非洲豬瘟病毒p17蛋白單克隆抗體的制備與鑒定

白晶晶，宋歡歡，白晨雨，郝麗影，顏世君，杜萌萌，李向東，鄧均華，田克恭,

(1.洛陽普泰生物技術(shù)有限公司，河南 洛陽 471000；2.國家獸用藥品工程技術(shù)研究中心，河南 洛陽 471000)

非洲豬瘟(African swine fever,ASF)是由非洲豬瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)引起豬的一種急性、熱性、高度傳染性疾病[1-3]。該病病程短，死亡率高，對于養(yǎng)豬業(yè)是一種毀滅性疫病。世界動物衛(wèi)生組織(OIE)將其列為A類動物疫病，我國將此病歸為一類動物傳染病[4-5]，并將其作為重點防范的外來動物疫病。

我國于2018年8月在遼寧省沈陽市發(fā)現(xiàn)首例非洲豬瘟病例，隨后快速蔓延至全國，對我國養(yǎng)豬業(yè)構(gòu)成巨大的威脅。自ASFV發(fā)現(xiàn)以來，雖然在DNA疫苗、減毒疫苗、亞單位疫苗及病毒活載體疫苗方面的研究中取得了一定進展，但是這些疫苗僅對ASFV的感染產(chǎn)生有限的保護。此外，針對該病尚無有效的治療方法，一旦發(fā)病，死亡率可達100%。非洲豬瘟的防控主要依靠快速確診，及時隔離、撲殺、消毒、限制流通等手段來阻止疫情的傳播。因此，ASFV診斷檢測方法的研究刻不容緩。ASFV為有囊膜的二十面體對稱的雙股DNA病毒，平均直徑200 nm，結(jié)構(gòu)復(fù)雜?；蚪M約179～193 kb，含有150～167個開放閱讀框(Open reading frames,ORFs)，編碼150～200種蛋白質(zhì)，其中約50多種是病毒的結(jié)構(gòu)蛋白[6-8]。同時ASFV基因組還編碼DNA復(fù)制、基因轉(zhuǎn)錄和RNA修飾相關(guān)酶類，以及調(diào)節(jié)宿主細胞功能和參與病毒免疫逃逸的相關(guān)蛋白質(zhì)。p17蛋白是ASFV表達的晚期膜蛋白，由基因D117L編碼，該基因序列在病毒所有毒株中高度保守。p17蛋白與細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)有著固有的親和力，作為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的膜池蛋白，參與了病毒顆粒形態(tài)的構(gòu)成。抑制p17蛋白的表達，對結(jié)構(gòu)蛋白例如p72、p54或者多聚蛋白pp220的合成無明顯影響，但能阻礙pp220蛋白和pp62蛋白的酶解，從而影響病毒結(jié)構(gòu)的形成。通過電子顯微鏡觀察病毒感染后的細胞，在感染早期，病毒的衣殼蛋白和內(nèi)膜蛋白之間相互作用，會形成1個螺旋面的結(jié)構(gòu)，類似于1個不成熟的病毒顆粒，隨后在不同前體膜蛋白的作用下進而形成病毒成熟的二十面體結(jié)構(gòu)。p17蛋白不參與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)驅(qū)動的膜池的募集和修飾，但是p17蛋白的缺失，會影響前體膜的螺旋面的形成，并且阻礙病毒二十面體結(jié)構(gòu)形成的進程，進而使病毒變得不穩(wěn)定，并失去感染作用[9-11]。

單克隆抗體因具有特異性強、敏感性高的特點而被廣泛應(yīng)用于各種病原的免疫學(xué)檢測。p17蛋白是ASFV主要的編碼蛋白，鑒于此，利用桿狀病毒表達系統(tǒng)表達重組ASFV p17蛋白并制備單克隆抗體，以期為ASFV免疫類診斷試劑產(chǎn)品的開發(fā)提供重要的生物材料。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和質(zhì)粒 大腸桿菌(E.coli)Trans 5α感受態(tài)細胞購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；DH10Bac感受態(tài)細胞、pFastbac1桿狀病毒轉(zhuǎn)移載體等均由國家獸用藥品工程技術(shù)研究中心提供。

1.1.2 細胞及供試動物 昆蟲細胞sf9由國家獸用藥品工程技術(shù)研究中心保存；SP2/0骨髓瘤細胞由洛陽普泰生物技術(shù)有限公司保存；SPF級4周齡BALB/c小鼠、8～10周齡BALB/c經(jīng)產(chǎn)母鼠均購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司。

