循環(huán)腫瘤細胞檢測及其在膀胱癌中應(yīng)用的研究進展

郭俊濤，徐卓群

南京醫(yī)科大學(xué)附屬無錫市人民醫(yī)院，江蘇無錫214023

膀胱癌是泌尿系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤。據(jù)統(tǒng)計，2015年我國膀胱癌的發(fā)病率為5.80/10萬，居全身惡性腫瘤的第13 位［1］。在組織學(xué)類型上，90%以上的膀胱癌為移行細胞癌，其中70%～80%在臨床上表現(xiàn)為非肌層浸潤性膀胱癌（NMIBC）。目前，NMIBC 的標(biāo)準(zhǔn)治療方法是經(jīng)尿道膀胱腫瘤切除術(shù)再配合術(shù)后膀胱內(nèi)灌注化療。有研究報道，NMIBC標(biāo)準(zhǔn)治療后的復(fù)發(fā)率為50%～70%，其中約15%的復(fù)發(fā)患者在5 年內(nèi)進展為肌層浸潤性膀胱癌（MIBC）［2］。此外，接近1/3 的膀胱癌患者在初診時已進展至MIBC。目前，根治性膀胱切除術(shù)加雙側(cè)盆腔淋巴結(jié)清掃是MIBC 的標(biāo)準(zhǔn)治療方案。有文獻報道，約50%的MIBC患者在標(biāo)準(zhǔn)治療后5年內(nèi)發(fā)生轉(zhuǎn)移［3］。無論是NMIBC還是MIBC，其高復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的特性始終是臨床亟待解決的一大難題。早發(fā)現(xiàn)、早治療是獲得最佳預(yù)后的關(guān)鍵。目前，腫瘤的常規(guī)檢查方法主要為影像學(xué)檢查，然而腫瘤轉(zhuǎn)移早期發(fā)生在細胞水平上，即使現(xiàn)今的高分辨率成像設(shè)備也無法發(fā)現(xiàn)。因此，需要探索新的技術(shù)從細胞水平上評估腫瘤的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移。近年來，循環(huán)腫瘤細胞（CTCs）檢測作為液體活檢技術(shù)的一種，在腫瘤的診斷、治療和預(yù)后評估中展現(xiàn)出了巨大潛力。CTCs 是存在于外周血中的各類腫瘤細胞的統(tǒng)稱，能夠反映機體的腫瘤負荷。但CTCs在循環(huán)系統(tǒng)中的數(shù)量較少，為了使檢測的靈敏度達到臨床可接受的水平，國內(nèi)外通常采取先富集再檢測。RINK 等［4］研究證實，CTCs陽性的膀胱癌患者疾病進展和預(yù)后不良的風(fēng)險明顯增加。本文結(jié)合文獻就CTCs 的生物學(xué)特性、檢測方法以及在膀胱癌中CTCs 檢測的臨床意義作一綜述。

1 CTCs概述

CTCs 是指自發(fā)或因診療操作由實體瘤或轉(zhuǎn)移灶釋放進入外周血循環(huán)的所有腫瘤細胞的統(tǒng)稱，是絕大多數(shù)惡性腫瘤患者術(shù)后復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵所在。CTCs 依據(jù)其標(biāo)志物表達情況分為上皮細胞表型、間質(zhì)細胞表型和上皮間質(zhì)細胞混合表型三大類。CTCs 的概念最早可追溯至1896 年，澳大利亞學(xué)者ASHWORTH 在1 例轉(zhuǎn)移性腫瘤患者血液中偶然發(fā)現(xiàn)了少量游離腫瘤細胞，其生物學(xué)特性與原發(fā)灶或轉(zhuǎn)移灶腫瘤細胞類似，由此提出了CTCs 的概念。近年隨著對腫瘤生物學(xué)行為的進一步研究，目前普遍認為血行轉(zhuǎn)移可能是腫瘤遠處轉(zhuǎn)移的主要途徑。腫瘤細胞首先從原發(fā)灶脫落，侵入血管或淋巴管，其血管內(nèi)侵犯可以是主動的也可以是被動的，這取決于腫瘤類型、腫瘤微環(huán)境和血管完整性。腫瘤細胞可通過上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化獲得較高的侵襲和遷移能力主動侵犯血管，也可通過受損的血管系統(tǒng)被動入侵循環(huán)系統(tǒng)。一旦進入循環(huán)系統(tǒng)，腫瘤細胞暴露在血流的剪切應(yīng)力中，再加上脫落凋亡和免疫監(jiān)測的作用，大部分進入循環(huán)系統(tǒng)的腫瘤細胞在短期內(nèi)即被清除，但仍有少部分腫瘤細胞在循環(huán)系統(tǒng)中存活下來形成所謂的CTCs。當(dāng)CTCs 被遠處器官捕獲后，則以播散性腫瘤細胞（DTC）的形式滯留在遠處器官，最終形成轉(zhuǎn)移灶［5］。由此可見，CTCs 在腫瘤轉(zhuǎn)移過程中具有關(guān)鍵作用。

