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    內(nèi)翻型膝骨關(guān)節(jié)炎骨結(jié)構(gòu)的形態(tài)學(xué)觀察

    2021-01-15 06:58:12鄔波柳椰馬旭王佳媛王譯晗焦遞進(jìn)
    關(guān)鍵詞:下骨骨板免疫組化

    鄔波,柳椰,馬旭,王佳媛,王譯晗,焦遞進(jìn)

    (1.遼寧省骨關(guān)節(jié)病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室;2.沈陽市骨科醫(yī)院關(guān)節(jié)外科,遼寧 沈陽 110044)

    膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎(knee osteoarthritis,KOA)是臨床上最常見的關(guān)節(jié)慢性退行性疾病,臨床表現(xiàn)為關(guān)節(jié)持續(xù)性疼痛、畸形及功能障礙,嚴(yán)重影響生活品質(zhì)[1-2]。隨著我國人口老齡化的不斷發(fā)展,膝關(guān)節(jié)OA的發(fā)病率逐年增加,但膝關(guān)節(jié)OA的發(fā)病因素和病程進(jìn)展機(jī)制并未十分明確。長(zhǎng)期以來,內(nèi)翻型KOA的原發(fā)病因常被認(rèn)為是軟骨細(xì)胞代謝異常、軟骨基質(zhì)被破壞,但隨著對(duì)骨功能單位研究和認(rèn)識(shí)的不斷深入,有學(xué)者提出不均勻沉降理論[3-4],認(rèn)為膝關(guān)節(jié)OA造成的內(nèi)外翻是由于外側(cè)腓骨支撐導(dǎo)致疏松退變的脛骨平臺(tái)內(nèi)外側(cè)不均勻沉降繼發(fā)膝關(guān)節(jié)力線內(nèi)移或外移,而后越來越多的研究表明內(nèi)翻型KOA的病理改變可能涉及整個(gè)骨軟骨結(jié)構(gòu),尤其是鈣化層和軟骨下骨,可能在內(nèi)翻型KOA的發(fā)病和病情進(jìn)程中發(fā)揮著重要作用[5]。本文采用組織學(xué)觀察及免疫組化的方法,對(duì)人的膝關(guān)節(jié)OA脛骨平臺(tái)的病理改變及成骨破骨活性異常進(jìn)行研究,為進(jìn)一步研究膝關(guān)節(jié)內(nèi)翻的骨結(jié)構(gòu)異常機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

    1 資料與方法

    1.1 一般資料

    新鮮脛骨平臺(tái)標(biāo)本取自2017年5月至2019年5月在我院行人工全膝關(guān)節(jié)置換術(shù)的42例KOA患者,其中男16膝,女26膝,年齡63~85歲,平均76.3歲。病程6~22年,平均12.4年。所有患病膝關(guān)節(jié)均伴有內(nèi)翻畸形。納入標(biāo)準(zhǔn):(1)符合骨關(guān)節(jié)炎診斷標(biāo)準(zhǔn),經(jīng)保守治療不能緩解的嚴(yán)重膝關(guān)節(jié)疼痛;(2)膝關(guān)節(jié)功能受限影響行走,膝關(guān)節(jié)內(nèi)翻畸形嚴(yán)重,常態(tài)膝距在5 cm以上的患者;(3)活動(dòng)時(shí)有骨摩擦感;(4)膝關(guān)節(jié)晨僵時(shí)間≤30 min;(5)膝關(guān)節(jié)骨性肥大伴有骨質(zhì)增生;(6)術(shù)中見脛骨平臺(tái)內(nèi)側(cè)磨損較重,磨損至軟骨下骨質(zhì);外側(cè)磨損較輕,軟骨結(jié)構(gòu)基本完好。排除標(biāo)準(zhǔn):(1)不符合診斷及納入標(biāo)準(zhǔn)者;(2)合并嚴(yán)重器質(zhì)性疾病者;(3)合并有類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、感染、骨腫瘤和創(chuàng)傷等其他膝關(guān)節(jié)疾病者。所有患者均自愿捐贈(zèng)標(biāo)本,并簽署知情同意書,試驗(yàn)經(jīng)沈陽市骨科醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

