內(nèi)翻型膝骨關(guān)節(jié)炎骨結(jié)構(gòu)的形態(tài)學(xué)觀察

鄔波，柳椰，馬旭，王佳媛，王譯晗，焦遞進(jìn)

(1.遼寧省骨關(guān)節(jié)病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；2.沈陽市骨科醫(yī)院關(guān)節(jié)外科，遼寧 沈陽 110044)

膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎(knee osteoarthritis，KOA)是臨床上最常見的關(guān)節(jié)慢性退行性疾病，臨床表現(xiàn)為關(guān)節(jié)持續(xù)性疼痛、畸形及功能障礙，嚴(yán)重影響生活品質(zhì)[1-2]。隨著我國人口老齡化的不斷發(fā)展，膝關(guān)節(jié)OA的發(fā)病率逐年增加，但膝關(guān)節(jié)OA的發(fā)病因素和病程進(jìn)展機(jī)制并未十分明確。長(zhǎng)期以來，內(nèi)翻型KOA的原發(fā)病因常被認(rèn)為是軟骨細(xì)胞代謝異常、軟骨基質(zhì)被破壞，但隨著對(duì)骨功能單位研究和認(rèn)識(shí)的不斷深入，有學(xué)者提出不均勻沉降理論[3-4]，認(rèn)為膝關(guān)節(jié)OA造成的內(nèi)外翻是由于外側(cè)腓骨支撐導(dǎo)致疏松退變的脛骨平臺(tái)內(nèi)外側(cè)不均勻沉降繼發(fā)膝關(guān)節(jié)力線內(nèi)移或外移，而后越來越多的研究表明內(nèi)翻型KOA的病理改變可能涉及整個(gè)骨軟骨結(jié)構(gòu)，尤其是鈣化層和軟骨下骨，可能在內(nèi)翻型KOA的發(fā)病和病情進(jìn)程中發(fā)揮著重要作用[5]。本文采用組織學(xué)觀察及免疫組化的方法，對(duì)人的膝關(guān)節(jié)OA脛骨平臺(tái)的病理改變及成骨破骨活性異常進(jìn)行研究，為進(jìn)一步研究膝關(guān)節(jié)內(nèi)翻的骨結(jié)構(gòu)異常機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料

新鮮脛骨平臺(tái)標(biāo)本取自2017年5月至2019年5月在我院行人工全膝關(guān)節(jié)置換術(shù)的42例KOA患者，其中男16膝，女26膝，年齡63～85歲，平均76.3歲。病程6～22年，平均12.4年。所有患病膝關(guān)節(jié)均伴有內(nèi)翻畸形。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)符合骨關(guān)節(jié)炎診斷標(biāo)準(zhǔn)，經(jīng)保守治療不能緩解的嚴(yán)重膝關(guān)節(jié)疼痛；(2)膝關(guān)節(jié)功能受限影響行走，膝關(guān)節(jié)內(nèi)翻畸形嚴(yán)重，常態(tài)膝距在5 cm以上的患者；(3)活動(dòng)時(shí)有骨摩擦感；(4)膝關(guān)節(jié)晨僵時(shí)間≤30 min；(5)膝關(guān)節(jié)骨性肥大伴有骨質(zhì)增生；(6)術(shù)中見脛骨平臺(tái)內(nèi)側(cè)磨損較重，磨損至軟骨下骨質(zhì)；外側(cè)磨損較輕，軟骨結(jié)構(gòu)基本完好。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)不符合診斷及納入標(biāo)準(zhǔn)者；(2)合并嚴(yán)重器質(zhì)性疾病者；(3)合并有類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、感染、骨腫瘤和創(chuàng)傷等其他膝關(guān)節(jié)疾病者。所有患者均自愿捐贈(zèng)標(biāo)本，并簽署知情同意書，試驗(yàn)經(jīng)沈陽市骨科醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 方法

