雞LTBP1蛋白單克隆抗體的制備及鑒定

滕 蔓，遲佳琦，柴書軍，羅 俊,4

(1.河南省農(nóng)業(yè)科學院 農(nóng)業(yè)部動物免疫學重點實驗室/河南省動物免疫學重點實驗室，河南 鄭州 450002；2.河南省農(nóng)業(yè)科學院 中英禽病國際研究中心，河南 鄭州 450002；3.北京中醫(yī)藥大學 東方醫(yī)院，北京 100078；4.河南科技大學 動物科技學院/動物疫病與公共衛(wèi)生重點實驗室，河南 洛陽 471003)

轉(zhuǎn)化生長因子結合蛋白(Transforming growth factor binding proteins,TGFs)是一類細胞外基質(zhì)蛋白超家族，具有調(diào)節(jié)細胞的增殖、分化、發(fā)育和凋亡,控制細胞生長速度,刺激細胞外基質(zhì)形成，抑制免疫反應，增加黏附分子表達，影響胚胎發(fā)育和器官形成以及腫瘤發(fā)生等生物學功能[1-4]。潛在轉(zhuǎn)化生長因子結合蛋白(Latent transforming growth factor-β binding proteins，LTBPs)是細胞外基質(zhì)(Extracellular matrix，ECM)糖蛋白超家族的成員，包括纖維蛋白1、2和3以及潛在的TGF結合蛋白1—4[5-7]。與纖維蛋白一樣，LTBPs主要由6個半胱氨酸重復序列組成。其中，LTBPs 的1、3、4中的第3個半胱氨酸重復序列是潛在TGFs的共價結合位點[8-9]，在TGFs的儲存、激活和調(diào)節(jié)中起重要作用[10]。

TGF-β信號通路及其相關蛋白是近年來信號傳導研究領域的熱點，LTBP1蛋白在調(diào)控TGF-β信號通路的信號傳遞中發(fā)揮重要作用。LTBP1蛋白的降解可激活TGF-β信號通路，繼而導致腫瘤的發(fā)生和發(fā)展[11-13]。因此，開展相關研究常常需要用到LTBP1蛋白抗體。目前，可用的商品化LTBP1抗體均只能識別哺乳動物細胞蛋白，尚無可用于識別禽源LTBP1蛋白的抗體，嚴重制約了深入開展相關研究。鑒于此，制備抗雞LTBP1蛋白的特異性單克隆抗體，旨在為后續(xù)禽類LTBP1蛋白相關的功能研究奠定基礎。

1 材料和方法

1.1 主要試劑和材料

pET-30a載體為本實驗室保存；E.coliJM109和BL21感受態(tài)細胞、pMDTM18-T載體、限制性內(nèi)切酶BamHⅠ和XhoⅠ、ExTaq酶、DNA Ligation Kit 2.0連接酶、IPTG和低分子質(zhì)量DNA Marker均購自TaKaRa公司；PEG-1500、Plasmin(From bovine plasma)均購自德國Roche公司；RIPA裂解液和PierceTMBCA Protein Assay Kit均購自Thermo公司；ECL顯影液購自CST公司；NS0 細胞、Hela、293T、BHK-21、L929、PK-15、ST、Vero、Cos-7、DF-1傳代細胞系均為本實驗室保存；FITC標記的兔抗鼠IgG購自美國Abbkine公司；RPMI-1640細胞培養(yǎng)基、HAT及HT篩選培養(yǎng)基、胎牛血清(FBS)均購自Gibco公司；其他常規(guī)試劑均為國產(chǎn)分析純產(chǎn)品。