    1.2 方法

    1.2.1 影像學(xué)檢查

    術(shù)前行影像學(xué)檢查,通過下肢全長(zhǎng)片和正側(cè)位X線片觀察測(cè)量下肢力線和內(nèi)翻角度。

    1.2.2 大體觀察

    獲取新鮮脛骨平臺(tái)標(biāo)本,觀察其軟骨外觀、顏色、光澤度、完整度,有無軟骨磨損、軟化、潰瘍、裂隙和骨贅形成等。

    1.2.3 組織學(xué)觀察

    大體觀察后分別在脛骨平臺(tái)內(nèi)、外側(cè)中央負(fù)重區(qū)取軟骨-軟骨下骨組織塊,共計(jì)84個(gè)標(biāo)本,大小為1.2 cm × 0.6 cm × 0.6 cm,并自然分為兩組:內(nèi)側(cè)磨損組和外側(cè)組。將標(biāo)本置于10%甲醛溶液固定24 h,12%中性EDTA-2Na脫鈣1.5 m,經(jīng)梯度脫水、透明、浸蠟、石蠟包埋后作厚度為4 μm的連續(xù)切片。切片分別行HE染色和Masson染色(具體操作詳見說明書),觀察兩組透明軟骨和軟骨下骨的病理改變情況。

    1.2.4 免疫組化分析

    采用免疫組化SP法對(duì)兩組石蠟切片進(jìn)行抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)、SOX9轉(zhuǎn)錄因子和骨鈣素(OCN)免疫組化染色分析。切片脫水后,0.125%胰蛋白酶37 ℃下行抗原修復(fù)20 min,余下步驟按照SP-9001試劑盒說明操作,DAB顯色,脫水透明,中性樹膠封片。

    免疫組化切片置于100倍Olympus顯微鏡下,隨機(jī)選取每例臨近潮線5個(gè)不重疊視野作圖像分析,測(cè)定陽性顆粒平均灰度值,取每張切片的均值作為每例的測(cè)量值,比較兩組TRAP、SOX9和OCN的蛋白表達(dá)情況。

    1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

    2 結(jié) 果

    2.1 影像學(xué)檢查

    X線片觀察內(nèi)翻角度8°~22°,平均內(nèi)翻角度為12.6°,見圖1。

    圖1 下肢全長(zhǎng)片及正側(cè)位X線片

    2.2 大體觀察

    所有標(biāo)本均可見內(nèi)側(cè)磨損組軟骨退變情況較外側(cè)組更為嚴(yán)重。內(nèi)側(cè)磨損組軟骨平臺(tái)表面粗糙無光澤,多見軟骨下骨暴露,平臺(tái)邊緣多發(fā)骨贅形成;外側(cè)組相對(duì)軟骨表面平整,局部有光澤,無軟骨全層缺失,見圖2。

    左側(cè)為內(nèi)側(cè)磨損組,右側(cè)為外側(cè)組

    2.3 組織學(xué)觀察

    2.3.1 HE染色觀察

    外側(cè)組鏡下觀察,軟骨層厚,軟骨細(xì)胞數(shù)量多且排列整齊,深層偶可見肥大細(xì)胞聚集,潮線完整且有復(fù)制趨勢(shì),無血管越過潮線生長(zhǎng),少見裂隙形成,見圖3A;內(nèi)側(cè)磨損組軟骨表面磨損嚴(yán)重,多發(fā)裂隙形成,軟骨層變薄,軟骨細(xì)胞數(shù)量少且排列紊亂,各層結(jié)構(gòu)界限不清晰,潮線紊亂,血管越過潮線生長(zhǎng),軟骨下骨板異常增厚,見圖3B。

