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    YAP和β-catenin在卵巢癌中的表達(dá)及臨床意義

    2021-01-15 06:58:16李琳葉麗平
    關(guān)鍵詞:二者卵巢癌卵巢

    李琳,葉麗平

    (1.錦州醫(yī)科大學(xué)病理生理學(xué)教研室,遼寧 錦州 121000;2.錦州醫(yī)科大學(xué)附屬盤(pán)錦遼油寶石花醫(yī)院檢驗(yàn)科,遼寧 盤(pán)錦 124010)

    卵巢惡性腫瘤是婦科常見(jiàn)的惡性腫瘤之一,發(fā)病率僅次于子宮頸癌和子宮內(nèi)膜癌而居第三位,但卻是導(dǎo)致女性癌癥死亡的首要原因。卵巢癌發(fā)病隱匿,具有異質(zhì)性,目前仍缺乏有效的早期診斷和治療手段。研究表明,腫瘤的發(fā)生發(fā)展與細(xì)胞信號(hào)通路活性異常密切相關(guān)[1-2]。YAP(yes-associated protein,Yes相關(guān)蛋白),是Hippo信號(hào)通路的關(guān)鍵分子,參與調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、存活和分化,器官的發(fā)育、再生和干細(xì)胞等生物學(xué)功能,并與腫瘤的發(fā)生發(fā)展相關(guān)[3-4]。β-連環(huán)蛋白(β-catenin)是Wnt 信號(hào)通路的重要效應(yīng)蛋白分子,在腫瘤中高表達(dá)并調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖、侵襲和凋亡等生命活動(dòng)[5-6]。近年來(lái)越來(lái)越多的研究證實(shí),Hippo/YAP通路與Wnt/β-catenin通路存在相互交叉作用,協(xié)同促進(jìn)腫瘤的發(fā)生發(fā)展[7]。本研究應(yīng)用免疫組化方法檢測(cè)了YAP和 β-catenin在卵巢癌中的表達(dá)情況,并分析了二者之間表達(dá)相關(guān)性及其各自與臨床病理因素的關(guān)系,旨在探討卵巢癌的發(fā)病機(jī)制,尋找有效的早診手段和分子靶向治療藥物。

    1 材料和方法

    1.1 組織來(lái)源

    基于知情同意原則,收集盤(pán)錦遼油寶石花醫(yī)院住院卵巢癌手術(shù)切除的標(biāo)本66例,所有病例在腫瘤切除前均未進(jìn)行放、化療。根據(jù)年齡、病理類型、FIGO分期、分化程度、有無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移進(jìn)行分組。良性腫瘤組織標(biāo)本30例,對(duì)照組30例取自同時(shí)期住院的卵巢切除患者。新鮮組織標(biāo)本一部分凍存于-80 ℃冰箱備用,用于western blot,一部分經(jīng)甲醛固定石蠟包埋,用于免疫組化染色。

    1.2 免疫組織化學(xué)

    30例正常卵巢組織、30例卵巢良性腫瘤、66例卵巢惡性組標(biāo)本經(jīng)10%中性甲醛固定,石蠟包埋,4 μm厚連續(xù)切片,常規(guī)脫蠟至水,3% H2O2室溫孵育5~10 min以滅活內(nèi)源性過(guò)氧化物酶的活性。蒸餾水沖洗,PBS 浸泡 5 min×2次,抗原高壓熱修復(fù),自然冷卻至室溫。 5%~10% 正常山羊血清封閉,室溫孵育 10 min,傾去血清,滴加一抗工作液,4 ℃孵育過(guò)夜。PBS 沖洗,5 min×3 次,滴加適當(dāng)比例稀釋的生物素標(biāo)記二抗,37 ℃ 孵育 10~30 min。PBS 沖洗,5 min×3次,DAB顯色,蘇木素復(fù)染,中性 樹(shù)膠封片,光鏡觀察。采用 0.01 M PBS液代替一抗作陰性對(duì)照。用已知YAP,β-catenin陽(yáng)性的卵巢癌組織切片作為陽(yáng)性對(duì)照。