在循環(huán)系統(tǒng)中的物理因素和機體自身免疫系統(tǒng)的監(jiān)視下，循環(huán)系統(tǒng)中的CTCs 能夠被快速清除，僅有少數(shù)CTCs 存活下來。因此，循環(huán)系統(tǒng)中的CTCs數(shù)量非常少，每10 mL 血液中僅有1～10 個，它們以單個細胞或細胞簇的形式存在。由于CTCs 簇可以更快地滲出，故其在循環(huán)系統(tǒng)中的半衰期為6～10 min，而單個CTCs 為25～30 min［6］。CTCs 簇的轉(zhuǎn)移潛能是單個CTCs 的23～50 倍，這可能與CTCs 簇更有利于腫瘤細胞存活有關(guān)。此外，CTCs還可與血液成分之間通過特殊的作用機制對血流剪切應(yīng)力和免疫攻擊起到屏蔽作用，并促進其外滲和黏附，這對CTCs的存活和遷移至關(guān)重要［7］。

2 CTCs檢測

循環(huán)系統(tǒng)中的CTCs含量極低。據(jù)報道，腫瘤患者外周血中CTCs 的數(shù)量每毫升不足1 個［8］，遠低于血細胞數(shù)量，這為CTCs的檢測帶來了極大困難。為了提高檢測效率和準(zhǔn)確度，通常對血液樣本中的CTCs先富集再檢測。

2.1 CTCs 分離、富集 富集的目的是增加樣本中CTCs 的百分比。目前，主要通過CTCs 的生物特性和物理特性進行富集。生物特性富集法是通過識別CTCs 表面的特異性生物標(biāo)志物從而對CTCs 分離、富集。物理特性富集法主要是根據(jù)CTCs 的固有物理特性，包括細胞大小、密度、介電性能及力學(xué)特性等，對CTCs進行分離、富集。

2.1.1 生物特性富集法 生物特性富集法可進一步細分為兩類，一類是正向捕獲CTCs，被稱為陽性富集法，一類是負向去除白細胞，被稱為陰性富集法。陽性富集法也稱直接富集法，是利用免疫特性直接特異性靶向CTCs，依據(jù)CTCs 亞型不同，可以靶向的靶點主要有上皮細胞表型標(biāo)志物、間質(zhì)細胞表型標(biāo)志物和上皮間質(zhì)細胞混合表型標(biāo)志物。CTCs陽性富集法最常用的上皮細胞表型標(biāo)志物為上皮細胞黏附分子（EpCMA）。陰性富集法也稱間接富集法，與陽性富集法相反，其免疫靶向外周血細胞，通過去除靶向細胞間接富集CTCs，通常用于識別的白細胞標(biāo)志物有CD45、CD14。

2.1.1.1 免疫磁性分離法 免疫磁性分離技術(shù)是利用免疫捕獲原理，將特異性抗體與分離磁珠相互錨定，通過特異性免疫捕獲靶細胞，隨后通過磁場與磁珠的相互作用，將捕獲的靶細胞進行分離、富集的過程。CellSearch 系統(tǒng)是目前免疫磁性分離技術(shù)最具代表性的應(yīng)用，是第一個被美國食品和藥物管理局批準(zhǔn)用于臨床CTCs 檢測的儀器。PO 等［9］利用免疫磁性分離法對黑色素瘤患者血液樣本進行CTCs檢測，其在Ⅳ期黑色素瘤患者中的檢出率高達87.5%。然而，CellSearch 系統(tǒng)僅能單一捕獲EpCMA 陽性的CTCs，容易遺漏EpCMA 陰性的CTCs和間質(zhì)細胞表型的CTCs，富集效率和富集純度相對較低，并存在富集細胞活性降低等不足。

