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    重組泛素樣特異性蛋白酶1在大腸桿菌中的表達(dá)條件優(yōu)化與分離純化

    2021-01-15 06:58:10張葉明付正豪陳云雨
    關(guān)鍵詞:工程菌原核硫酸銨

    張葉明,付正豪,陳云雨

    (皖南醫(yī)學(xué)院藥物篩選與評(píng)價(jià)研究所,安徽 蕪湖 241000)

    小分子泛素樣修飾蛋白質(zhì)(small ubiquitin-like modifier protein,SUMO)廣泛存在于各種真核細(xì)胞中,是一種通過(guò)結(jié)合賴氨酸側(cè)鏈起相關(guān)調(diào)節(jié)修飾作用的蛋白質(zhì),廣泛參與RNA轉(zhuǎn)錄、DNA修復(fù)、細(xì)胞周期調(diào)控及蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)等[1-2]。目前研究表明SUMO還可以作為重組蛋白質(zhì)表達(dá)的融合標(biāo)簽和分子伴侶,促進(jìn)重組蛋白質(zhì)的折疊與可溶性表達(dá),提高蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性與生物學(xué)活性[3-5]。但重組蛋白質(zhì)融合的SUMO標(biāo)簽可以被泛素樣特異性蛋白酶1(ubiquitin-like specific protease 1,Ulp1)特異性識(shí)別并切割,高效獲得具有天然結(jié)構(gòu)和良好生物學(xué)活性的目的蛋白質(zhì)。

    Ulp1來(lái)源于釀酒酵母,是由621個(gè)氨基酸殘基組成的蛋白質(zhì),含有2個(gè)結(jié)構(gòu)域,一個(gè)是保守性弱的N-端結(jié)構(gòu)域(1~432 aa),另一個(gè)是C-端結(jié)構(gòu)域(432~621 aa),具有促進(jìn)蛋白酶折疊作用。Ulp1的結(jié)構(gòu)分析與蛋白質(zhì)水解實(shí)驗(yàn)證實(shí),Ulp1的活性結(jié)構(gòu)域?yàn)榈?03至621位氨基酸,其表現(xiàn)出與全長(zhǎng)的Ulp1等同的酶切活性,能夠水解以α-氨基連接的SUMO融合蛋白質(zhì)[6]。Ulp1在移除SUMO標(biāo)簽時(shí)依賴SUMO空間結(jié)構(gòu)而不是線性氨基酸序列,實(shí)現(xiàn)了高效地特異性切割。更重要的是,融合蛋白質(zhì)切除SUMO標(biāo)簽后,目的蛋白質(zhì)的N端不含有多余的氨基酸,很好地保持了目的蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)與生物學(xué)活性。本研究旨在優(yōu)化Ulp1(403~621 aa)在大腸桿菌中的原核表達(dá)條件,再以親和層析法一步分離純化,從而高效制備Ulp1,為Ulp1在生物工程中的酶切應(yīng)用奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    1.1.1 菌株和質(zhì)粒 E.coli BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞購(gòu)自全式金公司;pET-28a載體由中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院-北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院藥物研究所林媛副研究員惠贈(zèng)。

    1.1.2 主要試劑 DNA標(biāo)準(zhǔn)分子量、蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)分子量、質(zhì)粒提取試劑盒、NdeⅠ、XhoⅠ購(gòu)自全式金公司;BCA(bicinchoninic acid)購(gòu)自Thermo公司;辣根過(guò)氧化物酶(horseradish peroxidase,HRP)標(biāo)記的羊抗小鼠IgG、小鼠抗組氨酸(histidine,His)標(biāo)簽單克隆抗體購(gòu)自Biosharp公司;卡那霉素、氨芐西林、異丙基硫代半乳糖苷(isopropyl β-D-thiogalactoside,IPTG)購(gòu)自Sigma公司;HisTrapTM層析柱購(gòu)自Cytiva公司;HRP底物化學(xué)發(fā)光液購(gòu)自上海天能科技有限公司;其他所用試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?/p>

    1.1.3 儀器與設(shè)備 恒溫金屬浴(Coyote Biotech公司);超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)(SCIENTZ公司);細(xì)菌振蕩培養(yǎng)箱(上海知楚儀器有限公司);高速冷凍離心機(jī)(Eppendorf公司);蛋白質(zhì)電泳儀與轉(zhuǎn)膜儀(Bio-Rad公司);瓊脂糖水平電泳儀(北京六一生物科技有限公司);凝膠成像系統(tǒng)(上海Clinx公司);AKTA Pure層析系統(tǒng)(GE公司)。