    請(qǐng)兩位病理科醫(yī)師雙盲閱片。每張切片隨機(jī)選取5個(gè)高倍視野,每個(gè)視野計(jì)數(shù)100個(gè)細(xì)胞,共計(jì)500個(gè)細(xì)胞。按陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)所占百分比評(píng)分:陰性為0分;陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)≤10%為1分;11%~50%為2分;51%~75%為3分;>75%為4分。再按染色強(qiáng)度評(píng)分:無(wú)色為0分;淡黃色為1分;棕黃色為2分;棕褐色為3分。按兩者乘積分?jǐn)?shù)評(píng)分,0~2分為(-);3~4分為(+);5~8分為(++);9~12分為(+++)。

    1.3 Western blotting 檢測(cè)YAP和β-catenin的蛋白表達(dá)

    將盤(pán)錦遼油寶石花醫(yī)院婦科于2016年5月至2019年5月期間行卵巢手術(shù)切除的標(biāo)本快速凍存,其中卵巢正常組織、良性腫瘤組織、卵巢癌組織各10例。加蛋白裂解液于放有剪碎組織試管內(nèi),超聲至勻漿狀態(tài),在細(xì)胞蛋白提取完成后采用Bradford法進(jìn)行測(cè)定。

    采用10.0%的聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行電泳以分離蛋白樣品,電轉(zhuǎn)移至PVDF膜,封閉后分別按1∶400和1∶1000的濃度加入YAP、β-catenin一抗和二抗,然后孵育2 h,雜交信號(hào)用ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒進(jìn)行檢測(cè)。X線曝光,顯影定影后掃描。各電泳帶的光密度值用Image Pro-plus圖像處理軟件分析,目的蛋白的相對(duì)表達(dá)水平通過(guò)計(jì)算目的片段與β-actin電泳帶密度的相對(duì)值來(lái)表示。

    1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

    病理形態(tài)學(xué)資料采用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件分析。χ2檢驗(yàn)分析YAP,β-catenin表達(dá)的差異及其與病理臨床參數(shù)的關(guān)系。Pearson列聯(lián)系數(shù)分析YAP和β-catenin表達(dá)的相關(guān)性。P<0.05差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    2 結(jié) 果

    2.1 YAP和β-catenin在正常卵巢組織,良性卵巢腫瘤和卵巢癌中的表達(dá)情況

    我們應(yīng)用免疫組化的方法分別檢測(cè)了YAP和β-catenin在30例正常卵巢組織、30例良性卵巢組織和66例卵巢癌中的表達(dá)情況。我們發(fā)現(xiàn)YAP陽(yáng)性表達(dá)主要定位細(xì)胞核,而β-catenin則主要定位于細(xì)胞膜。二者在惡性卵巢組織中的表達(dá)均明顯高于正常卵巢組織和良性卵巢腫瘤。YAP和β-catenin分別在30例正常卵巢組織中陽(yáng)性表達(dá)率為10.0%(3/30)和16.7%(5/30),在30例良性卵巢組織中陽(yáng)性表達(dá)率為33.3%(10/30)和40%(12/30),在66例卵巢癌中的陽(yáng)性表達(dá)率為57.6%(38/66)和65.2%(43/66)。證明YAP和β-catenin均在卵巢癌中存在過(guò)表達(dá),提示與卵巢的惡變有關(guān),見(jiàn)圖1。

    2.2 YAP、β-catenin的表達(dá)與卵巢癌患者臨床病理因素的關(guān)系

    為了進(jìn)一步明確YAP和β-catenin的臨床特點(diǎn),我們分別統(tǒng)計(jì)分析了其表達(dá)與年齡,組織類型,F(xiàn)IGO分期,分化程度和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等臨床病理因素的關(guān)系。結(jié)果發(fā)現(xiàn) YAP和β-catenin均與FIGO分期有關(guān),YAP在FIGOⅠ+Ⅱ期中陽(yáng)性表達(dá)率為43.3%(13/30) 明顯低于Ⅲ+Ⅳ期中的陽(yáng)性率69.4%(25/36),且有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。同樣,β-catenin在FIGO Ⅲ+Ⅳ期中陽(yáng)性表達(dá)率高于Ⅰ+Ⅱ期(86.1%(31/36)vs 40.0%(12/30),P<0.05)。此外,YAP在卵巢癌中過(guò)表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)(P<0.05),β-catenin在卵巢癌中過(guò)表達(dá)與分化程度有關(guān)(P<0.05)。二者的高表達(dá)均與年齡,組織類型無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,見(jiàn)表1、表2。