    2.3.2 Masson染色觀察

    外側(cè)組鏡下觀察,軟骨膠原藍(lán)染,軟骨下骨板紅染,軟骨細(xì)胞密集,可見部分退變軟骨從潮線升起紅色火焰狀突起使未鈣化軟骨出現(xiàn)紅染,見圖4A;內(nèi)側(cè)磨損組可見軟骨膠原淺藍(lán)染,軟骨細(xì)胞疏松且紊亂,軟骨表層纖維化,軟骨下骨板紅染,潮線模糊不清,有較多血管翳從潮線通過,侵蝕破壞關(guān)節(jié)軟骨,見圖4B。

    2.4 免疫組化結(jié)果分析

    免疫組化陽性細(xì)胞呈黃棕色,陰性呈藍(lán)色。鏡下觀察結(jié)果顯示,TRAP、SOX9和OCN均在潮線下的軟骨下骨板表達(dá),內(nèi)側(cè)磨損組與外側(cè)組相比TRAP、SOX9和OCN表達(dá)均顯著增加,且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,見圖5?;叶葴y(cè)量結(jié)果見表1。

    外側(cè)組 內(nèi)側(cè)磨損組

    外側(cè)組 內(nèi)側(cè)磨損組

    A:外側(cè)TRAP;B:內(nèi)側(cè)TRAP;C:外側(cè)SOX9;D:內(nèi)側(cè)SOX9;E:外側(cè)OCN;F:內(nèi)側(cè)OCN(箭頭所指為蛋白表達(dá)陽性,箭頭數(shù)量大致顯示出表達(dá)量的多少)

    表1 免疫組化染色灰度值

    3 討 論

    膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎(knee osteoarthritis,KOA)是老年人常見的退行性關(guān)節(jié)疾病。隨著我國老齡化的不斷發(fā)展,膝關(guān)節(jié)OA的發(fā)病率逐年增加,嚴(yán)重影響老年患者的生活質(zhì)量,給社會(huì)帶來沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。膝關(guān)節(jié)OA的主要臨床表現(xiàn)為膝關(guān)節(jié)疼痛、腫脹、活動(dòng)受限的緩慢進(jìn)展,在KOA終末期可致關(guān)節(jié)功能障礙甚至殘疾[6-7]。膝關(guān)節(jié)OA患者晚期易出現(xiàn)膝屈曲內(nèi)翻畸形,其主要特點(diǎn)為內(nèi)側(cè)軟組織緊張,內(nèi)側(cè)副韌帶及內(nèi)側(cè)角半膜肌腱攣縮,脛骨內(nèi)側(cè)平臺(tái)軟骨退變磨損[8]。膝內(nèi)翻患者X線片可見關(guān)節(jié)周圍骨質(zhì)增生、關(guān)節(jié)間隙變窄,脛骨平臺(tái)內(nèi)外側(cè)骨質(zhì)結(jié)構(gòu)發(fā)生改變[9]。

    正常關(guān)節(jié)軟骨為乳白色半透明狀,平滑且有光澤,不含有血管、神經(jīng)和淋巴。軟骨由淺到深可分為4層,分別為淺表層、過渡層、輻射層和鈣化層,前3層統(tǒng)稱為透明軟骨[10]。軟骨下骨包括軟骨下骨板和骨小梁結(jié)構(gòu)。長(zhǎng)期以來,軟骨的退行性變化及異常代謝被認(rèn)為是膝關(guān)節(jié)OA的始發(fā)病因,隨著對(duì)骨軟骨功能單位研究的不斷深入,發(fā)現(xiàn)關(guān)節(jié)軟骨退變與軟骨下骨重塑的協(xié)同作用在內(nèi)翻型KOA進(jìn)程中發(fā)揮著極其重要的作用[11-12]。包括輻射層、潮線、鈣化層及軟骨下骨板在內(nèi)的各功能單位,不僅在結(jié)構(gòu)上緊密相連,更在生物學(xué)功能上相互影響、相互依賴,鈣化層和軟骨下骨的病變不但加快了軟骨退變過程,甚至可能是內(nèi)翻型KOA的始發(fā)原因[13]。

