外排泵抑制劑CCCP對不同耐藥機(jī)制介導(dǎo)的沙門菌黏菌素耐藥性的逆轉(zhuǎn)作用

崔小蝶，易開放，楊影影，賀丹丹，吳 華，苑 麗，胡功政

(河南農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，河南 鄭州 450046)

沙門菌是一種人畜共患病原菌，給我國養(yǎng)殖業(yè)造成了巨大威脅。黏菌素(Colistin，COL)是治療動(dòng)物革蘭氏陰性桿菌感染包括沙門菌病的常用有效藥物。但隨著其廣泛使用，沙門菌對其耐藥性也日益嚴(yán)重，給臨床治療帶來了巨大的挑戰(zhàn)。目前，已闡明的細(xì)菌對黏菌素耐藥的機(jī)制主要有2種[1-2]：一是染色體介導(dǎo)的2個(gè)雙組分信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)(TCS)PhoPQ和PmrAB(包括2個(gè)調(diào)控元件MgrB和PmrD)。PmrAB和PhoPQ中的基因發(fā)生突變，可使其下游的pmrC、pmrH等脂多糖(LPS)修飾相關(guān)基因的表達(dá)量上升，進(jìn)而使細(xì)菌的類脂A發(fā)生4-氨基-4-脫氧-L-阿拉伯糖(Ara4N)或磷酸乙醇胺(pENT)修飾，使細(xì)菌表面的負(fù)電荷減少，降低了細(xì)菌對陽離子多肽黏菌素的吸附而產(chǎn)生耐藥[3]。mgrB基因的缺失、變異、插入或截?cái)嗍Щ?，可引起PhoPQ系統(tǒng)的上調(diào)，進(jìn)而導(dǎo)致下游pmrHFIJKLM基因表達(dá)的上調(diào)，最后導(dǎo)致對黏菌素耐藥[4-5]。二是質(zhì)粒介導(dǎo)的黏菌素耐藥基因mcr。2015年，我國首次在動(dòng)物源大腸埃希菌中發(fā)現(xiàn)了質(zhì)粒介導(dǎo)的黏菌素耐藥基因mcr-1[6]。隨后，7個(gè)新的質(zhì)粒介導(dǎo)的黏菌素耐藥基因mcr2—mcr8也陸續(xù)在中國或歐洲國家被發(fā)現(xiàn)[7]。

細(xì)菌外排泵對藥物的外排作用是細(xì)菌對多種抗生素耐藥的重要機(jī)制之一。許多外排泵可以降低細(xì)菌對抗菌藥物的敏感性，如MexXY-OprM和AcrAB-TolC[8-9]。外排泵抑制劑(Efflux pump inhibitors，EPIs)可通過不同的機(jī)制失活或抑制AcrAB-TolC等外排泵的功能。已發(fā)現(xiàn)的EPIs有多種，氰氯苯腙(CCCP)是一種抑制質(zhì)子轉(zhuǎn)運(yùn)的解偶聯(lián)劑，可以阻斷主動(dòng)外排系統(tǒng)能量來源，使藥物在細(xì)菌體內(nèi)的蓄積量增加，恢復(fù)細(xì)菌對藥物的敏感性[10]。已證明CCCP對氟喹諾酮類、四環(huán)素類等抗菌藥物的抗菌作用有增強(qiáng)作用[11]。近年的研究表明，CCCP能逆轉(zhuǎn)肺炎克雷伯菌、大腸桿菌等對黏菌素的耐藥性[12-14]，但對動(dòng)物源沙門菌黏菌素耐藥性的影響尚未見報(bào)道。為此，觀察CCCP對不同耐藥機(jī)制的沙門菌分離菌株黏菌素耐藥性的逆轉(zhuǎn)作用，為尋找控制耐黏菌素沙門菌感染的聯(lián)合用藥措施提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 供試菌株：2018—2019年從河南省部分養(yǎng)殖場的疑似沙門菌病的病死雞肝臟樣品分離到58株沙門菌，從中隨機(jī)選擇8株黏菌素耐藥沙門菌為受試菌株。全基因組測序?qū)φ站髠抽T菌標(biāo)準(zhǔn)株(CVCC?541)購自中國獸藥監(jiān)察所；質(zhì)控菌株為大腸埃希菌ATCC?25922，購自中國普通微生物菌種保存中心。