1.1.3 主要試劑BamHⅠ和HindⅢ限制性內(nèi)切酶及T4 DNA連接酶均購自賽默飛世爾科技公司；CellfectinⅡ轉(zhuǎn)染試劑盒、SF-900Ⅱ無血清培養(yǎng)基均購自上海Invitrogen公司；質(zhì)粒提取試劑盒和膠回收試劑盒均購自O(shè)mega公司；HisTrap 1 mL預(yù)裝柱、HiLoad 16/600 Superdex 200 pg分子篩預(yù)裝柱購自美國GE公司；Ni2+親和層析填料購自美國GE Healthcare公司；DNA分子量標(biāo)準(DL5000)購自TAKARA公司；預(yù)染蛋白質(zhì)分子質(zhì)量標(biāo)準物購自麥約爾生物技術(shù)有限公司；BCA法蛋白質(zhì)濃度測定試劑盒購自碧云天公司；ASFV標(biāo)準陽性血清、ASFV抗原板購自歐盟ASFV參考實驗室(EU Reference Laboratory for ASF,INIA-CISA)；RPMI-1640培養(yǎng)基購自Life Technologies公司；HRP標(biāo)記的羊抗豬IgG、HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG、弗氏完全佐劑、弗氏不完全佐劑、HAT混合鹽、HT混合鹽等均購自Sigma公司；FITC標(biāo)記的羊抗鼠IgG購自Thermo公司；無菌石蠟購自北京陸橋生物技術(shù)公司；小鼠單克隆抗體Ig類/亞類/亞型鑒定用ELISA試劑盒購自洛陽佰奧通實驗材料中心。

1.2 方法

1.2.1 p17重組蛋白的真核表達及鑒定

1.2.1.1p17基因合成 根據(jù)GenBank 中ASFV-SY18株基因組序列(登錄號：MH766894.1)，由上海生工生物工程有限公司合成p17基因序列，該基因編碼區(qū)全長354 bp，編碼117個氨基酸。

1.2.1.2p17基因引物設(shè)計及合成 根據(jù)合成的p17基因序列，用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計引物，并在上下游引物5′端引入酶切位點BamHⅠ和HindⅢ(下劃線)，同時通過下游引物在目的基因 C端引入6個His標(biāo)簽。利用引物Bac13F/Bac13R，對重組桿狀病毒質(zhì)粒進行PCR鑒定。引物由金唯智生物科技有限公司合成，序列如下：

p17-F:5′-CGCGGATCCATGGACACTGAAACATCTCCTCTGCTGTCACAC-3′；p17-R:5′-CCC-AAGCTTTTAGTGGTGGTGGTGGTGATGGTTGTTGGAGTGGGCCAGTTC-3′；Bac13-F:5′-GTTTTCCCAGTCACGAC-3′；Bac13-R:5′-CAGGAAACAGCTATGAC-3′。

1.2.1.3 重組質(zhì)粒pFastBac-p17的構(gòu)建 分別用BamHⅠ和HindⅢ限制性內(nèi)切酶酶切pFastbac1和p17基因片段，經(jīng)膠回收純化后用T4 DNA連接酶進行連接，轉(zhuǎn)化Trans 5α感受態(tài)細胞，涂布含有100 μg/mL的氨芐青霉素篩選平板，37 ℃培養(yǎng)過夜，挑取單克隆菌落，接種至含100 μg/ml氮芐青毒素的LB培養(yǎng)液中培養(yǎng)過夜。用質(zhì)粒提取試劑盒提取質(zhì)粒，經(jīng)酶切鑒定篩選陽性重組質(zhì)粒，由金唯智生物科技有限公司測序，將測序正確的重組質(zhì)粒命名為pFastBac-p17。

1.2.1.4 重組桿粒rBacmid-p17的構(gòu)建 根據(jù)Bac-to-Bac操作說明，將5 μL重組質(zhì)粒pFastBac-p17轉(zhuǎn)化到DH10Bac感受態(tài)細胞中。37 ℃條件下220 r/min擴大培養(yǎng)4 h。取出適量培養(yǎng)菌液涂布在含有卡那霉素、慶大霉素、四環(huán)素和X-Gal的LB篩選平板上。經(jīng)2次篩選，挑取確定白斑菌落接種至5 mL含卡那霉素、慶大霉素和四環(huán)素抗性的LB培養(yǎng)液中，37 ℃條件下220 r/min振蕩培養(yǎng)過夜，按Bac-to-Bac操作說明上的方法提取重組桿粒Bacmid，并用引物Bac13F/R進行PCR鑒定，將轉(zhuǎn)座成功的重組桿粒命名為rBacmid-p17。