1.2.1 影像學(xué)檢查

術(shù)前行影像學(xué)檢查，通過下肢全長(zhǎng)片和正側(cè)位X線片觀察測(cè)量下肢力線和內(nèi)翻角度。

1.2.2 大體觀察

獲取新鮮脛骨平臺(tái)標(biāo)本，觀察其軟骨外觀、顏色、光澤度、完整度，有無軟骨磨損、軟化、潰瘍、裂隙和骨贅形成等。

1.2.3 組織學(xué)觀察

大體觀察后分別在脛骨平臺(tái)內(nèi)、外側(cè)中央負(fù)重區(qū)取軟骨-軟骨下骨組織塊，共計(jì)84個(gè)標(biāo)本，大小為1.2 cm × 0.6 cm × 0.6 cm，并自然分為兩組：內(nèi)側(cè)磨損組和外側(cè)組。將標(biāo)本置于10%甲醛溶液固定24 h，12%中性EDTA-2Na脫鈣1.5 m，經(jīng)梯度脫水、透明、浸蠟、石蠟包埋后作厚度為4 μm的連續(xù)切片。切片分別行HE染色和Masson染色(具體操作詳見說明書)，觀察兩組透明軟骨和軟骨下骨的病理改變情況。

1.2.4 免疫組化分析

采用免疫組化SP法對(duì)兩組石蠟切片進(jìn)行抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)、SOX9轉(zhuǎn)錄因子和骨鈣素(OCN)免疫組化染色分析。切片脫水后，0.125%胰蛋白酶37 ℃下行抗原修復(fù)20 min，余下步驟按照SP-9001試劑盒說明操作，DAB顯色，脫水透明，中性樹膠封片。

免疫組化切片置于100倍Olympus顯微鏡下，隨機(jī)選取每例臨近潮線5個(gè)不重疊視野作圖像分析，測(cè)定陽性顆粒平均灰度值，取每張切片的均值作為每例的測(cè)量值，比較兩組TRAP、SOX9和OCN的蛋白表達(dá)情況。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié) 果

2.1 影像學(xué)檢查

X線片觀察內(nèi)翻角度8°～22°，平均內(nèi)翻角度為12.6°，見圖1。

圖1 下肢全長(zhǎng)片及正側(cè)位X線片

2.2 大體觀察

所有標(biāo)本均可見內(nèi)側(cè)磨損組軟骨退變情況較外側(cè)組更為嚴(yán)重。內(nèi)側(cè)磨損組軟骨平臺(tái)表面粗糙無光澤，多見軟骨下骨暴露，平臺(tái)邊緣多發(fā)骨贅形成；外側(cè)組相對(duì)軟骨表面平整，局部有光澤，無軟骨全層缺失，見圖2。

左側(cè)為內(nèi)側(cè)磨損組，右側(cè)為外側(cè)組

2.3 組織學(xué)觀察

2.3.1 HE染色觀察

外側(cè)組鏡下觀察，軟骨層厚，軟骨細(xì)胞數(shù)量多且排列整齊，深層偶可見肥大細(xì)胞聚集，潮線完整且有復(fù)制趨勢(shì)，無血管越過潮線生長(zhǎng)，少見裂隙形成，見圖3A；內(nèi)側(cè)磨損組軟骨表面磨損嚴(yán)重，多發(fā)裂隙形成，軟骨層變薄，軟骨細(xì)胞數(shù)量少且排列紊亂，各層結(jié)構(gòu)界限不清晰，潮線紊亂，血管越過潮線生長(zhǎng)，軟骨下骨板異常增厚，見圖3B。

2.3.2 Masson染色觀察

外側(cè)組鏡下觀察，軟骨膠原藍(lán)染，軟骨下骨板紅染，軟骨細(xì)胞密集，可見部分退變軟骨從潮線升起紅色火焰狀突起使未鈣化軟骨出現(xiàn)紅染，見圖4A；內(nèi)側(cè)磨損組可見軟骨膠原淺藍(lán)染，軟骨細(xì)胞疏松且紊亂，軟骨表層纖維化，軟骨下骨板紅染，潮線模糊不清，有較多血管翳從潮線通過，侵蝕破壞關(guān)節(jié)軟骨，見圖4B。