1.1.2 主要試劑和藥品 主要培養(yǎng)基LB肉湯、LB瓊脂、SS瓊脂、MHB肉湯培養(yǎng)基等均購于青島海博生物技術(shù)有限公司。瓊脂糖(Takara公司，Japan)、2×EsTaqMasterMix(北京康為世紀(jì)生物技術(shù)有限公司)、50×TAE(北京索萊寶生物科技有限公司)、熒光染料溴化乙錠(上海生工生物技術(shù)服務(wù)有限公司)。細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒(DP302)購于天根生化科技(北京)有限公司。CCCP(含量≥97%)購于美國Sigma公司。黏菌素(效價(jià)23 988 u/mg)購于河北圣雪大成唐山制藥有限責(zé)任公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 供試菌株分離 將221份病料分別均勻涂布于SS培養(yǎng)基上，37 ℃培養(yǎng)16～18 h，挑取單個(gè)菌落接種于LB肉湯，放于水浴恒溫振蕩器12 h，再次接種于SS培養(yǎng)基，如此反復(fù)直至SS培養(yǎng)基上均為純黑色的單個(gè)菌落。挑取單個(gè)的黑色菌落接種于5 mL的LB肉湯中，放置于37 ℃搖床中180 r/min振蕩培養(yǎng)，16～18 h后取出備用。

1.2.2 供試菌株鑒定 將分離到的菌株采用裂解法提取基因組DNA。參考文獻(xiàn)[15-16]的引物及反應(yīng)條件，分別進(jìn)行沙門氏菌侵襲基因invA和16S rRNA的PCR擴(kuò)增鑒定。取PCR反應(yīng)產(chǎn)物1%瓊脂糖凝膠電泳，溴化乙錠染色，凝膠系統(tǒng)下觀察結(jié)果。PCR產(chǎn)物送上海生工生物技術(shù)服務(wù)有限公司進(jìn)行測序分析。PCR陽性菌株同時(shí)進(jìn)行基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(MALDI-TOF/MS)鑒定。引物由上海生工生物技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

1.2.3 供試藥液的配制及保存 用分析天平稱取黏菌素，用漩渦振蕩儀進(jìn)行振蕩混勻制備質(zhì)量濃度為5 120 mg/L抗菌藥物原液。用二甲基亞砜(DMSO)制備5 000 mg/L質(zhì)量濃度的CCCP原液。采用0.22 μm的濾膜進(jìn)行過濾除菌，儲(chǔ)存于4 ℃以備后續(xù)使用。

1.2.4 CCCP對沙門菌黏菌素耐藥性的逆轉(zhuǎn)作用 用微量肉湯稀釋法[17]測定黏菌素及其添加外排泵抑制劑CCCP(終質(zhì)量濃度為5 mg/L)對隨機(jī)選擇的8株黏菌素耐藥沙門分離株的最小抑菌濃度(MIC)。以MHB肉湯、MHB肉湯+菌株、MHB肉湯+菌株+5 mg/LCCCP為對照。質(zhì)控菌株為大腸埃希菌ATCC25922。重復(fù)操作3次，藥敏結(jié)果判斷依據(jù)CLSI標(biāo)準(zhǔn)[17]：黏菌素MIC≥4 mg/L為耐藥，黏菌素MIC 2～4 mg/L為中介，黏菌素MIC<2 mg/L為敏感。