1.2 雞LTBP1表達載體的構建

用Primer Premier 5.0設計擴增雞LTBP1基因的特異性引物，上游引物序列:5′-GTTGGATCCTGCCACCTTCCCTGCATG-3′，下游引物序列:5′-GGTCTCGAGTTAGGCTTTTCCAACACTGCAA-CAG-3′(下劃線標示BamHⅠ和XhoⅠ酶切位點)，以CEF細胞cDNA為模版，PCR擴增雞LTBP1部分基因片段(基因位點：229—1 153)。PCR反應程序為：95 ℃預變性5 min；95 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，30個循環(huán)；72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖電泳鑒定后，利用凝膠回收試劑盒進行常規(guī)割膠，回收純化后的PCR產(chǎn)物與pMDTM18-T載體連接、轉(zhuǎn)化并測序鑒定。將鑒定正確的pMDTM18-T-LTBP1克隆質(zhì)粒和pET-30a表達載體同時用BamHⅠ和XhoⅠ進行雙酶切，1%瓊脂糖電泳回收LTBP1基因片段與表達載體質(zhì)粒，按照說明書用DNA Ligation Kit 2.0連接酶連接，構建重組表達質(zhì)粒pET-30a-LTBP1，轉(zhuǎn)化E.coliBL21，涂板培養(yǎng)過夜，挑單菌落進行PCR鑒定，陽性菌進行擴大培養(yǎng)、質(zhì)粒提取及雙酶切鑒定。

1.3 雞LTBP1重組蛋白的表達及純化

將含pET-30a-LTBP1質(zhì)粒的陽性菌種活化，接種于LB 培養(yǎng)基(含100 μg/mL 氨芐青霉素)，37 ℃、250 r/min 培養(yǎng)至OD600達到0.6～0.8 時，加入IPTG使終濃度為1 mmol/L，誘導培養(yǎng)3 h，取菌樣1 mL離心收集菌體，加入適量PBS重懸后加等體積的2×SDS-PAGE電泳上樣緩沖液混勻，沸水浴5 min裂解菌體，進行SDS-PAGE 電泳檢測，用考馬斯亮藍染色，再用脫色液脫色至背景清晰，觀察表達結果。將上述檢測確定誘導表達的菌種在37 ℃條件下大量培養(yǎng)并按上述方法誘導表達，收集菌體用PBS重懸后，在冰浴條件下超聲破碎，4 ℃條件下12 000 r/min 離心10 min，收集沉淀。用8 mol/L尿素溶解包涵體，隨后用逐步遞減濃度的尿素溶液連續(xù)透析，最后溶于10 mmol/L Tris溶液中。將上述蛋白質(zhì)溶液加入鎳柱中吸附，分別用Wash Buffer洗滌、Elution Buffer 洗脫，分別收集洗脫液，將各管洗脫液用紫外分光光度計分別測定蛋白質(zhì)含量。分別取上述洗脫液與等量的2×SDS-PAGE電泳上樣緩沖液混勻，煮沸變性 5 min，進行SDS-PAGE電泳檢測純化結果。

1.4 小鼠免疫

取6周齡Balb/C雌性小鼠5只，首免用純化的LTBP1蛋白以50 μg/只的劑量加等量弗氏完全佐劑混合乳化，背部皮下分點注射。加強免疫時用弗氏不完全佐劑混合乳化，共免疫4次，每次間隔3周，4免后10 d斷尾采血分離血清，間接酶聯(lián)免疫吸附試驗(Indirect enzyme-linked immunosorbent assay,iELISA)和間接免疫熒光試驗(Indirect immunofluorescence assay,IFA)檢測血清抗體效價。選擇效價最高的小鼠用于細胞融合。融合前腹腔注射不加佐劑的LTBP1純化蛋白，按50 μg/只的劑量進行超免，超免3 d后取小鼠脾臟細胞用于細胞融合。

1.5 細胞融合及陽性雜交瘤篩選

按常規(guī)方法進行細胞融合，將NS0 細胞與超免鼠脾臟細胞以個數(shù)比1∶10進行混合，PEG-1500為融合劑，融合后細胞用RPMI-1640/HAT培養(yǎng)液分散接種于4塊96孔培養(yǎng)板中，200 μL/孔，置37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，第7～10 天抽取細胞上清檢測。用純化的LTBP1蛋白包被酶標板，iELISA法檢測雜交瘤細胞上清，陽性雜交瘤細胞轉(zhuǎn)至24孔板擴大培養(yǎng)，復測后選取強陽性孔2～3個以有限稀釋法進行亞克隆，一般進行2～3次，末次亞克隆后選出狀態(tài)良好、生長旺盛的強陽性單克隆細胞株擴大培養(yǎng)，離心收集細胞用凍存液(DMSO∶小牛血清∶DMEM=1∶5∶4)重懸細胞后凍存于液氮中。