    膝關(guān)節(jié)OA主要有3種臨床表現(xiàn)。一是關(guān)節(jié)間隙變窄,軟骨磨損,半月板被擠到關(guān)節(jié)囊的后側(cè)和外側(cè);二是關(guān)節(jié)邊緣形成骨贅,起到保護(hù)、穩(wěn)定關(guān)節(jié)的作用;三是通常伴有軟骨下骨硬化和骨囊腫,繼而發(fā)生骨破壞。SOX9是骨軟骨形成過程中的生物標(biāo)志物,可以決定間質(zhì)細(xì)胞向軟骨細(xì)胞的分化,其對(duì)軟骨的分化成熟具有重要的正向調(diào)節(jié)作用[14]。骨鈣素(OCN)由成骨細(xì)胞合成用于骨形成,并在骨轉(zhuǎn)換期間釋放到循環(huán)血液中。在早期骨關(guān)節(jié)炎中通過骨礦化增強(qiáng)使骨代謝被激活,因此OCN是成骨細(xì)胞分化的主要表型特征之一[15]。TRAP是破骨細(xì)胞的標(biāo)志性指標(biāo),主要反映軟骨下骨破骨細(xì)胞變化情況[16]。在內(nèi)翻膝患者的KOA進(jìn)程中,股骨髁和脛骨平臺(tái)產(chǎn)生軟骨磨損,脛骨平臺(tái)發(fā)生骨囊腫及軟骨下骨硬化。本文檢測(cè)的這3種因子通過不同途徑解釋膝關(guān)節(jié)OA的各種臨床表現(xiàn)。

    骨重建過程是通過成骨細(xì)胞與破骨細(xì)胞協(xié)同來完成的。成骨與破骨作用的變化均會(huì)影響軟骨下骨的微環(huán)境,進(jìn)而影響骨性關(guān)節(jié)炎的發(fā)生[17]。本研究中,內(nèi)側(cè)磨損組中TRAP的表達(dá)較外側(cè)組明顯增多,表明在骨重建的初始階段,軟骨下骨發(fā)生囊性改變,破骨作用增強(qiáng),破骨細(xì)胞反應(yīng)性增加。內(nèi)側(cè)磨損組中SOX9的表達(dá)較外側(cè)組明顯增多,可能是由于在機(jī)械力學(xué)的刺激下,軟骨磨損增加,造成軟骨修復(fù)能力增強(qiáng),人體機(jī)制試圖修復(fù)這種損傷,代償性的增加了SOX9的表達(dá),進(jìn)而導(dǎo)致內(nèi)側(cè)磨損組的軟骨下骨板異常增厚,該結(jié)果與臨床觀察一致。內(nèi)側(cè)磨損組中OCN的表達(dá)較外側(cè)組明顯增多,其反應(yīng)機(jī)制可能與SOX9相似,機(jī)械力學(xué)磨損刺激下,為保護(hù)、穩(wěn)定膝關(guān)節(jié)正常功能,體內(nèi)合成大量成骨細(xì)胞進(jìn)而形成骨贅。

    綜上所述,本試驗(yàn)結(jié)合組織學(xué)觀察和免疫組化分析,對(duì)比骨性關(guān)節(jié)炎內(nèi)翻膝關(guān)節(jié)兩側(cè)的脛骨平臺(tái),研究其病理改變及成骨破骨活性,證明了鈣化層和軟骨下骨與軟骨一樣,在內(nèi)翻型KOA的發(fā)病和病情進(jìn)程中發(fā)揮著重要作用,為進(jìn)一步研究膝關(guān)節(jié)內(nèi)翻的骨結(jié)構(gòu)異常機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。但本實(shí)驗(yàn)也存在不足之處:缺少軟骨中各因子含量的測(cè)量,無法與鈣化層和軟骨下骨中該指標(biāo)含量進(jìn)行對(duì)比分析;未進(jìn)行影像學(xué)分析,缺乏具體的組織形態(tài)計(jì)量學(xué)參數(shù)。以上不足有待在今后的實(shí)驗(yàn)中進(jìn)一步完善。

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