貴州泡菜中乳酸菌的分離鑒定及其在泡菜發(fā)酵中的應(yīng)用

趙山山，楊園園，周玉巖，劉貴巧，郝光飛

（1.河北工程大學(xué)生命科學(xué)與食品工程學(xué)院，河北邯鄲 056038；2.河北省藥品檢驗(yàn)研究院，河北石家莊 050011）

泡菜又稱為腌漬菜，是利用新鮮蔬菜為原料添加八角、花椒、鹽等輔料，經(jīng)乳酸菌為主的多種微生物發(fā)酵制成的傳統(tǒng)美食。蔬菜經(jīng)過乳酸菌主導(dǎo)的厭氧發(fā)酵改善了蔬菜的風(fēng)味，延長了蔬菜的貯藏期[1-2]。發(fā)酵過程中還產(chǎn)生了醇、醛、酮、烯和酯等風(fēng)味物質(zhì)，賦予了泡菜獨(dú)特的風(fēng)味[3]。泡菜中除了蔬菜中的營養(yǎng)成分外，還有發(fā)酵過程乳酸菌產(chǎn)生的有機(jī)酸和蛋白酶等物質(zhì)，具有促進(jìn)腸道蠕動(dòng)，幫助人體消化，降低膽固醇，以及調(diào)節(jié)生理機(jī)能等保健功效[4-6]。泡菜以其獨(dú)特風(fēng)味和多種保健功效成為人們餐桌上必不可少的菜肴。

傳統(tǒng)自然發(fā)酵方式發(fā)酵周期相對(duì)較長，生產(chǎn)效率低，食品安全問題難控制，難以實(shí)現(xiàn)大規(guī)模的工業(yè)化生產(chǎn)。針對(duì)這些問題國內(nèi)外研究者對(duì)泡菜發(fā)酵過程中起主要作用的微生物菌群進(jìn)行了研究。葉陵等[7]研究發(fā)現(xiàn)，乳桿菌屬（Lactobacillus）是促使泡菜發(fā)酵成熟的主要菌群，主要包括植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）、干酪乳桿菌（Lactobacillus casei）、短乳桿菌（Lactobacillus brevis）、戊糖乳桿菌（Lactobacillus pentosus）等。研究學(xué)者從發(fā)酵食品中分離得到具有不同發(fā)酵性能的菌株，如高產(chǎn)酸菌株[8]、耐鹽菌株[9]和降解亞硝酸鹽的乳酸菌[10]。其中高產(chǎn)酸、耐酸的乳桿菌能夠控制泡菜發(fā)酵的周期，加速發(fā)酵蔬菜的快速成熟[11-12]。除此之外，還分離得到一些拮抗性乳酸菌，對(duì)大腸桿菌（Escherichia coli）、沙門氏菌（Salmonella）、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）等有較強(qiáng)的抑制作用[13-14]。但是具有益生功能的乳酸菌多從酸奶中篩選得到，發(fā)酵泡菜中的篩選相對(duì)較少[15]。李清等[16]從貴州劍河采集的傳統(tǒng)自然發(fā)酵豆醬中分離篩選的植物乳桿菌DJ-04對(duì)人工胃腸液表現(xiàn)出良好的耐受性，具有腸道益生菌的潛能。吳偉杰等[17]將分離獲得的乳酸腸球菌（Enterococcusfaecium）WJ03接種發(fā)酵蘿卜泡菜后，縮短了泡菜的發(fā)酵周期，改善了泡菜風(fēng)味。由此可見，發(fā)酵蔬菜是潛在的優(yōu)質(zhì)乳酸菌的自然資源庫，為制備不同種類的乳酸菌發(fā)酵劑提供了選擇。

