嗜鹽真菌多樣性及其抗腫瘤活性研究*

陳顯強(qiáng)，邢楠楠，黃亮華，高程海，羅小衛(wèi)，劉永宏**

(1.廣西中醫(yī)藥大學(xué)海洋藥物研究院，廣西南寧 530200；2.廣西中醫(yī)藥大學(xué),廣西中醫(yī)藥科學(xué)實(shí)驗(yàn)中心/廣西中醫(yī)基礎(chǔ)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西南寧 530200)

0 引言

癌癥是威脅人類健康的重大疾病。據(jù)統(tǒng)計(jì)，2018年全球有1 810萬新發(fā)癌癥病例和960萬癌癥死亡病例，中國分別約占23.7%和30%，相比其他國家，我國癌癥的發(fā)病率和死亡率最高[1],用于惡性腫瘤的醫(yī)療費(fèi)用每年超過2 200億，經(jīng)濟(jì)損失重大。隨著人口老齡化、工業(yè)化、城市化進(jìn)程的加劇以及生活方式改變等，中國的癌癥負(fù)擔(dān)仍會(huì)繼續(xù)增加[2]。因此，加強(qiáng)腫瘤防治相關(guān)研究，減少腫瘤的發(fā)病率和死亡率，有助于減輕癌癥負(fù)擔(dān)。

海洋真菌是海洋微生物的重要類群，因?yàn)樯钤诟邏?、高鹽、低溫(熱液口為高溫)、低光照、寡營養(yǎng)、低溶氧等獨(dú)特環(huán)境條件中，所以海洋真菌可產(chǎn)生具有特異、新穎、化學(xué)結(jié)構(gòu)多樣的次級(jí)代謝活性物質(zhì)，已成為化學(xué)和藥學(xué)等領(lǐng)域關(guān)注的焦點(diǎn)[3,4]。海洋真菌的代謝產(chǎn)物富含抗腫瘤、抗病毒、抗氧化、抗菌等活性物質(zhì)[5-9]，是藥物開發(fā)的重要資源庫[10]。朱偉明教授課題組多次報(bào)道海鹽田的嗜鹽真菌具有結(jié)構(gòu)新穎的代謝產(chǎn)物，并發(fā)現(xiàn)多個(gè)代謝產(chǎn)物對(duì)腫瘤細(xì)胞有細(xì)胞毒作用[11-14]。然而，細(xì)胞毒藥物也會(huì)對(duì)正常細(xì)胞產(chǎn)生毒性，有較大的毒副作用。靶向治療可以明顯減少毒副作用，是當(dāng)前癌癥治療研究的主流趨勢(shì)。成纖維細(xì)胞生長因子受體(Fibroblast Growth Factor Receptor,FGFR)過表達(dá)與腫瘤進(jìn)程密切相關(guān)，因此，靶向FGFR治療腫瘤成為臨床研究的熱點(diǎn)領(lǐng)域[15]。為進(jìn)一步探討嗜鹽真菌靶向FGFR抗腫瘤作用，本研究從海鹽田中分離嗜鹽真菌，并開展嗜鹽真菌發(fā)酵提取物的抑制腫瘤細(xì)胞增殖作用研究，發(fā)掘和評(píng)估靶向抗腫瘤的嗜鹽真菌資源，為今后全方面開展嗜鹽真菌代謝產(chǎn)物靶向FGFR抗腫瘤研究提供依據(jù)和基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品

于2019年5月在廣西北海竹林鹽場(chǎng)的海鹽田(21°44′N，109°27′E)采集樣品。采集的樣品放入無菌袋中，將無菌袋放入有冰袋的隔溫箱中帶回實(shí)驗(yàn)室，置于-20℃冰箱保存。

1.1.2 培養(yǎng)基

PDA液體培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，100 g海鹽，蒸餾水定容至1 000 mL，121℃滅菌20 min。固體培養(yǎng)基在此基礎(chǔ)上添加15 g瓊脂。

查氏固體培養(yǎng)基：硝酸鈉3 g，磷酸氫二鈉1 g，硫酸鎂0.5 g，氯化鉀0.5 g，硫酸亞鐵0.01 g，蔗糖30 g，瓊脂15 g，100 g海鹽，蒸餾水定容至1 000 mL，121℃滅菌20 min。