1.2.5 黏菌素的耐藥機(jī)制

1.2.5.1 質(zhì)粒介導(dǎo)的黏菌素耐藥基因mcr的檢測 以隨機(jī)選擇的8株黏菌素耐藥沙門菌基因組DNA為模板，參考文獻(xiàn)[7，18]的引物及反應(yīng)條件進(jìn)行PCR反應(yīng)和測序分析，檢測質(zhì)粒介導(dǎo)的黏菌素耐藥基因mcr1—mcr8。同時(shí)進(jìn)行8株沙門菌的全基因組測序：用基因組DNA提取試劑盒提取8株細(xì)菌的基因組DNA，操作步驟按照天根生化科技(北京)有限公司的提取試劑盒說明書方法進(jìn)行。提取的基因組DNA送安諾優(yōu)達(dá)基因科技(北京)有限公司進(jìn)行測序，采用二代測序平臺(tái)Illumina Hiseq X Ten進(jìn)行全基因組測序分析。使用FastQC進(jìn)行測序質(zhì)控，SPAdes進(jìn)行序列的拼接組裝，RAST(http://rast.nmpdr.org)進(jìn)行基因預(yù)測及功能注釋。對上述2種測序結(jié)果中的mcr序列與NCBI數(shù)據(jù)庫中的mcr序列進(jìn)行比對與分析。

1.2.5.2 染色體介導(dǎo)的耐藥機(jī)制分析 據(jù)上述測序結(jié)果，基于基因組學(xué)序列分析的方法，先將NCBI數(shù)據(jù)庫中收錄的鼠傷寒沙門菌標(biāo)準(zhǔn)株(CVCC?541)完整測序序列下載，并構(gòu)建本地?cái)?shù)據(jù)庫。再將雙組份信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)PhoPQ和PmrAB相關(guān)基因序列作為咨詢序列，與上述構(gòu)建好的本地?cái)?shù)據(jù)庫進(jìn)行比對分析。同時(shí)參照NCBI數(shù)據(jù)庫中已提交的基因序列合成引物，PCR擴(kuò)增phoP、phoQ、pmrA、pmrB、mgrB、pmrD和pmrC全基因序列，引物序列見表1。PCR產(chǎn)物送上海生工生物技術(shù)服務(wù)有限公司進(jìn)行測序分析。

表1 PhoPQ和PmrAB雙組份相關(guān)基因的引物序列

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株的分離與鑒定

221份病死雞肝臟樣品中有58份在SS培養(yǎng)基上長出半透明或不透明以及黑色的圓形菌落；58份樣品的侵襲基因invA(圖1)和16S rRNA中，有32份可以擴(kuò)增出與陽性對照片段大小一樣的特異性條帶。PCR產(chǎn)物測序結(jié)果利用DNA Star軟件與NCBI數(shù)據(jù)庫中的序列進(jìn)行比對，確定為沙門菌invA和16S rRNA基因序列。MALDI-TOF-MS鑒定結(jié)果經(jīng)軟件分析后，與數(shù)據(jù)庫中的沙門菌同源性達(dá)到98%以上。由以上結(jié)果可以判斷，58份疑似樣品分離的菌株中有32株為沙門菌。

M：DNA Marker 2 000；1—8：菌株樣品；9：陽性對照；10：陰性對照

2.2 CCCP對分離沙門菌菌株黏菌素耐藥性的逆轉(zhuǎn)作用

藥敏結(jié)果表明，32株沙門菌中共有19株對黏菌素耐藥，隨機(jī)挑選8株耐藥菌進(jìn)一步觀察了CCCP與黏菌素聯(lián)用的MIC(表2)。8株沙門分離株的編號(hào)為SH01—08。從表2可以看出，黏菌素對質(zhì)控菌 ATCC?25922的MIC在CLSI規(guī)定的范圍內(nèi)。加入外排泵抑制劑CCCP后，9株細(xì)菌對黏菌素的敏感性明顯增強(qiáng)，CCCP增強(qiáng)了黏菌素的抗菌活性，降低了黏菌素對不同耐藥機(jī)制菌株(mcr-1陽性、PhoPQ和PmrAB相關(guān)基因的突變)的MIC。4株mcr-1陽性菌株的MIC平均降低了1/832，4株mcr-1陰性菌株的MIC平均降低了1/1 920。CCCP能逆轉(zhuǎn)所有菌株對黏菌素的耐藥性，黏菌素耐藥率由100%降低到了0。對照試驗(yàn)表明，CCCP在5 mg/L質(zhì)量濃度下對細(xì)菌沒有抑制作用。