2.1.1.2 微流控芯片技術(shù) 微流控是一門通過微管道對微小流體進行處理或操縱的技術(shù)，目前被廣泛用于CTCs 的富集。微流控芯片技術(shù)通過在微管道上修飾能夠靶向CTCs或白細胞的特異性抗體，實現(xiàn)對流經(jīng)芯片的血流中的CTCs 進行陽性捕獲或陰性富集。與傳統(tǒng)的免疫磁珠分離技術(shù)相比，作為一門新興技術(shù)，微流控芯片技術(shù)在CTCs的富集中呈現(xiàn)出微型化、自動化、高通量等優(yōu)點。此外，在單細胞分析方面，微流控芯片技術(shù)可對富集的CTCs進行高通量分散操控，在低樣品量的檢測中更具優(yōu)勢。PEI等［10］設(shè)計的環(huán)形微通道可對CTCs免標(biāo)記富集，并通過連續(xù)單細胞表型分析對CTCs自動分類，其富集純度可高達92%。

2.1.2 物理特性富集法 物理特性富集法是根據(jù)CTCs 的物理性質(zhì)對CTCs 進行富集，該技術(shù)不依賴于生物標(biāo)志物的表達，分離的細胞完整，存活率高，可用于進一步的體外鑒定和試驗，同時濃縮時間短、成本低。但該技術(shù)的特異度低，后續(xù)需要進行純度分析。

2.1.2.1 密度梯度離心法 由于CTCs的密度普遍小于血細胞，通過兩者沉降率的差異，在離心狀態(tài)下可將其分離至相應(yīng)梯度。AccuCyte系統(tǒng)是一種先進的密度梯度分離儀器，具有分離與收集裝置［11］。AccuCyte 系統(tǒng)收集的樣本可直接用于鏡檢，不需要進行額外的洗滌步驟，減少了CTCs的流失。密度梯度離心法雖然操作簡單，但該技術(shù)的靈敏度低，所需的樣本量較大。

2.1.2.2 濾膜富集法 CTCs 的直徑一般為10～25 μm，較正常白細胞大，利用兩者大小差異，通過濾膜可直接富集CTCs，其富集效率一般高于密度梯度離心法。濾膜富集法常用的濾膜材料有聚碳酸酯、聚對二甲苯等［12］。濾膜富集法與微流控芯片技術(shù)聯(lián)用能夠明顯提高捕獲效率。

2.1.2.3 雙向電泳—場分離法 雙向電泳—場分離法是利用CTCs 與血細胞的介電性質(zhì)差異，在一定強度的電場中可分離出不同的運動軌跡，從而對CTCs 進行分離、富集。該技術(shù)具有敏感度高、特異度強的優(yōu)點，但存在耗時較長、通量不足等缺點。ZHENG 等［13］基于雙向電泳原理，通過調(diào)制微電極的電信號對單個細胞的靈活移動和定位，可實現(xiàn)單一CTCs 的分離，這為多點操作提供了技術(shù)平臺。

2.2 CTCs 識別、鑒定 CTCs 的分離、富集可大幅降低樣本背景中的血細胞含量，有利于進一步識別和鑒定。CTCs的識別、鑒定技術(shù)根據(jù)檢測靶點不同可大致分為細胞計數(shù)法和核酸檢測法。目前，常用的細胞計數(shù)法有免疫細胞化學(xué)法（ICC）和流式細胞術(shù)（FCM），常用的核酸檢測法有逆轉(zhuǎn)錄—聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）和熒光原位雜交（FISH）。

2.2.1 ICC ICC 是在抗原—抗體特異性結(jié)合的免疫學(xué)原理基礎(chǔ)上，通過化學(xué)反應(yīng)使標(biāo)記抗體的顯色劑顯色來實現(xiàn)定位和定性的技術(shù)，在具有免疫反應(yīng)特異性的同時還兼具組織化學(xué)的客觀性，該法簡單、高效，目前在CTCs 檢測中廣泛應(yīng)用。CTCs 常用的認定標(biāo)準(zhǔn)為EpCAM（+）CK（+）CD45（-）DAPI（+），但由于CTCs的表面標(biāo)志物存在差異表達，其敏感度還有待于進一步提高［14］。