DMEM/F12(#10-092-CVR)培養(yǎng)基購自Corning Cellgro公司。

1.2 方法

1.2.1 真菌分離

取約2 g新鮮田泥樣品，加入2 mL無菌水，研磨混勻，即為樣品原液；再用無菌水依次稀釋制備10-2、10-3和10-4懸液，每個(gè)濃度懸液各取0.2 mL分別涂布于PDA固體培養(yǎng)基和查氏固體培養(yǎng)基中，置于25℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)14-30 d。第1周每天檢查1次，此后每3 d檢查1次，發(fā)現(xiàn)有菌絲長出時(shí)，將其轉(zhuǎn)接到另一新的平板上進(jìn)行三區(qū)劃線純化，如有雜菌則進(jìn)行二次純化或多次純化，直至得到單一純凈的菌落，記錄菌落數(shù)及菌落的形態(tài)特征。

1.2.2 真菌鑒定

采用Ezup柱式真菌基因組DNA抽提試劑盒(生工生物工程(上海)股份有限公司，SK8259)提取DNA，然后以ITS1和ITS4為引物，PCR梯度擴(kuò)增ITS基因序列；再用1%瓊脂糖凝膠電泳(150 V、100 mA、20 min)檢測(cè)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，并用Bio-RAD凝膠成像儀觀察電泳結(jié)果；檢驗(yàn)條帶合格后，采用SanPrep柱式DNAJ膠回收試劑盒(BBI，SK8131)純化回收DNA；所得膠回收產(chǎn)物委托生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行ITS rDNA測(cè)序分析；最后用DNA Star軟件整理測(cè)序結(jié)果，并利用BLAST數(shù)據(jù)庫比對(duì)ITS rDNA基因序列，從中選取相似性較高且是有效描述的典型菌株基因序列作為參比對(duì)象。

1.2.3 真菌發(fā)酵及代謝物提取

將對(duì)數(shù)生長期的菌株接種于1 L的錐形瓶中(10 mL/瓶)，每瓶含有300 mL PDA液體培養(yǎng)基，共3瓶，25℃靜止發(fā)酵30 d后收集菌絲體；用丙酮提取菌絲體，減壓回收丙酮得到提取物，再用乙酸乙酯萃取，減壓回收得到乙酸乙酯萃取物，低溫保存。

1.2.4 真菌代謝物抑制腫瘤細(xì)胞增殖活性檢測(cè)

取對(duì)數(shù)生長期的乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231和FGFR2過表達(dá)的乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231 (S252W)，用DMEM/F12培養(yǎng)基(含10% FBS)稀釋至密度為(3—5)×104個(gè)/mL，再分別接種至96孔板中，每孔100 μL，37℃孵育過夜。配置含5 mg/mL提取物的培養(yǎng)基，倍比稀釋10個(gè)濃度作為給藥濃度，并設(shè)定0.2%二甲基亞砜(DMSO)對(duì)照組(陰性對(duì)照)，設(shè)3個(gè)復(fù)孔。培養(yǎng)48 h后，每孔加入10 μL Cell Counting Kit-8 (CCK-8)試劑，置于37℃培養(yǎng)箱中放置 2 h。用微孔板酶標(biāo)儀讀數(shù)，測(cè)定波長為450 nm。抑制率(%)=[(OD對(duì)照-OD給藥)/OD對(duì)照]×100%。

1.2.5 真菌代謝物抑制FGFR2蛋白激酶活性檢測(cè)