2.4 免疫組化結(jié)果分析

免疫組化陽性細(xì)胞呈黃棕色，陰性呈藍(lán)色。鏡下觀察結(jié)果顯示，TRAP、SOX9和OCN均在潮線下的軟骨下骨板表達(dá)，內(nèi)側(cè)磨損組與外側(cè)組相比TRAP、SOX9和OCN表達(dá)均顯著增加，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見圖5?；叶葴y(cè)量結(jié)果見表1。

外側(cè)組 內(nèi)側(cè)磨損組

外側(cè)組 內(nèi)側(cè)磨損組

A：外側(cè)TRAP；B：內(nèi)側(cè)TRAP；C：外側(cè)SOX9；D：內(nèi)側(cè)SOX9；E：外側(cè)OCN；F：內(nèi)側(cè)OCN(箭頭所指為蛋白表達(dá)陽性，箭頭數(shù)量大致顯示出表達(dá)量的多少)

表1 免疫組化染色灰度值

3 討 論

膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎(knee osteoarthritis，KOA)是老年人常見的退行性關(guān)節(jié)疾病。隨著我國老齡化的不斷發(fā)展，膝關(guān)節(jié)OA的發(fā)病率逐年增加，嚴(yán)重影響老年患者的生活質(zhì)量，給社會(huì)帶來沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。膝關(guān)節(jié)OA的主要臨床表現(xiàn)為膝關(guān)節(jié)疼痛、腫脹、活動(dòng)受限的緩慢進(jìn)展，在KOA終末期可致關(guān)節(jié)功能障礙甚至殘疾[6-7]。膝關(guān)節(jié)OA患者晚期易出現(xiàn)膝屈曲內(nèi)翻畸形，其主要特點(diǎn)為內(nèi)側(cè)軟組織緊張，內(nèi)側(cè)副韌帶及內(nèi)側(cè)角半膜肌腱攣縮，脛骨內(nèi)側(cè)平臺(tái)軟骨退變磨損[8]。膝內(nèi)翻患者X線片可見關(guān)節(jié)周圍骨質(zhì)增生、關(guān)節(jié)間隙變窄，脛骨平臺(tái)內(nèi)外側(cè)骨質(zhì)結(jié)構(gòu)發(fā)生改變[9]。

正常關(guān)節(jié)軟骨為乳白色半透明狀，平滑且有光澤，不含有血管、神經(jīng)和淋巴。軟骨由淺到深可分為4層，分別為淺表層、過渡層、輻射層和鈣化層，前3層統(tǒng)稱為透明軟骨[10]。軟骨下骨包括軟骨下骨板和骨小梁結(jié)構(gòu)。長(zhǎng)期以來，軟骨的退行性變化及異常代謝被認(rèn)為是膝關(guān)節(jié)OA的始發(fā)病因，隨著對(duì)骨軟骨功能單位研究的不斷深入，發(fā)現(xiàn)關(guān)節(jié)軟骨退變與軟骨下骨重塑的協(xié)同作用在內(nèi)翻型KOA進(jìn)程中發(fā)揮著極其重要的作用[11-12]。包括輻射層、潮線、鈣化層及軟骨下骨板在內(nèi)的各功能單位，不僅在結(jié)構(gòu)上緊密相連，更在生物學(xué)功能上相互影響、相互依賴，鈣化層和軟骨下骨的病變不但加快了軟骨退變過程，甚至可能是內(nèi)翻型KOA的始發(fā)原因[13]。