    A:YAP在正常卵巢組織中的表達(dá);B:YAP在良性卵巢腫瘤中的表達(dá);C:YAP在卵巢癌中的表達(dá);D:β-catenin在正常卵巢組織中的表達(dá);E:β-catenin在良性卵巢腫瘤中的表達(dá);F:β-catenin在卵巢癌中的表達(dá)

    表1 YAP蛋白表達(dá)與卵巢癌臨床病理學(xué)參數(shù)關(guān)系(%)

    表2 β-catenin蛋白表達(dá)與卵巢癌臨床病理學(xué)參數(shù)關(guān)系(%)

    2.3 卵巢癌中YAP和β-catenin的表達(dá)相關(guān)性

    統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果顯示66例卵巢癌患者中YAP 和β-catenin 表達(dá)均陽(yáng)性者33 例,均陰性者18 例;YAP 表達(dá)陽(yáng)性、β-catenin表達(dá)陰性者5例;YAP 表達(dá)陰性、β-catenin 表達(dá)陽(yáng)性者10例,經(jīng)過(guò)Pearson列聯(lián)系數(shù)分析:在66卵巢癌組織中,YAP 和β-catenin 的高表達(dá)呈顯著正相關(guān)(r=0.51,P<0.05),見(jiàn)表3。

    表3 YAP、β-catenin二者表達(dá)的相關(guān)分析

    2.4 Western blotting 檢測(cè)YAP、β-catenin的蛋白表達(dá)

    YAP蛋白的分子質(zhì)量為65 kDa,β-catenin的分子質(zhì)量為92~95 kD,在正常卵巢組織、卵巢良性腫瘤組織和卵巢癌組織中均可見(jiàn)YAP、β-catenin的特異性條帶出現(xiàn)。

    同正常卵巢組織組和卵巢良性腫瘤組相比,卵巢癌組織中的YAP和β-catenin的蛋白表達(dá)水平明顯更高,且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01),見(jiàn)表4、圖2。

    表4 YAP、β-catenin在不同卵巢組織中的蛋白表達(dá)

    圖2 YAP、β-catenin在不同卵巢組織中的蛋白表達(dá)

    3 討 論

    近年來(lái),卵巢癌發(fā)病率呈逐年上升趨勢(shì),手術(shù)切除仍是治療的首選方式。然而,卵巢癌發(fā)病隱匿,患者就診時(shí)往往失去手術(shù)時(shí)機(jī),目前仍未有有效的早診手段,導(dǎo)致卵巢癌仍是婦科腫瘤中死亡率最高的惡性腫瘤。伴隨基因組學(xué)的發(fā)展,從分子學(xué)探討腫瘤發(fā)病機(jī)制,為尋找有效的腫瘤診治靶點(diǎn)提供可能性。

    腫瘤的發(fā)病機(jī)制是多因素,多階段,多基因之間的共同作用。研究證實(shí)在惡性腫瘤中存在多條信號(hào)通路的異常激活或失活。YAP定位于染色體11q22,該區(qū)域在人類多種腫瘤中被證實(shí)存在擴(kuò)增或雜合型突變。Hippo信號(hào)通路的失活可使YAP在細(xì)胞漿積累,進(jìn)入細(xì)胞核后與TEAD結(jié)合,從而調(diào)節(jié)目標(biāo)基因的表達(dá)。研究表明,YAP在多種惡性腫瘤中表達(dá)異常,如結(jié)腸癌、肝癌、肺癌、前列腺癌、乳腺癌、口腔鱗癌、成神經(jīng)管細(xì)胞瘤、食管鱗癌等,并調(diào)節(jié)細(xì)胞的惡性生物學(xué)行為[8]。β-catenin是Wnt信號(hào)傳導(dǎo)過(guò)程中的樞紐,當(dāng)Wnt-1 信號(hào)與細(xì)胞膜上的受體蛋白Frizled(Ez)蛋白結(jié)合后,信號(hào)傳給dishevelled(DSH/Dvl),使其過(guò)磷酸化,DSH 的過(guò)磷酸化抑制了GSK-3β功能,使其不能磷酸化β-catenin 蛋白,導(dǎo)致胞漿內(nèi)游離的β-catenin 增加,β-catenin進(jìn)入胞核與轉(zhuǎn)錄因子LEF 和TCF形成復(fù)合物,促進(jìn)如:c-myct 和cyclinD1 等下游靶基因的表達(dá),從而影響細(xì)胞的增殖、分化、凋亡等行為[9]。已有研究證實(shí)Hippo/YAP通路與Wnt/β-catenin通路在肝癌、大腸癌、乳腺癌和膠質(zhì)瘤中存在協(xié)同促進(jìn)腫瘤的惡性進(jìn)展的作用[7,10-11]71-79。但在卵巢癌中的作用研究尚未明確。