用酶聯(lián)免疫吸附法(Enzyme-Linked Immunosorbent Assay,ELISA)[16]檢測(cè)真菌乙酸乙酯萃取物對(duì)FGFR2酪氨酸激酶酶活的抑制。以Poly (Glu,Tyr) 4∶1為反應(yīng)底物，將其包埋在酶標(biāo)板后，在酶標(biāo)板的對(duì)應(yīng)樣品孔加入1 μL待測(cè)試樣品(1 mg/mL)，相應(yīng)的陰性對(duì)照孔加DMSO，設(shè)5個(gè)復(fù)孔；每孔加上50 μL反應(yīng)緩沖液稀釋的FGFR2激酶(空白對(duì)照中用反應(yīng)緩沖液代替激酶溶液)；再加入5 μmol/L ATP溶液50 μL啟動(dòng)反應(yīng)，在37℃、100 r/min條件下反應(yīng)1 h；T-PBS洗板3次，加入抗體PY99，37℃下反應(yīng)0.5 h；無鉀PBS洗板3次，加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的抗鼠IgG，37℃下反應(yīng)0.5 h；最后通過鄰苯二胺(OPD)顯色(25℃避光反應(yīng))10 min，終止反應(yīng)，于490 nm波長測(cè)OD值，并按照以下公式計(jì)算抑制率：樣品的抑制率(%)=[1-(OD樣品-OD空白)/(OD陰性對(duì)照-OD空白)]×100%。

2 結(jié)果與分析

2.1 海鹽田的真菌多樣性分析

共分離得到26株菌，根據(jù)菌落形態(tài)特征差異進(jìn)行初步排重后，所得13株菌進(jìn)行ITS rRNA基因擴(kuò)增和序列分析?；贐LAST數(shù)據(jù)庫的比對(duì)結(jié)果(表1)，被測(cè)序菌株屬于11個(gè)不同種，分布于2綱2目3科4屬。青霉菌屬(Penicillium)為優(yōu)勢(shì)菌屬，含有6種，占分離種的54.54%，其次是曲霉屬(Aspergillus)菌株含有3種，鏈格胞菌屬(Alternaria)和附球菌屬(Epicoccum)各有1種。

表1 11種可培養(yǎng)真菌的物種組成

2.2 真菌發(fā)酵產(chǎn)物抗腫瘤活性分析

各個(gè)菌株發(fā)酵產(chǎn)物的乙酸乙酯萃取物抑制乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231和FGFR2過表達(dá)的乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231(S252W)增殖活性結(jié)果如表2所示，可知菌株E.sorghinum(編號(hào)GXIMD02001)的提取物對(duì)FGFR2過表達(dá)的乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231(S252W)有較強(qiáng)的抑制，其半抑制濃度(Half Maximal Inhibitory Concentration，IC50)為11.02 μg/mL，而對(duì)乳腺細(xì)胞MDA-MB-231幾乎沒有抑制活性(IC50為1 348 μg/mL)。該實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明真菌E.sorghinum(編號(hào)GXIMD02001)可能是通過靶向FGFR2發(fā)揮抗腫瘤作用。其他菌株提取物對(duì)FGFR2過表達(dá)和未過表達(dá)的乳腺癌細(xì)胞增殖抑制活性未顯示差異。兩株真菌A.versicolor(編號(hào)GXIMD02004)和P.citrinum(編號(hào)GXIMD02009)對(duì)乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231(S252W)和MDA-MB-231的IC50為11.94-16.41 μg/mL，具有較顯著抗腫瘤活性作用。5株真菌P.oxalicum(編號(hào)GXIMD02005)、P.janthinellum(編號(hào)GXIMD02006)、P.oxalicum(編號(hào)GXIMD02008)、A.alternata(編號(hào)GXIMD02011)和P.meleagrinum(編號(hào)GXIMD02013)具有較弱的抗乳腺癌作用，IC50為219.2-449.7 μg/mL。

表2 不同真菌的提取物抑制腫瘤細(xì)胞增殖活性

2.3 FGFR2蛋白激酶抑制活性分析

用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測(cè)菌株E.sorghinum(編號(hào)GXIMD02001)發(fā)酵產(chǎn)物的乙酸乙酯萃取物，在1 mg/mL濃度下對(duì)FGFR2激酶的抑制活性，結(jié)果其抑制率為91.5%。該結(jié)果從酶水平進(jìn)一步證明菌株E.sorghinum(編號(hào)GXIMD02001)是通過靶向FGFR2發(fā)揮抗腫瘤作用。