2.2.2 FCM FCM 是基于免疫結(jié)合原理，利用流式細胞儀對細胞進行高效分析、分選的一門技術(shù)。FCM能夠?qū)TCs進行定量檢測，具有較高的準(zhǔn)確度和靈敏度，然而無法在細胞形態(tài)學(xué)上確認腫瘤細胞。光流控流式細胞儀集成了多級微流控芯片技術(shù)和四色熒光檢測系統(tǒng)，能夠自動完成CTCs 分離、富集，然后進行微通道三維聚焦和單細胞表型分析，其回收率大于95%［15］。

2.2.3 RT-PCR RT-PCR 先通過逆轉(zhuǎn)錄酶轉(zhuǎn)錄出待檢mRNA 的互補DNA（cDNA），然后以cDNA 為模板進行PCR 擴增，具有較高的敏感度。目前，CTCs能夠用于RT-PCR 檢測的mRNA 特異性標(biāo)志物有CK、EGFR 等［16］。但該技術(shù)需要破壞細胞，因而無法進行細胞形態(tài)學(xué)觀察。

2.2.4 FISH FISH 是基于堿基互補配對原理，利用熒光素標(biāo)記的核酸探針與待測樣本的特異核酸序列雜交進行定性、定量或相對定位的分析技術(shù)。趙麗華等［17］通過陰性富集聯(lián)合FISH 的方法對乳腺癌患者進行CTCs檢測，其檢出率可達到67.6%。

3 CTCs 檢測在膀胱癌診斷、治療和預(yù)后判斷中的應(yīng)用

目前，對惡性腫瘤的治療決策主要取決于原發(fā)腫瘤的特征和轉(zhuǎn)移潛能的評估。大多數(shù)情況下，臨床醫(yī)師只能獲取有限的腫瘤信息，確定潛在的驅(qū)動因素并消除這些因素，需要對原發(fā)腫瘤、復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移灶進行全面評估。遠處轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致惡性腫瘤相關(guān)死亡的主要原因，在原發(fā)腫瘤切除后，DTC和微轉(zhuǎn)移灶在引起疾病復(fù)發(fā)之前可保持很長一段時間的休眠狀態(tài)，被稱為微小殘留病灶。目前的影像技術(shù)尚無法檢測到DTC，而液體活檢技術(shù)能夠提取并檢測到血液中的腫瘤細胞，如CTCs、cfDNA、cfRNA、miRNA 和外泌體等，從而提示微小殘留病灶存在。近年來已有不少泌尿外科醫(yī)師致力于膀胱癌CTCs的檢測，試圖尋找一個非侵入性的血清標(biāo)志物，從而協(xié)助膀胱癌的診斷、治療和預(yù)后判斷。

3.1 CTCs 在膀胱癌診斷中的應(yīng)用 膀胱癌診斷的金標(biāo)準(zhǔn)是膀胱鏡活檢病理學(xué)檢查或診斷性經(jīng)尿道電切術(shù)，但均具有侵入性、費用高等缺點。尿細胞學(xué)檢查作為膀胱癌診斷的輔助性檢查，與腫瘤細胞的分化程度密切相關(guān)，其敏感度為13%～75%。MSAOUEL 等［18］的一項薈萃分析報道，CTCs 檢測診斷膀胱癌的敏感度為35.1%、特異度為89.4%。目前，對膀胱癌的早期診斷尚無可靠的血清標(biāo)志物，但隨著CTCs檢測方法不斷進步和完善，有望進一步提高其診斷膀胱癌的敏感度和特異度，從而輔助用于膀胱癌的早期篩查。

3.2 CTCs 在膀胱癌治療中的應(yīng)用 臨床研究表明，MIBC 患者術(shù)前行以順鉑為基礎(chǔ)的新輔助化療，能夠顯著提高腫瘤的完全反應(yīng)率，從而延長患者總生存期。但由于順鉑等化療藥物對腎臟具有一定毒性作用，臨床上以順鉑為基礎(chǔ)的新輔助化療只適用于約50%的MIBC 患者，且很難區(qū)分治療獲益患者。研究表明，CTCs是決定膀胱癌患者外科手術(shù)前是否需要新輔助化療的潛在生物標(biāo)志物［19］。