    本研究證實(shí)YAP和β-catenin在卵巢癌中均存在過(guò)表達(dá),提示與卵巢癌的發(fā)生和惡性進(jìn)展有關(guān)。YAP在Hippo通路失活條件下,在細(xì)胞漿中聚集入核后發(fā)揮轉(zhuǎn)錄活化因子的作用。β-catenin在Wnt通路激活條件下,在細(xì)胞漿中聚集后入核亦發(fā)揮轉(zhuǎn)錄活化作用。二者均可以通過(guò)調(diào)節(jié)下游增殖、侵襲和凋亡相關(guān)因子的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)而調(diào)控腫瘤細(xì)胞的惡性生物學(xué)行為。我們證實(shí)了YAP陽(yáng)性表達(dá)主要定位于細(xì)胞核,而β-catenin主要定位于細(xì)胞膜。二者在卵巢癌中的陽(yáng)性表達(dá)率均高于良性卵巢腫瘤和正常卵巢組織。在探討YAP和β-catenin在卵巢癌中高表達(dá)的臨床意義時(shí),我們分析了二者過(guò)表達(dá)與卵巢癌臨床病理因素的關(guān)系即年齡、組織類型、FIGO分期、分化程度和淋巴轉(zhuǎn)移,結(jié)果發(fā)現(xiàn)二者均與FIGO分期有關(guān)(Ⅲ+Ⅳ期中的表達(dá)明顯高于Ⅰ+Ⅱ期)。其中YAP的過(guò)表達(dá)與卵巢癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān),β-catenin的過(guò)表達(dá)與分化程度有關(guān)。

    已有研究顯示,YAP和β-catenin定位于細(xì)胞核時(shí)能夠協(xié)同發(fā)揮轉(zhuǎn)錄活化的作用進(jìn)而促進(jìn)惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展。Hippo 信號(hào)通路活的激活能夠抑制Wnt信號(hào)通路,而Wnt信號(hào)通路的激活亦能抑制Hippo 信號(hào)通路的活性。在腸癌中Hippo 信號(hào)通路活性下調(diào)而Wnt信號(hào)通路活性上調(diào),磷酸化YAP能夠促進(jìn)β-catenin定位于細(xì)胞漿[12]。在膠質(zhì)瘤中,YAP可以通過(guò)GSK3β調(diào)節(jié)β-catenin的表達(dá)進(jìn)而影響腫瘤的增殖,β-catenin亦能調(diào)節(jié)YAP。在肝癌中[13],Wnt/β-catenin信號(hào)通路異常激活時(shí),發(fā)現(xiàn)YAP亦起到關(guān)鍵促癌因子作用[14]。值得一提的是,我們?cè)诒狙芯恐凶C實(shí)了YAP1 和β-catenin 在卵巢癌中高表達(dá)且二者表達(dá)呈正相關(guān)性,這與上述研究報(bào)道結(jié)果一致。提示我們YAP和β-catenin在卵巢癌中亦發(fā)揮協(xié)同促進(jìn)癌癥惡性進(jìn)展的作用,為進(jìn)一步闡明Hippo 與Wnt 信號(hào)通路在卵巢癌的協(xié)同作用提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。但是,二者是如何發(fā)揮協(xié)同作用,仍需進(jìn)一步研究證實(shí)。

    綜上所述,YAP和β-catenin 分別作為Hippo和Wnt 信號(hào)通路中的關(guān)鍵分子在卵巢癌中高表達(dá),并且均與臨床FIGO分期有關(guān),重要的是二者表達(dá)呈正常相關(guān)。我們的研究證實(shí)了YAP和β-catenin在卵巢癌中的協(xié)同促癌作用,為探討卵巢癌發(fā)病分子機(jī)制提供理論研究基礎(chǔ),為臨床卵巢癌早期診治提供依據(jù)。

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