    1.2 方法

    1.2.1 Ulp1原核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定 GenBank檢索Ulp1(403~621 aa)基因序列,并在目的基因兩端分別加入NdeⅠ和XhoⅠ酶切位點(diǎn),由通用生物(安徽)有限公司進(jìn)行基因片段合成。再將目的基因直接連接pET-28a載體中,構(gòu)建重組質(zhì)粒,以雙酶切法進(jìn)行鑒定。

    1.2.2 Ulp1的原核表達(dá) 將構(gòu)建成功的重組質(zhì)粒Ulp1-pET28a以冷CaCl2化學(xué)轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化到E.coli BL21(DE3)細(xì)胞中,后在37 ℃的LB固態(tài)培養(yǎng)基(含50 μg/mL卡那霉素)中過(guò)夜。隨機(jī)選取6個(gè)單菌落到5 mL LB液態(tài)培養(yǎng)基中,誘導(dǎo)Ulp1表達(dá)(30 ℃誘導(dǎo)10 h,IPTG濃度為1 mmol/L)。采用SDS-PAGE電泳方法分析Ulp1的表達(dá)情況。

    1.2.3 Ulp1誘導(dǎo)時(shí)間的優(yōu)化 37 ℃培養(yǎng)工程菌到OD60約為0.7時(shí),誘導(dǎo)溫度設(shè)置為20 ℃,加入 IPTG(1.0 mmol/L)繼續(xù)培養(yǎng)。分別在2、4、6、8、10、12 h時(shí)間點(diǎn)等量收集菌體,通過(guò) SDS-PAGE方法鑒定Ulp1表達(dá)量。分別設(shè)置誘導(dǎo)溫度為25 ℃和30 ℃,重復(fù)以上實(shí)驗(yàn),栓測(cè)分析結(jié)果,從而確定不同誘導(dǎo)溫度的最佳誘導(dǎo)時(shí)間。

    1.2.4 Ulp1誘導(dǎo)溫度的優(yōu)化 等量隨機(jī)采集20 ℃誘導(dǎo)10 h、25 ℃誘導(dǎo)8 h和30 ℃誘導(dǎo)6 h的菌落,采用超聲法裂解菌體,收集上清液與沉淀,以12% SDS-PAGE分析Ulp1的可溶性表達(dá),從而確定Ulp1最佳誘導(dǎo)溫度。

    1.2.5 IPTG誘導(dǎo)濃度的優(yōu)化 將工程菌于37 ℃培養(yǎng)至OD600約為0.7 h,分別加入不同濃度IPTG(0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mmol/L),30 ℃誘導(dǎo)6 h。等量收集菌體,以 SDS-PAGE分析不同IPTG濃度下Ulp1的表達(dá)量,并確定IPTG最佳誘導(dǎo)濃度。

    1.2.6 飽和硫酸銨沉淀制備粗提液 工程菌以0.2 mmol/L IPTG于30 ℃誘導(dǎo)6 h,收集的菌體超聲法破碎,收集菌體裂解上清液。在100 μL上清液中分別加入10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%飽和硫酸銨溶液,4 ℃沉淀2 h。離心收集沉淀,以80 μL TBS(25 mmol/L Tris、150 mmol/L NaCl pH 8.0)重懸,再以12% SDS-PAGE確定各不同飽和硫酸銨濃度中Ulp1沉淀量,確定飽和硫酸銨的最佳沉淀濃度。

    1.2.7 Ulp1分離純化與鑒定 在上述實(shí)驗(yàn)確定的最佳原核表達(dá)條件下,大量誘導(dǎo)工程菌,用30%飽和硫酸銨溶液沉淀菌體裂解上清液,制備粗提液。用適量A液(50 mmol/L 咪唑、0.5 mol/L NaCl、25 mmol/L Tris pH 8.0)重懸,制備粗提液。用0.5 mL/min的流速上樣以10倍柱床體積A液清洗和平衡的HisTrapTM層析柱。隨后按照參考文獻(xiàn)方法進(jìn)行洗脫收集、分離純化[7]。以SDS-PAGE電泳檢測(cè),經(jīng)TBS透析后,再用BCA法分析。

    將含有Ulp1(24 kDa)泳道的電泳膠轉(zhuǎn)膜,開(kāi)展Western blot實(shí)驗(yàn)。一抗為1∶2000稀釋的小鼠抗His標(biāo)簽單抗,二抗為1∶4000稀釋的HRP-羊抗小鼠IgG,用HRP底物化學(xué)發(fā)光液顯影成像。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 Ulp1原核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建

    將合成的Ulp1基因克隆到pET-28a載體中,構(gòu)建了重組質(zhì)粒Ulp1-pET-28a,見(jiàn)圖1A。構(gòu)建的重組質(zhì)粒經(jīng)NdeⅠ和XhoI雙酶切后,可獲得大小約657 bp的特異性片段,擴(kuò)增的特異性片段與Ulp1預(yù)期大小基本一致,說(shuō)明成功構(gòu)建了重組質(zhì)粒Ulp1-pET-28a,見(jiàn)圖1B。