表2 分離沙門菌菌株加入CCCP前后的黏菌素MIC

2.3 黏菌素的耐藥機(jī)制

在8株隨機(jī)選擇的黏菌素耐藥沙門菌中，如圖2所示，有4株沙門菌可見與mcr-1陽性對照一致的309 bp的擴(kuò)增片段，未擴(kuò)增到其他亞型的黏菌素耐藥基因mcr2—mcr8。全基因組二代測序檢測mcr1—mcr8結(jié)果與PCR擴(kuò)增結(jié)果一致。對測序結(jié)果序列進(jìn)行比對和分析，結(jié)果顯示，所檢測的mcr-1序列與NCBI數(shù)據(jù)庫中的沙門菌mcr-1序列(GenBank:MN873698)同源性達(dá)到99%以上，確定為mcr-1陽性菌株。

M：DNA Marker 2 000；1—4：菌株樣品；5：陽性對照；6：陰性對照

8株沙門菌全基因組二代測序檢測mcr-1與雙組份信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)PhoPQ和PmrAB相關(guān)基因編碼的氨基酸突變見表3。mcr-1陽性菌株SH04,同時(shí)存在mgrB基因編碼的氨基酸Y31D突變。與鼠傷寒沙門菌標(biāo)準(zhǔn)株(CVCC?541)比較，4株mcr-1陰性菌株中，菌株SH02的pmrB蛋白有2處氨基酸突變，分別是R248P和E292K；mgrB蛋白提前1個(gè)色氨酸(W)終止翻譯。菌株SH03的pmrC蛋白有4處氨基酸突變：L77P、A159V、G232S、E415Q。菌株SH05的mgrB蛋白提前1個(gè)色氨酸(W)終止翻譯；同時(shí)pmrC蛋白的突變與菌株SH02相同。菌株SH07的mgrB蛋白有2處氨基酸突變：F44L、I58F。未發(fā)現(xiàn)phoP、phoQ、pmrA和pmrD中的氨基酸變異。PCR測序結(jié)果與全基因組二代測序結(jié)果一致。

表3 分離菌株全基因組測序中部分耐藥基因編碼的氨基酸突變結(jié)果

3 結(jié)論與討論

本研究表明，黏菌素對8株耐黏菌素的沙門菌分離菌株的MIC介于4～32 mg/L，黏菌素聯(lián)合CCCP后，與單藥相比MIC明顯下降(下降了1/4 096～1/256)。CCCP增強(qiáng)了耐藥菌對黏菌素的敏感性，逆轉(zhuǎn)了所有沙門菌的黏菌素耐藥性。黏菌素的耐藥機(jī)制結(jié)果顯示，8株耐黏菌素分離菌有4株為mcr-1陽性，其中，菌株SH04同時(shí)存在雙組份信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)PhoPQ和PmrAB相關(guān)基因突變(mgrB變異)；其余4株均為PhoPQ和PmrAB相關(guān)基因突變菌株。藥敏試驗(yàn)結(jié)果表明，CCCP對不同耐藥機(jī)制的沙門菌的黏菌素MIC的影響并無差異，對8株沙門菌黏菌素耐藥性均有逆轉(zhuǎn)作用。CCCP作為外排泵抑制劑時(shí)的質(zhì)量濃度一般在10～20 mg/L[11-13]，而本研究中10～20 mg/L的CCCP質(zhì)量濃度對于沙門菌有抑制作用，故本試驗(yàn)選用質(zhì)量濃度為5 mg/L，發(fā)現(xiàn)該質(zhì)量濃度下CCCP本身對沙門菌沒有抑制作用?？梢?，CCCP對黏菌素抗菌增強(qiáng)作用并不是由于其本身的抗菌活性，而是由于其抑制外排泵而發(fā)揮逆轉(zhuǎn)耐藥性的作用。