經(jīng)尿道膀胱腫瘤切除術(shù)（TURBT）是NMIBC 的首選治療方式。對于部分無法行膀胱切除術(shù)的T2期膀胱癌患者，TURBT 是一種替代選擇。有研究認為，TURBT 通常會切穿腫瘤，使腫瘤細胞在膀胱內(nèi)擴 散，從 而 引 起CTCs 的 全 身 播 散［20］。ENGIL?BERTSSON 等［21］檢 測 了 下 腔 靜 脈 中TURBT 前 后CTCs 的數(shù)目變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)86%膀胱癌患者CTCs數(shù)目在手術(shù)過程中增加，并且MIBC 患者比NMIBC患者術(shù)后增加更多。由此可見，治療期間監(jiān)測CTCs數(shù)目變化可用于膀胱癌療效評估。

3.3 CTCs 在膀胱癌預(yù)后判斷中的作用 膀胱癌具有易復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的特性，目前亟需可靠的生物標(biāo)志物對膀胱癌患者預(yù)后進行危險分層，從而指導(dǎo)臨床治療。GAZZANIGA 等［22］納入102 例初診高危NMIBC（T1G3期）患者，結(jié)果發(fā)現(xiàn)CTCs 陽性患者首次復(fù)發(fā)時間、進展時間和無轉(zhuǎn)移時間均較CTCs陰性患者明顯縮短。BUSETTO 等［23］在對155例T1G3期膀胱癌患者進行CTCs檢測時亦發(fā)現(xiàn)了類似結(jié)果。

由于CTCs存在不同亞型，各亞型間具有明顯的異 質(zhì) 性。NICOLAZZO 等［24］觀 察 了54 例T1G3期NMIBC 患者腫瘤組織和CTCs 中Survivin 表達，并對這些患者進行了長達108個月的隨訪，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，基線水平Survivin 在腫瘤組織和CTCs 中的檢出率相當(dāng)，但CTCs 陽性患者無疾病生存期較CTCs 陰性患者明顯縮短，并且在CTCs 陽性患者中Survivin 高表達者無疾病生存期比Survivin 低表達者明顯縮短。結(jié)果表明NMIBC 患者Survivin-CTCs 陽性者預(yù)后更差。

大多數(shù)膀胱癌患者在組織病理學(xué)上為膀胱尿路上皮癌，但10%～25% 患者存在組織學(xué)變異。SOAVE等［25］納入了188例接受根治性膀胱切除術(shù)和雙側(cè)盆腔淋巴結(jié)切除術(shù)的膀胱癌患者，在42例患者中檢測到CTCs，其中膀胱尿路上皮癌30 例、膀胱非尿路上皮癌12 例，并發(fā)現(xiàn)CTCs 陽性與手術(shù)切緣陽性、淋巴或血管侵犯和輔助化療有關(guān)，但無論是膀胱尿路上皮癌還膀胱非尿路上皮癌中CTCs 陽性均與無復(fù)發(fā)生存期或腫瘤特異性生存期無明顯相關(guān)性。

近年來，隨著CTCs 檢測技術(shù)不斷發(fā)展，其在膀胱癌中的臨床應(yīng)用取得了巨大進展。與傳統(tǒng)的膀胱鏡活檢相比，作為液體活檢技術(shù)的CTCs能夠提供疾病負擔(dān)、腫瘤組織分化和腫瘤異質(zhì)性等實時信息，具有無創(chuàng)、方便、可重復(fù)操作等優(yōu)點。CTCs 檢測能夠提示膀胱癌的化療反應(yīng)，有助于新輔助化療或輔助化療方案的選擇，避免過度化療帶來的額外傷害。另外，CTCs 檢測還可用于膀胱癌療效判斷，有助于指導(dǎo)臨床治療方案決策；CTCs 的異質(zhì)性還有助于探索膀胱癌新的治療靶點，為實現(xiàn)個體化治療提供依據(jù)。但目前CTCs的檢測方法還不夠完善，亟需發(fā)展一套更加靈敏、特異、快速、有效的檢測系統(tǒng)，以促進CTCs 檢測在膀胱癌臨床診斷和個體化治療中的應(yīng)用。