1.6 單克隆抗體腹水制備

采用體內(nèi)誘生腹水法生產(chǎn)單克隆抗體[14]。接種雜交瘤細胞之前14 d，挑選經(jīng)產(chǎn)的Balb/C小鼠，腹腔注射滅菌液體石蠟，0.5 mL/只。將生長對數(shù)期單抗雜交瘤細胞經(jīng)滅菌PBS洗2遍，重懸后腹腔接種已預處理的Balb/C小鼠(3×106個細胞/0.5 mL/鼠)，約7～14 d待小鼠腹部膨脹明顯時收集腹水，3 000 r/min離心15 min后，收集上清，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.7 雞源細胞與單克隆抗體的IFA染色鑒定

復蘇液氮凍存的DF-1傳代細胞系，同時按常規(guī)方法制備CEF，分別用含10% FBS的DMEM培養(yǎng)基，置37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，更換含2% FBS的DMEM維持液，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3～4 d。取出細胞用PBS洗2遍，加入用無血清DMEM培養(yǎng)基稀釋的0.1 U/mL的Plasmin溶液，37 ℃溫箱孵育 1 h[13]，然后按常規(guī)方法進行IFA染色，對篩選的抗雞LTBP1蛋白的單克隆抗體腹水進行鑒定。

1.8 Western blot鑒定

將DF-1和CEF細胞分別接種至6孔細胞板上，生長至細胞單層后棄去培養(yǎng)基，每孔用1 mL PBS洗2遍，然后每孔用1 mL PBS分別刮取收集細胞，3 000 r/min離心5 min，棄去上清，每種細胞各加入100 μL預冷的RPIA細胞裂解液，冰上靜置10 min后將裂解液與細胞充分混勻。收集細胞裂解懸液，4 ℃條件下12 000 r/min離心10 min，沉淀用PBS洗2遍，加入用無血清DMEM培養(yǎng)基稀釋的0.1 U/mL的Plasmin溶液，37 ℃溫箱消化1 h，80%乙醇溶液沉淀，4 ℃條件下12 000 r/min離心10 min，沉淀用PBS溶解[15]。然后使用PierceTMBCA Protein Assay Kit，對上述方法提取的2種細胞間質(zhì)蛋白的濃度進行測定，-80 ℃保存?zhèn)溆?。定量后的DF-1和CEF細胞間質(zhì)蛋白以相同的上樣量進行 SDS-PAGE電泳，然后用半干轉(zhuǎn)膜儀將凝膠電泳分離的蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上(恒壓15 V，轉(zhuǎn)膜90 min)。轉(zhuǎn)膜后，以5%脫脂奶室溫封閉2 h，PBST洗滌3遍；用5%脫脂奶1∶1 000稀釋的待檢抗LTBP1單克隆抗體腹水孵育，置4 ℃搖床中孵育過夜，PBST振搖充分洗滌；加5%脫脂奶1∶1 000稀釋的羊抗鼠 IgG-HRP，37 ℃孵育1 h，PBST洗滌3遍。用ddH2O稀釋ECL反應液20×LumiGLOReagent和20×Peroxide至工作濃度，將反應液滴在膜上孵育1～5 min，棄ECL工作液，將膜轉(zhuǎn)移至X片夾中壓片。暗盒中曝光3～5 min后取出，依次置入顯影液和定影液中。最后用水沖洗膠片并晾干。

1.9 哺乳動物細胞與單克隆抗體的IFA鑒定

從液氮中取出凍存的293T、Hela、Vero、Cos-7、BHK-21、L929、PK-15和ST傳代細胞系，常規(guī)方法進行復蘇，按照1.7中所述方法，利用IFA對待檢抗LTBP1單克隆抗體腹水與這8種不同來源的細胞LTBP1蛋白反應的特異性進行分析。