3 討論

FGFR是酪氨酸激酶家族重要成員之一，是一類單跨膜糖蛋白分子，主要包括FGFR1、FGFR2、FGFR3和FGFR4 4種亞型，由于FGFR基因突變和擴(kuò)增導(dǎo)致FGFR蛋白激酶過表達(dá)，F(xiàn)GFR持續(xù)激活從而誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞增殖、侵襲和遷移，促進(jìn)血管生成以及腫瘤的發(fā)生發(fā)展[17]。FGFR2過表達(dá)能夠激活下游關(guān)鍵的信號(hào)通路，與乳腺癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[18]。

已上市和臨床在研的FGFR小分子抑制劑可分為多靶點(diǎn)抑制劑與選擇性FGFR抑制劑。多靶點(diǎn)抑制劑如已上市藥物Ponatinib、Nintedanib、Dovitinib和Lenvatinib均靶向于FGFR、VEGFR和PDGFR等多個(gè)激酶靶點(diǎn)[19-22]。這些多靶點(diǎn)FGFR抑制劑存在嚴(yán)重的毒副作用，主要是因其抑制VEGFR而引起高血壓、蛋白尿、胃腸病變和皮膚反應(yīng)等[23]。與多靶點(diǎn)FGFR抑制劑相比較，選擇性FGFR抑制劑更加選擇性地靶向抑制FGFR，利于療效的發(fā)揮，規(guī)避多靶點(diǎn)FGFR抑制劑的毒性反應(yīng)，更符合當(dāng)下精準(zhǔn)醫(yī)療的個(gè)性化用藥的需求。2019年美國FDA加速批準(zhǔn)的Pan-FGFR抑制劑Erdafitinib,可用于治療局部晚期或轉(zhuǎn)移性膀胱癌，是首個(gè)獲批上市的選擇性FGFR抑制劑[24]。目前，僅有少量選擇性FGFR抑制劑進(jìn)入臨床研究，包括3個(gè)臨床三期(TAS-120、NVP-BGJ398和AZD4547)，1個(gè)臨床二期和4個(gè)臨床一期[25]。

本研究從北部灣海洋高鹽環(huán)境中發(fā)現(xiàn)若干株具有抗腫瘤活性的真菌，其中，真菌E.sorghinum(編號(hào)GXIMD02001)對(duì)FGFR2過表達(dá)乳腺癌細(xì)胞有抑制增殖作用，并在酶水平上進(jìn)一步驗(yàn)證其可能靶向FGFR2蛋白激酶發(fā)揮抗腫瘤作用，是首次報(bào)道海洋真菌靶向FGFR2抗腫瘤作用，對(duì)后續(xù)靶向抗腫瘤活性分子的挖掘具有重要的意義。然而，目前的研究對(duì)象是提取物，其具體的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)還不清楚，需要借助多學(xué)科交叉技術(shù)，結(jié)合化學(xué)信息和生物活性評(píng)價(jià)，充分闡明其靶向FGFR2抗腫瘤藥效的物質(zhì)基礎(chǔ)。深入研究這些菌株的代謝產(chǎn)物將有利于北部灣海洋藥用資源的開發(fā)和利用，有助于抗腫瘤先導(dǎo)化合物的發(fā)現(xiàn)，幫助人類對(duì)抗惡性腫瘤的威脅以及減輕經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。

4 結(jié)論

本研究從高鹽環(huán)境中共分離得到26株嗜鹽真菌，經(jīng)初步排重后獲得13株菌，分子鑒定結(jié)果顯示隸屬于3科4屬11種，其中青霉菌屬菌株(Penicillium)為優(yōu)勢(shì)菌群。真菌E.sorghinum(編號(hào)GXIMD02001)靶向FGFR2發(fā)揮抗腫瘤作用，這是首次報(bào)道海洋真菌具有靶向FGFR2抗腫瘤作用。真菌A.versicolor(編號(hào)GXIMD02004)和P.citrinum(編號(hào)GXIMD02009)顯著抑制乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231和MDA-MB-231(S252W)增殖。5株真菌P.oxalicum(編號(hào)GXIMD02005)、P.janthinellum(編號(hào)GXIMD02006)、P.oxalicum(編號(hào)GXIMD02008)、A.alternata(編號(hào)GXIMD02011)和P.meleagrinum(編號(hào)GXIMD02013)具有較弱的抗乳腺癌作用。本研究為北部灣海洋微生資源的抗腫瘤藥物開發(fā)利用奠定基礎(chǔ)。