1.2.1.5 重組桿狀病毒的制備 按照Cellfectin Ⅱ轉(zhuǎn)染試劑盒操作說明將重組桿粒rBacmid-p17轉(zhuǎn)染sf9昆蟲細胞,同時設(shè)置正常細胞作為陰性對照及感染野毒的sf9昆蟲細胞作為陽性對照。將細胞置于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)大約72 h，80%細胞出現(xiàn)病變后，收集細胞培養(yǎng)液上清，即為P1重組桿狀病毒。

1.2.1.6 重組蛋白ASFV p17的表達及檢測 用重組桿狀病毒感染sf9細胞，72 h出現(xiàn)80%細胞病變時，收集病變細胞和感染野毒sf9細胞，1 000×g離心10 min后棄去上清，留取細胞用細胞裂解液(25 mmol/L NaHCO3，pH值8.3)進行裂解，10 000×g離心 5 min后取上清，加入5×Loading Buffer，100 ℃加熱10 min制備樣品，用預(yù)制膠進行SDS-PAGE，Bio-Rad半干轉(zhuǎn)膜儀將膠上的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜上。用含5%脫脂奶粉的PBST溶液，37 ℃封閉1 h，加入1∶500稀釋的ASFV標(biāo)準陽性血清，37 ℃搖床孵育1 h，PBST溶液洗3次后，將羊抗豬IgG-HRP用PBST稀釋2 500倍，37 ℃孵育1 h，PBST溶液洗3次后，避光條件下進行顯色，觀察結(jié)果。

1.2.1.7 重組蛋白ASFV p17的純化 大量培養(yǎng)接種重組桿狀病毒的sf9昆蟲細胞，收集感染細胞，1 000×g離心10 min,棄上清，用細胞裂解液裂解細胞，4 ℃條件下10 000×g離心10 min獲得裂解上清，用Ni2+親和層析填料進行親和層析，最終目的產(chǎn)物以含500 mmol/L咪唑的洗脫液進行洗脫，將粗純獲得的重組蛋白用AKTA purifier全自動蛋白純化儀進行分子篩進一步純化，按峰收取蛋白質(zhì)，并進行SDS-PAGE鑒定[12]。

1.2.2 單克隆抗體制備與鑒定

1.2.2.1 小鼠免疫 選取4周齡BALB/c雌性小鼠，免疫p17蛋白，采用背部皮下多點注射方法，100 μg/只，第1次免疫使用弗氏完全佐劑與純化p17蛋白等體積混合乳化；第2次和第3次免疫用弗氏不完全佐劑與純化p17蛋白等體積混合乳化。每次免疫間隔21 d，共免疫3次。從第2次免疫開始，每次免疫后14 d采血，用間接ELISA方法檢測血清抗體效價。選擇抗體效價高的小鼠，在融合前3 d背部皮下多點注射不加佐劑的純化p17蛋白100 μg/只，進行加強免疫。

1.2.2.2 檢測p17抗體的間接ELISA方法 將純化的p17蛋白稀釋至0.5 μg/mL，加至酶標(biāo)板，100 μL/孔，2～8 ℃孵育20～24 h。洗板，按150 μL/孔加入封閉液，2～8 ℃孵育20～24 h。洗板后按100 μL/孔加入稀釋后的樣品，同時設(shè)置加PBS(0.01 mol/L，pH值7.4)的孔為陰性對照，37 ℃孵育1 h。洗板5次，按100 μL/孔加入1∶20 000倍稀釋的HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG，37 ℃孵育30 min。洗板5次，依次按50 μL/孔加入顯色劑A、B液，37 ℃顯色15 min；每孔50 μL加入2 mol/L 的H2SO4終止反應(yīng)，10 min內(nèi)用酶標(biāo)儀測定各孔OD450值。陰性對照OD450<0.2時，試驗成立；S/N(待檢樣品OD450/陰性對照OD450)≥2.1，判為陽性；S/N<2.1，判為陰性；以陽性孔對應(yīng)的樣品最高稀釋度，作為待檢樣品的效價[7]。