膝關(guān)節(jié)OA主要有3種臨床表現(xiàn)。一是關(guān)節(jié)間隙變窄，軟骨磨損，半月板被擠到關(guān)節(jié)囊的后側(cè)和外側(cè)；二是關(guān)節(jié)邊緣形成骨贅，起到保護(hù)、穩(wěn)定關(guān)節(jié)的作用；三是通常伴有軟骨下骨硬化和骨囊腫，繼而發(fā)生骨破壞。SOX9是骨軟骨形成過程中的生物標(biāo)志物，可以決定間質(zhì)細(xì)胞向軟骨細(xì)胞的分化，其對(duì)軟骨的分化成熟具有重要的正向調(diào)節(jié)作用[14]。骨鈣素(OCN)由成骨細(xì)胞合成用于骨形成，并在骨轉(zhuǎn)換期間釋放到循環(huán)血液中。在早期骨關(guān)節(jié)炎中通過骨礦化增強(qiáng)使骨代謝被激活，因此OCN是成骨細(xì)胞分化的主要表型特征之一[15]。TRAP是破骨細(xì)胞的標(biāo)志性指標(biāo)，主要反映軟骨下骨破骨細(xì)胞變化情況[16]。在內(nèi)翻膝患者的KOA進(jìn)程中，股骨髁和脛骨平臺(tái)產(chǎn)生軟骨磨損，脛骨平臺(tái)發(fā)生骨囊腫及軟骨下骨硬化。本文檢測(cè)的這3種因子通過不同途徑解釋膝關(guān)節(jié)OA的各種臨床表現(xiàn)。

骨重建過程是通過成骨細(xì)胞與破骨細(xì)胞協(xié)同來完成的。成骨與破骨作用的變化均會(huì)影響軟骨下骨的微環(huán)境，進(jìn)而影響骨性關(guān)節(jié)炎的發(fā)生[17]。本研究中，內(nèi)側(cè)磨損組中TRAP的表達(dá)較外側(cè)組明顯增多，表明在骨重建的初始階段，軟骨下骨發(fā)生囊性改變，破骨作用增強(qiáng)，破骨細(xì)胞反應(yīng)性增加。內(nèi)側(cè)磨損組中SOX9的表達(dá)較外側(cè)組明顯增多，可能是由于在機(jī)械力學(xué)的刺激下，軟骨磨損增加，造成軟骨修復(fù)能力增強(qiáng)，人體機(jī)制試圖修復(fù)這種損傷，代償性的增加了SOX9的表達(dá)，進(jìn)而導(dǎo)致內(nèi)側(cè)磨損組的軟骨下骨板異常增厚，該結(jié)果與臨床觀察一致。內(nèi)側(cè)磨損組中OCN的表達(dá)較外側(cè)組明顯增多，其反應(yīng)機(jī)制可能與SOX9相似，機(jī)械力學(xué)磨損刺激下，為保護(hù)、穩(wěn)定膝關(guān)節(jié)正常功能，體內(nèi)合成大量成骨細(xì)胞進(jìn)而形成骨贅。

綜上所述，本試驗(yàn)結(jié)合組織學(xué)觀察和免疫組化分析，對(duì)比骨性關(guān)節(jié)炎內(nèi)翻膝關(guān)節(jié)兩側(cè)的脛骨平臺(tái)，研究其病理改變及成骨破骨活性，證明了鈣化層和軟骨下骨與軟骨一樣，在內(nèi)翻型KOA的發(fā)病和病情進(jìn)程中發(fā)揮著重要作用，為進(jìn)一步研究膝關(guān)節(jié)內(nèi)翻的骨結(jié)構(gòu)異常機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。但本實(shí)驗(yàn)也存在不足之處：缺少軟骨中各因子含量的測(cè)量，無法與鈣化層和軟骨下骨中該指標(biāo)含量進(jìn)行對(duì)比分析；未進(jìn)行影像學(xué)分析，缺乏具體的組織形態(tài)計(jì)量學(xué)參數(shù)。以上不足有待在今后的實(shí)驗(yàn)中進(jìn)一步完善。