細(xì)菌的主動(dòng)外排系統(tǒng)是細(xì)菌產(chǎn)生多重耐藥的重要機(jī)制。外排泵系統(tǒng)已經(jīng)被報(bào)道在黏菌素耐藥中能夠發(fā)揮作用，如大腸桿菌中的AcrAB-TolC[19]和銅綠假單胞菌中的MexXY-OprM[8]。EPIs已經(jīng)用于評估外排泵系統(tǒng)的上調(diào)對黏菌素抗性的作用。EPI對粘菌素抗性的影響因EPI類型而異。PABN和1-(1-萘甲基)-哌嗪(NMP)是被認(rèn)為與AcrB作用位點(diǎn)中的藥物競爭起作用的EPI[20]，但是未能恢復(fù)對黏菌素耐藥的革蘭氏陰性菌的黏菌素敏感性[14,21]。然而，非特異性的EPIs CCCP和2，4-二硝基苯酚(DNP)在恢復(fù)黏菌素敏感性方面表現(xiàn)出良好的活性[14,21]。有研究表明，外排泵抑制劑CCCP能顯著降低黏菌素對多種革蘭氏陰性菌的MIC[13]。由于CCCP作用于外排泵的能量源-質(zhì)子動(dòng)力，并能調(diào)節(jié)膜內(nèi)其他蛋白質(zhì)的活性，因此很難確定CCCP發(fā)揮降低黏菌素抗性的機(jī)制。黏菌素是通過破壞陰性菌帶負(fù)電荷的外膜而降低細(xì)胞膜穩(wěn)定性，使細(xì)胞內(nèi)重要物質(zhì)外流產(chǎn)生殺菌作用[22]。因此，CCCP增強(qiáng)黏菌素抗菌活性并不是通過常規(guī)的降低細(xì)胞內(nèi)藥物外排、增加細(xì)胞內(nèi)濃度達(dá)到的，而是通過其他間接的機(jī)制來增加細(xì)菌對黏菌素敏感性。NI等[14]報(bào)道，CCCP對黏菌素活性的影響可能是由于細(xì)胞膜上負(fù)電荷的再生引起。PARK等[21]發(fā)現(xiàn)，CCCP引起的ATP生成減少可能是這些細(xì)胞中黏菌素活性增加的原因。為了更好地解釋這一機(jī)制的復(fù)雜作用原理，需要進(jìn)一步研究外排泵抑制黏菌素抗性的機(jī)制，特別是通過描述外排泵基因及其在不同耐藥機(jī)制的耐藥菌株中的表達(dá)。

本研究結(jié)果表明，CCCP對不同耐藥機(jī)制的耐黏菌素沙門菌的黏菌素MIC的影響并無差異，說明CCCP是一種增強(qiáng)黏菌素活性的廣譜增效劑。將抗生素與增強(qiáng)其活性的增效劑結(jié)合，是解決抗生素耐藥和耐藥菌感染的重要策略。合理聯(lián)合用藥對于增強(qiáng)療效、擴(kuò)大抗菌譜、減少用量、降低或避免不良反應(yīng)、減少或延緩耐藥菌株的產(chǎn)生都具有重要意義。本研究發(fā)現(xiàn)，CCCP能廣譜逆轉(zhuǎn)分離菌黏菌素的耐藥性，但CCCP由于安全性問題，尚不能臨床應(yīng)用。由于抑制外排泵能有效逆轉(zhuǎn)黏菌素耐藥性，故選用外排泵抑制劑與黏菌素聯(lián)合，是增強(qiáng)后者抗菌活性的有效措施，尋找新的有效且更安全的外排泵抑制劑，對克服黏菌素的耐藥性以及研制復(fù)方制劑、開發(fā)新型抗菌劑具有重要意義。