1.2.2.3 細胞融合及篩選 融合前1 d，收取健康小鼠的腹腔巨噬細胞鋪10塊96孔細胞板制備飼養(yǎng)層細胞。將SP2/0細胞和免疫后小鼠脾細胞按1∶10比例混合，用經(jīng)典PEG融合法制備雜交瘤細胞。采用間接ELISA方法來確定能夠產(chǎn)生抗體的雜交瘤細胞株。對篩選出的陽性雜交瘤細胞株用有限稀釋法進行亞克隆，直至陽性率為100%。將獲得的能夠穩(wěn)定分泌針對p17的特異性抗體的雜交瘤細胞株擴大培養(yǎng)并凍存。

1.2.2.4 單克隆抗體腹水的制備 取8～10周齡BALB/c經(jīng)產(chǎn)母鼠，每只腹腔注射0.5 mL液體石蠟，于10 d后每只小鼠腹腔注射濃度為30萬/mL的雜交瘤細胞0.5 mL，待小鼠腹部明顯膨大后，抽取腹水，10 000 r/min離心10 min，收集上清，-70 ℃以下凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2.5 單克隆抗體效價測定 將腹水作為一抗，HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG作為二抗，參照1.2.2.2中間接ELISA方法測定單克隆抗體的效價[13-14]。

1.2.2.6 單克隆抗體亞類鑒定 按照小鼠單克隆抗體Ig類/亞類/亞型鑒定用ELISA試劑盒說明書進行鑒定。

1.2.2.7 單克隆抗體間接免疫熒光(IFA)鑒定 將腹水作為一抗，F(xiàn)ITC標(biāo)記的羊抗鼠IgG作為二抗，使用商品化的ASFV抗原板對16株單克隆抗體進行IFA鑒定，以加PBS(0.01 mol/L，pH值7.4)的孔作為陰性對照。

2 結(jié)果與分析

2.1 p17基因的擴增及重組質(zhì)粒的構(gòu)建

用p17F/R引物以合成的p17基因為模板擴增出含酶切位點及His標(biāo)簽的p17基因，獲得大小約380 bp的目的片段(圖1A)。將目的片段通過BamHⅠ和HindⅢ酶切位點插入到pFastbac1中，用BamHⅠ和HindⅢ進行酶切鑒定。結(jié)果顯示，酶切出大約380 bp的目的基因帶和大約4 800 bp的載體條帶(圖1B)?？梢姡康幕蚺c載體的連接正確。經(jīng)測序鑒定分析，p17基因編碼框無誤，與載體連接正確。

M1、M2:DNA分子質(zhì)量標(biāo)準(DL5000);1:p17基因的PCR產(chǎn)物；2:pFastBac-p17雙酶切產(chǎn)物

2.2 重組桿粒Bacmid-p17的構(gòu)建和鑒定

根據(jù)Bac-to-Bac表達手冊，用Bac13F/R引物對重組桿粒rBacmid-p17進行PCR鑒定，出現(xiàn)大小約2 700 bp的擴增產(chǎn)物(圖2),說明p17基因已經(jīng)轉(zhuǎn)座到桿狀病毒載體上。

M:DNA分子質(zhì)量標(biāo)準(DL5000);1:用Bac13F/R引物鑒定rBacmid-P17的PCR產(chǎn)物

2.3 p17重組桿狀病毒的獲得

將重組桿粒rBacmid-p17轉(zhuǎn)染sf9細胞，72 h后觀察到細胞病變大于80%，表現(xiàn)為細胞直徑增加，生長停滯，細胞內(nèi)部出現(xiàn)顆粒體，收集細胞培養(yǎng)上清，即獲得重組桿狀病毒Ac-NPV-p17。

2.4 p17重組蛋白的表達鑒定

分別取感染野毒72 h的sf9細胞和感染Ac-NPV-p17 72 h的sf9細胞用細胞裂解液裂解，取上清用預(yù)制膠進行SDS-PAGE，轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜進行Western blot分析。經(jīng)ASFV陽性血清檢測，在22 ku處出現(xiàn)特異性條帶，與預(yù)期分子質(zhì)量大小一致(圖3)，表明重組蛋白呈可溶性胞內(nèi)表達。