    A:重組質(zhì)粒Ulp1-pET-28a的構(gòu)建;B:重組質(zhì)粒Ulp1-pET-28a的雙酶切鑒定

    2.2 Ulp1的原核表達(dá)

    重組菌經(jīng)1 mol/L IPTG誘導(dǎo)培養(yǎng)后,隨機(jī)選取6株工程菌,以SDS-PAGE分析,實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示在相對(duì)分子量為24 kDa位置均有明顯的目的蛋白質(zhì)表達(dá)條帶,這與Ulp1理論分子量基本相符,說(shuō)明Ulp1原核表達(dá)成功,見(jiàn)圖2。

    1:陰性對(duì)照;2:蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)分子量;3~8:誘導(dǎo)的工程菌

    2.3 確定Ulp1最佳誘導(dǎo)時(shí)間

    工程菌經(jīng)20、25和30 ℃誘導(dǎo)培養(yǎng)后,以SDS-PAGE分析Ulp1原核表達(dá)量。當(dāng)誘導(dǎo)溫度為20 ℃時(shí),Ulp1表達(dá)量在10 h時(shí)趨于表達(dá)量峰值,此時(shí)表達(dá)量約為35%,見(jiàn)圖3a。當(dāng)誘導(dǎo)溫度為25 ℃時(shí),Ulp1表達(dá)量在8 h時(shí)趨于表達(dá)量峰值,此時(shí)表達(dá)量約為33,見(jiàn)圖3b。當(dāng)誘導(dǎo)溫度為30 ℃時(shí),Ulp1表達(dá)量在6 h時(shí)趨于表達(dá)量峰值,此時(shí)表達(dá)量約為36%,見(jiàn)圖3c。

    (a,b,c)Ulp1在20 ℃、25 ℃、30 ℃誘導(dǎo)時(shí)間的優(yōu)化

    2.4 確定Ulp1最佳誘導(dǎo)溫度

    菌體分別在20 ℃誘導(dǎo)10 h、25 ℃誘導(dǎo)8 h和30 ℃誘導(dǎo)6 h后,采用超聲法裂解菌體,收集沉淀與上清液。SDS-PAGE實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,20 ℃誘導(dǎo)10 h時(shí),Ulp1在上清液中含量較少;25 ℃誘導(dǎo)8 h時(shí)和30 ℃誘導(dǎo)6 h時(shí),Ulp1雖有部分包涵體表達(dá),但上清液中Ulp1含量明顯增多,Ulp1以胞內(nèi)可溶形式表達(dá),見(jiàn)圖4。

    1:蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)分子量;2:全菌蛋白質(zhì)(30 ℃);3:上清液(30 ℃);4:沉淀(30 ℃);5:全菌蛋白質(zhì)(25 ℃);6:上清液(25 ℃);7:沉淀(25 ℃);8:全菌蛋白質(zhì)(20 ℃);9:上清液(20 ℃);10:沉淀(20 ℃)

    2.5 確定IPTG最佳誘導(dǎo)濃度

    菌體在30 ℃溫度下分別以不同濃度IPTG(0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mmol/L)誘導(dǎo)6 h,SDS-PAGE實(shí)驗(yàn)表明,雖然IPTG濃度不斷遞增,但Ulp1表達(dá)量基本不變,故選擇0.2 mmol/L IPTG為最佳誘導(dǎo)濃度,見(jiàn)圖5。

    1:陰性對(duì)照;2:蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)分子量;3~7:0.2,0.4,0.6,0.8,1.0 mmol/L IPTG

    綜上所述,確定誘導(dǎo)溫度30 ℃、誘導(dǎo)時(shí)間6 h、IPTG濃度0.2 mmol/L作為Ulp1最佳原核表達(dá)條件。

    2.6 Ulp1分離純化與鑒定

    工程菌在30 ℃下誘導(dǎo)6 h,以不同濃度的飽和硫酸銨沉淀菌體裂解上清液,SDS-PAGE結(jié)果顯示,30%飽和硫酸銨沉淀時(shí)Ulp1大量沉淀,見(jiàn)圖6a。以30%硫酸銨沉淀上清液制備Ulp1粗提液,再用HisTrapTM層析柱分離純化。SDS-PAGE結(jié)果表明,純化的Ulp1經(jīng)考馬斯量藍(lán)染色后,在預(yù)期分子量(24 kDa)位置均出現(xiàn)單一蛋白質(zhì)染色條帶,見(jiàn)圖6b,說(shuō)明Ulp1具有較高的純度,純度大于90%。Western blot表明,在預(yù)期分子量位置仍可呈現(xiàn)單一條帶,證實(shí)了Ulp1的正確表達(dá),見(jiàn)圖6c。純化的Ulp1以BCA法定量,其濃度為1.0 mg/mL,經(jīng)原核表達(dá)條件優(yōu)化后,Ulp1表達(dá)量約為350 mg/L。

