(huán)肽染料將細(xì)胞質(zhì)染成紅色熒光,當(dāng)藥物被Caco-2細(xì)胞攝取后進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)在細(xì)胞團(tuán)周圍形成綠色熒光,Caco-2細(xì)胞對(duì)MCN攝取具有時(shí)間依賴性,3 h的細(xì)胞攝取量明顯高于1 h。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明 MCN作為載體能夠被細(xì)胞吞噬,從而促進(jìn)藥物的吸收,見圖4。

    圖3 MCN對(duì)人結(jié)腸癌Caco-2細(xì)胞存活率的影響

    圖4 人結(jié)腸癌Caco-2細(xì)胞對(duì)MCN攝取情況

    2.6 GM-MCN降糖效果研究

    本研究通過喂養(yǎng)高脂高糖飲食加小劑量STZ來模擬2型糖尿病模型,研究結(jié)果顯示2型糖尿病模型組大鼠明顯出現(xiàn)三多一少的癥狀,空腹血糖升高,給藥3 d和7 d后,GM-MCN組和上市藥組大鼠的血糖與模型組比較明顯降低P<0.05,結(jié)果具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,見圖5。

    *與正常組比較(P<0.05);#與糖尿病組比較(P<0.05)

    3 討 論

    介孔材料是一種特殊的納米材料,由于孔徑不同可分為3類:微孔材料為孔徑小于2 nm,介孔材料為20~50 nm,大孔材料為孔徑大于50 nm,孔徑與比表面積成反比[9]。介孔材料的制備方法常用的有模板法、活化法、溶膠-凝膠法,其中模板法分為硬模板法和軟模板法,本文采用的是軟模板法制備MCN。在制備樣品的過程中模板劑的類型和結(jié)構(gòu)對(duì)介孔材料的結(jié)構(gòu)和性能有著直接的影響,本文在制備樣品時(shí)選取F127 和F123兩種三嵌段共聚物為模板劑,制備的樣品顯示F123制備的樣品結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定,沒有形成有序的孔道,而F127為模板制備的樣品穩(wěn)定性好,存在有序的孔道,因此本文選取F127為模板劑制備MCN。MCN是一種很有前途的藥物載體,它具有光滑的邊緣對(duì)細(xì)胞的損傷小,具有豐富的空隙結(jié)構(gòu),其空間限制效能能夠使藥物的粒子大小和結(jié)晶度降低,增加藥物的分散性,提高藥物的溶出速率,促進(jìn)藥物的吸收。

    本研究通過透射電鏡觀察MCN的結(jié)構(gòu),對(duì)其內(nèi)部構(gòu)成進(jìn)行直觀說明。通過差示掃描量熱法來研究藥物的存在狀態(tài),從結(jié)果中我們看出GM和PM在215 ℃出現(xiàn)一個(gè)吸熱的峰,而MCN和GM-MCN在圖中是一條直線說明其沒有融化和吸熱反應(yīng),說明格列美脲是以無定型狀態(tài)存在MCN中,進(jìn)而改變藥物的晶型提高藥物的溶解性。

    小腸是人體吸收的主要場所,在一定培養(yǎng)條件下人結(jié)腸癌Caco-2細(xì)胞能夠產(chǎn)生與小腸上皮細(xì)胞類似的形態(tài)學(xué),表達(dá)相同標(biāo)志酶,具有相同的攝取轉(zhuǎn)運(yùn)及滲透特征,被用于藥物經(jīng)小腸上皮細(xì)胞吸收機(jī)制的研究[10]。本研究制備MCN載體,采用 Caco-2 細(xì)胞模型,研究MCN被腸上皮細(xì)胞攝取轉(zhuǎn)運(yùn)的特性。研究結(jié)果顯示MCN經(jīng)過內(nèi)吞的方式被 Caco-2 細(xì)胞攝取進(jìn)入細(xì)胞質(zhì),并且隨著時(shí)間的延長攝取量逐漸增加,說明MCN能夠被細(xì)胞吞噬,使得細(xì)胞內(nèi)藥物濃度增加,從而提高小腸吸收及提高藥物口服吸收的生物利用度。

    2型糖尿病是以高血糖為特征的代謝性疾病。本文制備的載藥體系能夠有效地降低2型糖尿病大鼠的空腹血糖,同時(shí)提高格列美脲的生物利用率,減少格列美脲的劑量和和頻率,從而達(dá)到穩(wěn)定的血糖水平,降低糖尿病相關(guān)并發(fā)癥,改善病人的依從性的作用。

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