本研究從貴州遵義市采取的泡菜中分離篩選高產(chǎn)酸乳酸菌，通過形態(tài)觀察、生理生化試驗(yàn)及分子生物學(xué)技術(shù)對(duì)其進(jìn)行鑒定，并探究其耐酸、耐膽鹽性能、抑菌性能和耐鹽性能，獲得具有多種優(yōu)良性能的乳酸菌。最后，將篩選得到的優(yōu)良乳酸菌應(yīng)用到泡菜中，分析對(duì)比自然發(fā)酵泡菜和接種乳酸菌泡菜的各項(xiàng)指標(biāo)，為泡菜的工業(yè)化生產(chǎn)和發(fā)酵劑的制備提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 實(shí)驗(yàn)材料泡菜樣品：從貴州遵義市采集11份不同家庭制作的發(fā)酵泡菜；新鮮白蘿卜：貴州農(nóng)家。

1.1.2 菌株

大腸桿菌（Escherichia coli）ATCC 8739、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）ATCC 6538：美國菌種保藏中心（American type culture collection，ATCC）；植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）ST-III：河北工程大學(xué)生命科學(xué)與食品工程學(xué)院微生物資源與利用實(shí)驗(yàn)室保藏。

1.1.3 試劑

氫氧化鈉、氯化鈉、無水乙醇（均為分析純）：天津歐博凱化工有限公司；牛膽鹽（生化試劑）：北京索萊寶科技有限公司。

1.1.4 培養(yǎng)基

MRS液體培養(yǎng)基、MRS固體培養(yǎng)基、明膠液化培養(yǎng)基、接觸酶試驗(yàn)培養(yǎng)基、H2S產(chǎn)生試驗(yàn)培養(yǎng)基、硝酸鹽還原試驗(yàn)培養(yǎng)基：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；糖發(fā)酵培養(yǎng)基：上海晶純?cè)噭┯邢薰?；營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基：北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；LB培養(yǎng)基：上海博微生物科技有限公司；CaCO3-MRS固體培養(yǎng)基：在MRS固體培養(yǎng)基中加入1.5%的碳酸鈣。

1.2 儀器與設(shè)備

SW-CJ-2D型超凈工作臺(tái)：蘇州凈化設(shè)備有限公司；DHG-9070A電熱鼓風(fēng)干燥箱、DHP-9162電熱恒溫培養(yǎng)箱：上海一恒科學(xué)儀器有限公司；Microfuge 20高速離心機(jī)：美國貝克曼庫爾特公司；T100 Thermal Cycler聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）儀、Power pac2000電泳儀、Universal Hood II凝膠成像儀：美國Bio-Rad公司；YXQ-LS-50SII立式壓力蒸汽滅菌鍋：上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；JTNJB牛津杯（內(nèi)徑為6.0 mm）：北京吉泰遠(yuǎn)成科技有限公司；ZHPW-70臺(tái)式振蕩培養(yǎng)箱：天津市萊玻特瑞儀器設(shè)備有限公司；UV1901紫外可見分光光度計(jì)：杭州艾普儀器設(shè)備有限公司；OPTEC雙目生物顯微鏡：重慶奧特光學(xué)儀器有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 乳酸菌的分離

在無菌條件下取樣品中泡菜汁，用無菌生理鹽水進(jìn)行10倍梯度稀釋。選取稀釋度為10-4、10-5、10-6、10-7的稀釋液1 mL于無菌培養(yǎng)皿中，用CaCO3-MRS固體培養(yǎng)基澆注混勻，凝固后37 ℃恒溫倒置培養(yǎng)48 h[18]。挑取有明顯溶鈣圈，且溶鈣圈較大的單菌落進(jìn)行平板劃線，37 ℃培養(yǎng)48 h，反復(fù)純化多次。將純化得到的單菌落接種到MRS肉湯培養(yǎng)基培養(yǎng)，所得菌液加入30%的甘油中在-20 ℃保存。