M:預(yù)染蛋白質(zhì)分子質(zhì)量標(biāo)準;1:sf9感染野毒細胞裂解液上清; 2:sf9感染Ac-NPV-p17重組病毒細胞裂解液上清

2.5 p17重組蛋白的純化

用鎳柱對可溶性蛋白進行粗純后，用分子篩對從鎳柱上洗脫下來的蛋白質(zhì)開展進一步純化，最終獲得大小約22 ku的目的蛋白(圖4)。

M:預(yù)染蛋白質(zhì)分子質(zhì)量標(biāo)準;1:p17重組蛋白

2.6 p17蛋白免疫動物血清ELISA效價測定

采用1.2.2.1中所述免疫方法免疫6只BALB/c小鼠，三免后小鼠血清的ELISA效價最高為1∶2.048×106。

2.7 細胞融合及陽性克隆篩選

細胞融合后9～11 d，用1.2.2.2所述ELISA方法篩選出抗體陽性孔，陽性雜交瘤細胞株經(jīng)4次篩選和3次亞克隆后，獲得16株能夠穩(wěn)定分泌抗體的雜交瘤細胞株，分別命名為6H6、4D1、7E8、7H12、10H6、10F3、6E11、3D1、2F4、2B4、4B3、5F7、7H9、6C4、2F1、4H7，凍存后于液氮中保存。

2.8 ASFV p17單克隆抗體腹水的制備及效價測定

制備16株分泌p17蛋白單克隆抗體的雜交瘤細胞株的小鼠腹水，經(jīng)間接ELISA方法檢測，ELISA效價介于1∶2.560×106～1∶1.024×107。

2.9 ASFV p17單克隆抗體亞類鑒定

對16株ASFV p17單克隆抗體進行亞類鑒定，結(jié)果顯示，其中有6株單克隆抗體(6H6、4D1、7E8、3D1、2F4、2B4)的重鏈亞類均為IgG1，其余10株單克隆抗體(7H12、10H6、10F3、6E11、4B3、5F7、7H9、6C4、2F1、4H7)的重鏈亞類均為IgG2a，所有輕鏈亞類均為κ。

2.10 ASFV p17單克隆抗體IFA鑒定

用ASFV抗原對篩選出的16株單克隆抗體進行IFA檢測，結(jié)果顯示，有8株單克隆抗體能與ASFV發(fā)生特異性反應(yīng)。6E11與感染ASFV的細胞反應(yīng)，與正常細胞無反應(yīng)(圖5)。單克隆抗體6H6、4D1、7H12、10H6、10F3、4B3、5F7的IFA鑒定結(jié)果均與6E11呈現(xiàn)相同的特點。

A:陰性對照;B:單克隆抗體6E11與ASFV的IFA檢測結(jié)果

3 結(jié)論與討論

ASFV編碼蛋白的數(shù)量眾多，其中結(jié)構(gòu)蛋白作為病毒顆粒的主要組分，參與病毒的吸附、進入和復(fù)制等感染階段[15-18]。p17蛋白作為ASFV重要的內(nèi)囊膜蛋白，是病毒內(nèi)囊膜上的跨膜蛋白，該蛋白可促進病毒膜前體進一步組裝為二十面體中間體，以及增強病毒活力。當(dāng)p17蛋白表達受阻，將抑制pp220和pp62蛋白的水解[19-24]。研究表明，p17蛋白是重要的抗原蛋白，能夠用于ASFV的疫苗研究[9-10]。本研究以真核表達技術(shù)成功表達了可溶性的重組蛋白p17，通過Western blot方法檢測，p17蛋白與ASFV陽性血清具有反應(yīng)性，說明表達的p17蛋白具有良好的反應(yīng)原性。因此，利用重組蛋白p17免疫小鼠共制備了16株針對p17蛋白的單克隆抗體，以p17蛋白為抗原的間接ELISA方法檢測，效價均不低于1∶2.560×106。單克隆抗體亞型鑒定結(jié)果表明，16株單克隆抗體的重鏈亞型分別為IgG1、IgG2a，輕鏈亞型均為κ。IFA鑒定結(jié)果顯示，有8株單克隆抗體能特異性地識別ASFV。以p17蛋白為抗原的間接ELISA結(jié)果表明，制備的單克隆抗體是針對p17蛋白的特異性抗體，且效價較高。

綜上，本研究制備的ASFV p17蛋白單克隆抗體具有良好的反應(yīng)性，可以為ASFV p17蛋白結(jié)構(gòu)與功能等基礎(chǔ)研究，以及ASFV免疫類診斷試劑產(chǎn)品的開發(fā)提供重要的生物材料。