2 結果與分析

2.1 雞LTBP1蛋白表達載體的構建和鑒定

PCR擴增雞LTBP1基因片段，1%瓊脂糖電泳回收產(chǎn)物連接 pMDTM18-T載體，轉(zhuǎn) 化大 腸 桿 菌JM109 感受態(tài)細胞中，經(jīng) PCR鑒定和測序分析，將構建正確的pMDTM18-T-LTBP1克隆質(zhì)粒和pET-30a表達載體同時用BamHⅠ和XhoⅠ進行雙酶切，1%瓊脂糖電泳分別回收LTBP1基因片段和pET-30a載體片段，經(jīng)T4連接酶連接后轉(zhuǎn)化E.coliBL21感受態(tài)細胞，挑單菌落搖菌培養(yǎng)提取質(zhì)粒后進行PCR鑒定以及BamHⅠ和XhoⅠ雙酶切鑒定，均可見符合預期大小的電泳條帶，確認LTBP1基因正確插入，成功構建重組表達質(zhì)粒pET-30a-LTBP1(圖1)。

M.DNA Marker；1.pET-30a-LTBP1的PCR產(chǎn)物；2.pET-30a-LTBP1的雙酶切

2.2 雞LTBP1蛋白的表達與純化

收集pET-30a-LTBP1轉(zhuǎn)化BL21陽性克隆的菌液，經(jīng)IPTG誘導培養(yǎng)3 h后，SDS-PAGE電泳檢測蛋白質(zhì)表達情況。結果顯示，與pET-30a空載質(zhì)粒轉(zhuǎn)化菌相比，經(jīng)誘導表達后的pET-30a-LTBP1重組質(zhì)粒陽性菌中有1條明顯的約35 ku的蛋白質(zhì)表達條帶。誘導的菌體經(jīng)離心和高壓破碎離心后，發(fā)現(xiàn)LTBP1蛋白主要以包涵體形式存在于E.coliBL21中。將包涵體蛋白洗滌、溶解、復性、透析、鎳柱純化后將收集的洗脫液經(jīng)SDS-PAGE電泳分析。結果顯示，復性后有部分可溶性LTBP1蛋白存在，純度較高(圖2)。

M.蛋白質(zhì)Marker；1.IPTG誘導菌液；2.未誘導菌液；3.誘導菌裂解液上清；4.誘導菌裂解液沉淀；5.1 mol/L尿素溶解上清；6.1 mol/L尿素溶解沉淀；7.10 mmol/L Tris溶解上清；8.10 mmol/L Tris溶解沉淀

2.3 抗雞LTBP1蛋白的單克隆抗體制備

純化的重組LTBP1表達蛋白免疫小鼠4次后第10天，斷尾采血分離血清，分別用IFA和iELISA檢測免疫鼠血清多克隆抗體效價。IFA檢測結果顯示，5只免疫鼠均產(chǎn)生了較高的抗體效價，其中1號鼠和3號鼠IFA效價達到了1∶3 200(表1)。以純化的LTBP1蛋白包被酶標板(20 μg/mL)，iELISA 檢測結果顯示，5只免疫鼠同樣可檢測到高效價抗體，其中1號免疫鼠血清iELISA效價最高，達到了1∶64 000(表2)。優(yōu)先選擇1號鼠進行超免，然后制備脾臟細胞進行細胞融合，雜交瘤生長9 d后取細胞上清用iELISA檢測，挑選效價最高的雜交瘤細胞株3C11和2B1進行亞克隆，獲得2株穩(wěn)定分泌抗LTBP1蛋白單克隆抗體的雜交瘤細胞株，分別命名為3C11-A9和2B1-G7。用3C11-A9雜交瘤細胞株接種經(jīng)產(chǎn)小鼠，成功制備了抗LTBP1蛋白的單克隆抗體腹水。

表1 免疫鼠多克隆抗體血清IFA效價

表2 免疫鼠多克隆抗體血清iELISA效價

2.4 抗雞LTBP1單克隆抗體的IFA鑒定

用3C11-A9單克隆抗體腹水，分別對雞源細胞CEF和DF-1進行IFA染色，結果顯示，CEF和DF-1細胞與制備的3C11-A9株抗LTBP1單克隆抗體腹水反應后，均呈現(xiàn)特異性的綠色熒光染色(圖3)，IFA效價最高可達到1∶8 000。