1.3.2 高產(chǎn)酸乳酸菌的篩選

將分離純化的菌株接種于MRS液體培養(yǎng)基中，37 ℃厭氧培養(yǎng)24 h，參照文獻(xiàn)[19]測(cè)定產(chǎn)酸量，選取產(chǎn)酸能力較高的菌株進(jìn)行菌種鑒定。

1.3.3 乳酸菌的鑒定

形態(tài)觀察：挑選篩選菌株的單菌落接種于MRS固體培養(yǎng)基，37 ℃條件下培養(yǎng)24 h，觀察單菌落的色澤、形態(tài)、大小，并進(jìn)行鏡檢，觀察菌株的細(xì)胞形態(tài)。

生理生化實(shí)驗(yàn)：將篩選菌株進(jìn)行革蘭氏染色及過氧化氫酶實(shí)驗(yàn)，篩選出革蘭氏染色陽性、過氧化氫酶陰性的菌株進(jìn)行硝酸鹽還原實(shí)驗(yàn)、明膠液化實(shí)驗(yàn)、吲哚實(shí)驗(yàn)、硫化氫實(shí)驗(yàn)和糖發(fā)酵實(shí)驗(yàn)[18]，參照《伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)》（第八版）[20]、《乳酸菌細(xì)菌的分類鑒定與實(shí)驗(yàn)方法》[18]對(duì)菌種進(jìn)行綜合判定。

分子生物學(xué)鑒定：提取篩選乳酸菌的脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA），以其為模板，采用16S rDNA的通用引物27F（5'-AACTGAGTTTGATCCTGGCTC-3'）、1492R（5'-TACGGTTACCTTGTTACGACTT-3'）進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增體系：DNA模板1 μL，2×TaqPCR MasterMix 10 μL，雙蒸水（ddH2O）7 μL，27F 1 μL，1492R 1 μL。PCR擴(kuò)增條件：94 ℃預(yù)變性2 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，35個(gè)循環(huán)；72 ℃末端延伸5 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。選取在1 500 bp左右的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物送至上海生物工程有限責(zé)任公司進(jìn)行測(cè)序。DNA編碼用DNA star軟件中的Seq Man II進(jìn)行序列拼接、校對(duì)；將測(cè)序結(jié)果提交至美國國家生物技術(shù)信息中心（national center of biotechnology information，NCBI）的GenBank數(shù)據(jù)中進(jìn)行局部序列比對(duì)基本檢索工具（basic local alignment search tool，BLAST）比對(duì)搜索，選取同源性較高的模式菌株的16S rDNA序列，采用MEGA5軟件中的鄰接（neighborjoining，NJ）法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹[21]。

1.3.4 乳酸菌種子液的制備

將-80 ℃保藏的甘油管菌液37 ℃水浴，直至全部溶解。采用接種環(huán)沾取少量菌液，在MRS固體平板上劃線，37 ℃倒置培養(yǎng)至長出單菌落。挑取單菌落接種到MRS液體培養(yǎng)基，37 ℃靜置培養(yǎng)12 h后，連續(xù)轉(zhuǎn)接3次，將菌液的菌體濃度調(diào)整至1×108CFU/mL作為種子液備用。

1.3.5 乳酸菌耐酸能力的測(cè)定

以3%（V/V）的接種量將乳酸菌種子液接種于MRS液體培養(yǎng)基中，37℃條件下靜置培養(yǎng)12h。將菌懸液在10000r/min條件下離心1 min，棄上清液，用無菌生理鹽水清洗菌體3次。用pH 2.0的鹽酸水溶液重懸菌體，酸處理2 h后進(jìn)行10倍梯度稀釋，選取合適稀釋度的稀釋液，采用MRS固體培養(yǎng)基平板澆注法在37 ℃條件下培養(yǎng)48 h后，采用平板菌落計(jì)數(shù)法計(jì)算菌落數(shù)，并計(jì)算乳酸菌的存活率[22]。同時(shí)以未經(jīng)酸處理的菌株作為對(duì)照，每個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，每株菌每次實(shí)驗(yàn)做3個(gè)平行。乳酸菌耐酸存活率計(jì)算公式如下：