    (A)飽和硫酸銨法沉淀Ulp1。1:蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)分子量;2:10%;3:15%;4:20%;5:25%;6:30%;7:35%;8:40%;9:45%;(B)Ulp1的親和層析。1:陰性對(duì)照;2:蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)分子量;3:全菌蛋白質(zhì);4:30%飽和硫酸銨沉淀樣品;5~6:純化的Ulp1條帶;(C)Western blot實(shí)驗(yàn)鑒定Ulp1。1:蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)分子量;2:Ulp1條帶(24 kDa)

    3 討 論

    SUMO融合表達(dá)系統(tǒng)具有顯著提升重組蛋白質(zhì)表達(dá)水平、促進(jìn)目的蛋白質(zhì)正確折疊和提高目的蛋白質(zhì)可溶表達(dá)等優(yōu)點(diǎn),因而廣泛應(yīng)用于容易錯(cuò)誤折疊、有毒和難溶性蛋白質(zhì)的表達(dá)。Ulp1可以特異性識(shí)別并切割SUMO標(biāo)簽,與傳統(tǒng)的切割酶不同,Ulp1識(shí)別SUMO空間結(jié)構(gòu),特異性切割SUMO標(biāo)簽C端的異肽鍵,且切割后的目的蛋白質(zhì)氨基端不含多余的氨基酸,幾乎不影響目的蛋白質(zhì)的生物學(xué)活性,因此高效制備高產(chǎn)量的Ulp1并應(yīng)用于重組蛋白質(zhì)的酶切具有重要的實(shí)踐意義。

    大腸桿菌原核表達(dá)系統(tǒng)具有成本廉價(jià)、操作簡(jiǎn)捷、表達(dá)量高等眾多優(yōu)點(diǎn),已成為制備重組蛋白質(zhì)的首選方案[8]。外源蛋白質(zhì)連接分子量較小的His標(biāo)簽后,可方便重組蛋白的分析檢測(cè)和分離純化,因此本實(shí)驗(yàn)在Ulp1(403~621 aa)的羧基端融合了pET-28a載體的His標(biāo)簽,并以親和層析方法進(jìn)行了Ulp1分離純化。優(yōu)化原核表達(dá)條件是為了在簡(jiǎn)單的實(shí)驗(yàn)環(huán)境下最大量的表達(dá)目的蛋白?;谡T導(dǎo)溫度、誘導(dǎo)時(shí)間和IPTG濃度是影響外源蛋白質(zhì)表達(dá)的重要因素[9-10],本課題組開(kāi)展了Ulp1原核表達(dá)優(yōu)化實(shí)驗(yàn)。結(jié)果顯示,溫度是影響Ulp1表達(dá)的重要因素。20 ℃誘導(dǎo)培養(yǎng)時(shí),Ulp1在上清液中含量較少,這可能與低溫導(dǎo)致目的蛋白表達(dá)速度緩慢有關(guān)。25 ℃與30 ℃誘導(dǎo)培養(yǎng)時(shí),大部分Ulp1表達(dá)為可溶形式,這可能是高溫增加了蛋白質(zhì)正確折疊、促進(jìn)了蛋白質(zhì)可溶。在低溫環(huán)境下大腸桿菌發(fā)展緩慢,可通過(guò)延長(zhǎng)誘導(dǎo)時(shí)間以促進(jìn)目的蛋白的表達(dá)。菌體在30 ℃環(huán)境下培養(yǎng)時(shí),Ulp1表達(dá)量隨著誘導(dǎo)時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸升高,在6 h左右后表達(dá)量趨于平穩(wěn),表達(dá)量約為35%,最高表達(dá)量約為350 mg/L,不低于現(xiàn)有文獻(xiàn)報(bào)道[11]。另外,IPTG對(duì)Ulp1誘導(dǎo)效率很高,濃度為0.2 mmol/L時(shí)即可達(dá)到較好的誘導(dǎo)效果。故此確定0.2 mmol/L IPTG、30 ℃誘導(dǎo)6 h作為Ulp1在大腸桿菌中的最佳表達(dá)條件。

    綜上所述,本研究成功進(jìn)行了Ulp1原核表達(dá)條件的優(yōu)化與分離純化,為Ulp1在生物工程中的酶切應(yīng)用奠定了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

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