圖3 CEF和DF-1細胞與3C11-A9單克隆抗體的IFA染色(100 ×)

2.5 抗雞LTBP1單克隆抗體的Western blot鑒定

分別提取雞源細胞CEF和DF-1的細胞間質(zhì)蛋白，定量后以等量的蛋白質(zhì)上樣量(各20 μg)進行 SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)膜后以3C11-A9單克隆抗體腹水(1∶5 000)作為一抗，羊抗鼠 IgG-HRP(1∶1 000)作為二抗，進行Western blot鑒定。結果顯示，雖然存在一些較弱的非特異性反應條帶出現(xiàn)，但雞CEF和DF-1的細胞間質(zhì)蛋白均可與3C11-A9單克隆抗體產(chǎn)生很強的特異性反應，蛋白質(zhì)條帶大小約為187 ku，與預期的LTBP1蛋白大小相符(圖4)。

圖4 雞LTBP1單克隆抗體的Western blot分析

2.6 雞LTBP1單克隆抗體對哺乳動物細胞的IFA鑒定

分別制備傳代細胞系293T、Hela、Vero、Cos-7、BHK-21、L929、PK-15和ST的細胞單層，用3C11-A9單克隆抗體腹水進行IFA鑒定。結果顯示，上述8種哺乳動物細胞與制備的抗雞LTBP1蛋白的單克隆抗體腹水反應后，均可呈現(xiàn)特異性的熒光染色(圖5)。

圖5 哺乳動物細胞系與3C11-A9單克隆抗體的IFA染色(100×)

3 結論與討論

LTBP1是潛在性TGF-β結合蛋白家族的重要成員，作為分子伴侶可結合潛在性TGT-β，對于TGT-β從細胞內(nèi)向細胞間質(zhì)的轉(zhuǎn)運、分泌、成熟以及TGF-β通路的信號傳遞極其重要，是TGF-β信號傳遞的總開關[16-19]。筆者所在課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，雞LTBP1基因是致瘤性禽皰疹病毒馬立克病病毒(Marek’s disease virus,MDV)編碼的原癌基因miR-155同源物miR-M4-5p調(diào)控的重要宿主靶基因[20]。為了進一步研究在MDV感染過程中，miR-M4-5p通過靶向下調(diào)LTBP1的表達，進而顯著降低TGF-β1的分泌、抑制TGF-β通路信號傳遞并最終活化宿主癌蛋白c-MYC過表達的促瘤發(fā)生機制，先后購買了數(shù)種國內(nèi)外商品化的LTBP1抗體產(chǎn)品。然而，這些抗體雖然與大多數(shù)哺乳動物細胞的LTBP1蛋白反應性良好，但無一抗體可與禽類細胞的LTBP1蛋白發(fā)生反應，這很可能是由于禽類與脊椎動物LTBP1基因同源性較低所致。本研究首先分析了禽類LTBP1與哺乳類LTBP1蛋白的序列同源性，結合哺乳動物細胞LTBP1蛋白的結構，選取兩者較為保守的抗原性區(qū)域進行引物設計，利用PCR技術從CEF細胞中擴增了雞LTBP1基因，成功構建了原核表達載體，并將純化的重組蛋白免疫Balb/C小鼠后進行細胞融合，經(jīng)過篩選獲得了穩(wěn)定分泌抗雞LTBP1蛋白特異性單克隆抗體的雜交瘤細胞株3C11-A9和2B1-G7。經(jīng)過IFA和Western blot鑒定，結果表明，制備的LTBP1單克隆抗體3C11-A9與雞CEF和DF-1的細胞間質(zhì)蛋白均可產(chǎn)生很強的特異性反應。雖然Western blot顯示存在一些較弱的非特異性反應條帶，但在以原核表達蛋白為免疫原制備的抗體反應中屬于常見現(xiàn)象。進一步的試驗表明，3C11-A9不僅可特異性識別禽源細胞CEF和DF-1表達的LTBP1蛋白，而且與其他多種哺乳動物(人、猴、鼠、豬)來源的細胞系表達的LTBP1蛋白反應特異性良好，可以同時滿足哺乳類和禽類LTBP1蛋白及TGF-β信號通路相關的功能研究。