式中：N2為酸耐受2 h的活菌數(shù)，CFU/mL；N1為酸耐受前的活菌數(shù)，CFU/mL。

1.3.6 乳酸菌耐膽鹽能力的測(cè)定

以3%（V/V）的接種量將乳酸菌種子液接種于MRS液體培養(yǎng)基中，37℃條件下靜置培養(yǎng)12h。將菌懸液在10000r/min條件下離心1 min，棄上清液，用無菌生理鹽水清洗菌體3次。用0.3%的無菌膽鹽水重懸菌體，處理2 h后進(jìn)行10倍梯度稀釋，選取合適稀釋度的稀釋液，采用MRS固體培養(yǎng)基平板澆注法在37 ℃條件下培養(yǎng)48 h后，采用平板菌落計(jì)數(shù)法計(jì)算菌落數(shù)，并計(jì)算乳酸菌的存活率[22]。同時(shí)以未經(jīng)膽鹽處理的菌株作為對(duì)照，每個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，每株菌每次實(shí)驗(yàn)做3個(gè)平行。乳酸菌耐膽鹽存活率計(jì)算公式如下：

式中：N2為膽鹽耐受2 h的活菌數(shù)，CFU/mL；N1為膽鹽耐受前的活菌數(shù)，CFU/mL。

1.3.7 乳酸菌抑菌能力的測(cè)定

（1）指示菌株的活化

將大腸桿菌和金黃色葡萄球菌分別劃線于營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，37 ℃條件下培養(yǎng)48 h。然后挑取單菌落接種于營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，37 ℃、180 r/min條件下培養(yǎng)24 h。調(diào)整菌體濃度為1×107CFU/mL作為指示菌懸液。

（2）乳酸菌菌株上清液的制備

4)注意作為修正標(biāo)記語的well，如果well處于話輪的中間，則為自己修正標(biāo)記語；而處于話輪開始時(shí)，則為他人修正標(biāo)記語。

以3%（V/V）的接種量將乳酸菌種子液接種于MRS液體培養(yǎng)基，37 ℃條件下靜置培養(yǎng)12 h，10 000 r/min離心2 min后取上清液，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

（3）牛津杯法測(cè)定抑菌性能[23]

向培養(yǎng)皿中傾注10 mL滅菌后的0.5%～0.8%營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，水平靜置凝固，接種100 μL指示菌菌液，涂布均勻后備用。用鑷子將牛津杯垂直培養(yǎng)基表面均勻放置，牛津杯中加入100 μL乳酸菌上清液。4 ℃擴(kuò)散2 h，37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h。用游標(biāo)卡尺，采用十字交叉法測(cè)量抑菌圈直徑，根據(jù)抑菌圈直徑大小判斷菌株抑菌性能。抑菌圈直徑＞7 mm時(shí)，判定為有抑菌作用。

1.3.8 乳酸菌的耐鹽性能測(cè)定

初篩：以2%（V/V）的接種量將乳酸菌種子液接種于鹽含量為8%的MRS液體培養(yǎng)基中，37 ℃條件下靜置培養(yǎng)24 h，測(cè)定OD600nm值。觀察各個(gè)菌株的生長情況。

復(fù)篩：將篩選出的菌株以2%（V/V）的接種量將種子液分別接種于鹽含量為0、8%的MRS液體培養(yǎng)基中，37 ℃條件下靜置培養(yǎng)，每2 h取樣，測(cè)定OD600nm值[24]。用植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）ST-III作為對(duì)照組。每個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，做3個(gè)平行。

1.3.9 優(yōu)良乳酸菌發(fā)酵泡菜的制備及指標(biāo)測(cè)定

（1）發(fā)酵泡菜的制備

人工接種組：將性能優(yōu)良的乳酸菌接種于MRS液體培養(yǎng)基，37 ℃條件下靜置培養(yǎng)24 h，5 000 r/min離心2 min，用無菌生理鹽水將菌體沖洗干凈。調(diào)整菌體濃度為1×108CFU/mL，菌種接種量為0、2%、4%、6%，加入與自然發(fā)酵組工藝相同的泡菜中，密封常溫發(fā)酵。每3 d取樣進(jìn)行感官評(píng)價(jià)和pH值的測(cè)定。

（2）泡菜質(zhì)量指標(biāo)的測(cè)定

pH值的測(cè)定：采用pH計(jì)測(cè)定發(fā)酵后泡菜汁的pH值。

感官評(píng)價(jià)[25]：選取15名專業(yè)人員對(duì)自然發(fā)酵的泡菜和人工接種泡菜進(jìn)行感官評(píng)價(jià)，滿分9分，具體評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)見表1。

表1 泡菜感官評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)Table 1 Sensory evaluation standards of pickles

2 結(jié)果與分析

2.1 高產(chǎn)酸乳酸菌的篩選

從貴州泡菜樣品中共分離出143株乳酸菌，根據(jù)在CaCO3-MRS固體培養(yǎng)基上形成透明的溶鈣圈越大則產(chǎn)酸能力越強(qiáng)[7]，挑選出11株產(chǎn)酸能力較強(qiáng)的菌株，其溶鈣圈直徑和產(chǎn)酸量見表2。

表2 篩選菌株的產(chǎn)酸能力Table 2 Acid-producing ability of screened lactic acid bacteria

由表2可知，菌株A50f7、A50b9、A50c2和A50b2產(chǎn)生的溶鈣圈顯著大于其他菌株（P＜0.05），初步確定這4株菌產(chǎn)酸能力較強(qiáng)。根據(jù)菌株產(chǎn)酸量可以得出菌株A50f7、A50b9、A50c2和A50b2的產(chǎn)酸量顯著高于其他菌株（P＜0.05）。其中菌株A50f7、A50b9產(chǎn)酸量最高，分別為3.83 g/L和2.97 g/L。因此，確定菌株A50f7和A50b9為高產(chǎn)酸乳酸菌。

2.2 乳酸菌的鑒定結(jié)果

2.2.1 形態(tài)學(xué)鑒定

11株產(chǎn)酸能力較高的菌株的形態(tài)觀察結(jié)果見表3。由表3可知，11株乳酸菌的菌落均為白色或乳白色，細(xì)胞均呈桿狀，且均為革蘭氏染色陽性菌（G+）。

表3 不同菌株的形態(tài)學(xué)特征Table 3 Morphological characteristics of different strains

2.2.2 生理生化鑒定

根據(jù)《伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)》[20]和《乳酸菌細(xì)菌的分類鑒定與實(shí)驗(yàn)方法》[18]，這11株菌株的發(fā)酵特征與植物乳桿菌一致，可以利用葡萄糖發(fā)酵，不運(yùn)動(dòng)、不產(chǎn)生吲哚、不液化明膠、不產(chǎn)生H2S、不還原硝酸鹽，可以發(fā)酵苦杏仁苷、阿拉伯糖、纖維二糖、七葉靈、果糖、半乳糖、乳糖、麥芽糖、甘露糖、甘露醇、核糖、水楊苷、山梨醇、蔗糖、棉籽糖、海藻糖和木糖。結(jié)合菌株形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果可以初步鑒定這11株菌為植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）。

2.2.3 分子生物學(xué)鑒定[26]

11株乳酸菌的系統(tǒng)發(fā)育樹見圖1。由圖1可知，菌株A50a8、A50b9、A50b11、A50c2、A50c3與植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）ST-III（GenBank登陸號(hào)：FJ423546）聚于一支，親緣關(guān)系最近，因此，將這5株菌鑒定為植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）。菌株A50e2、A50f7、A50f2、A50b2、A50f1、A50e1與副植物乳桿菌（Lactobacillus paraplantarum）BIM B-535（GenBank登錄號(hào)：JF965381.1）聚于一支，親緣關(guān)系最近，因此，將這6株菌株鑒定為副植物乳桿菌（Lactobacillus paraplantarum）。

圖1 基于16S rDNA基因序列11株菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.1 Phylogenetic tree of 11 strains based on 16S rDNA genes sequences

2.3 乳酸菌耐酸能力的測(cè)定

人的胃液pH值在1.5～4.5之間，其pH值的大小因食物結(jié)構(gòu)不同而波動(dòng)。乳酸菌能夠耐受胃液中高酸性環(huán)境，才能進(jìn)入到腸道中定殖。因此，菌株需對(duì)酸性環(huán)境具有一定耐受能力。分離篩選得到的11株乳酸菌，在pH 2.0條件下處理2 h，其耐酸能力見表4。

表4 不同乳酸菌的酸耐受能力Table 4 Acid tolerance of different lactic acid bacteria strains

由表4可知，11株乳酸菌經(jīng)過pH 2.0的酸溶液處理2 h后均能存活，存活率均達(dá)到87%以上，說明這11株乳酸菌均具有良好的耐酸性能。其中，菌株A50f7和A50b9的存活率較高，活菌數(shù)達(dá)到了108CFU/mL以上，耐酸存活率分別為（99.19±0.39）%和（98.17±0.06）%。因此，菌株A50f7、A50b9可以作為具有潛在益生特性的耐酸乳酸菌菌株。

2.4 乳酸菌耐膽鹽能力的測(cè)定

人體的腸道環(huán)境膽鹽濃度通常為0.03%～0.30%，因此菌株進(jìn)入腸道定殖，并能發(fā)揮益生功能，必須對(duì)膽鹽有一定耐受能力。菌株經(jīng)過0.30%的膽鹽溶液處理2 h后，11株乳酸菌的耐膽鹽能力見表5。

表5 不同乳酸菌的膽鹽耐受能力Table 5 Bile salt tolerance of different lactic acid bacteria strains

由表5可知，11株乳酸菌表現(xiàn)出不同的耐膽鹽能力。其中，菌株A50b9、A50e2、A50c3、A50a8、A50f7的耐膽鹽能力較好，存活率均在70%以上。0.3%的膽鹽溶液處理2 h后其中菌株A50f7、A50b9的活菌數(shù)達(dá)到了107CFU/mL以上，存活率分別為（85.36±0.78）%和（81.98±0.55）%。

2.5 乳酸菌抑菌能力的測(cè)定

蔬菜表面附著的大量微生物中含有大量的腐敗菌和致病菌，使食品的安全性受到影響。乳酸菌在代謝過程中可以產(chǎn)生具有高效、無毒、耐高溫、無殘留、無抗藥性等特點(diǎn)的乳酸菌細(xì)菌素，對(duì)細(xì)菌、真菌，甚至病毒均有抑制作用[27]，對(duì)泡菜具有防腐保鮮的作用。本研究利用大腸桿菌和金黃色葡萄球菌為指示菌，研究11株乳酸菌的抑菌能力，結(jié)果見表6。

表6 不同乳酸菌的抑菌能力Table 6 Bactericidal capacity of different lactic acid bacteria strains

由表6可知，11株乳酸菌對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌均有不同程度的抑制作用。其中，菌株A50f7和A50b9的抑菌能力顯著高于其他菌株（P＜0.05），對(duì)大腸桿菌的抑菌圈直徑分別為（15.49±0.65）mm和（13.62±1.13）mm，對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌圈直徑分別是（14.89±0.34）mm、（14.02±0.67）mm。結(jié)果表明，菌株A50f7、A50b9對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌均有較強(qiáng)的抑制作用。

2.6 乳酸菌耐鹽性能的測(cè)定

乳酸菌的耐鹽能力是用于制作泡菜的重要指標(biāo)[28]。研究表明，高濃度的鹽會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)水分外流，細(xì)胞胞質(zhì)分離，最終致使細(xì)胞停止生長，甚至死亡[29]。泡菜中鹽濃度過高會(huì)延長泡菜的發(fā)酵周期，間接影響泡菜的風(fēng)味[30]。但一定的鹽濃度可以抑制腐敗微生物的生長，防止泡菜腐爛變質(zhì)。初篩結(jié)果顯示，11株乳酸菌菌在含有8%NaCl的MRS液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h后，菌株A50f7、A50b2、A50b9、A50b11、A50c2生長情況較好，將這5株乳酸菌進(jìn)行復(fù)篩，復(fù)篩結(jié)果見圖2。

圖2 在無NaCl（a）及8%NaCl含量（b）條件下5株乳酸菌的生長曲線Fig.2 Growth curves of 5 lactic acid bacteria strains without NaCl (a)and with 8% NaCl (b)

由圖2a可知，在不含NaCl的培養(yǎng)基中，6株乳酸菌培養(yǎng)2 h后進(jìn)入對(duì)數(shù)期，乳酸菌A50f7、A50b9、ST-III培養(yǎng)12 h時(shí)進(jìn)入穩(wěn)定期，乳酸菌A50b2、A50b11、A50c2延滯期較長，生長較為緩慢，培養(yǎng)14 h時(shí)進(jìn)入穩(wěn)定期。

由圖2b可知，6株乳酸菌在含有8%NaCl的MRS液體培養(yǎng)基中生長時(shí)均受到抑制，乳酸菌A50f7、A50b9、ST-III生長速度顯著高于其他菌株，且生長曲線相似，培養(yǎng)10 h時(shí)開始進(jìn)入對(duì)數(shù)期，26 h時(shí)進(jìn)入穩(wěn)定期。乳酸菌A50b2、A50b11、A50c2延滯期較長，14 h時(shí)開始進(jìn)入對(duì)數(shù)期，培養(yǎng)28 h時(shí)進(jìn)入穩(wěn)定期。綜合以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選取乳酸菌A50f7、A50b9進(jìn)行泡菜發(fā)酵實(shí)驗(yàn)。

2.7 乳酸菌發(fā)酵泡菜結(jié)果分析

乳酸菌發(fā)酵蔬菜過程中產(chǎn)生大量的酸能快速降低泡菜pH值，抑制腐敗菌生長，防止泡菜腐敗變質(zhì)，延長泡菜保質(zhì)期，并能促進(jìn)泡菜色澤的形成，加快泡菜發(fā)酵，縮短泡菜發(fā)酵周期。乳酸菌A50f7和A50b9的不同接種量對(duì)發(fā)酵泡菜pH值的影響結(jié)果見圖3，不同接種量發(fā)酵的泡菜的感官評(píng)價(jià)結(jié)果見表7。

由圖3可知，發(fā)酵0～3 d發(fā)酵體系的pH值下降較為明顯，且下降速度為乳酸菌A50f7＞乳酸菌A50b9＞自然發(fā)酵；發(fā)酵12～15 d發(fā)酵體系的pH值下降速度趨于平緩，泡菜發(fā)酵成熟，發(fā)酵成熟所需時(shí)間為乳酸菌A50f7＜乳酸菌A50b9＜自然發(fā)酵。說明人工接種乳酸菌縮短了發(fā)酵泡菜達(dá)到泡菜所需pH值的發(fā)酵時(shí)間，提高了發(fā)酵泡菜的生產(chǎn)率。

圖3 乳酸菌A50b9（a）及A50f7（b）不同接種量對(duì)發(fā)酵泡菜pH值的影響Fig.3 Effect of different inoculum of lactic acid bacteria A50b9 (a) and A50f7 (b) on pH value of fermented pickle

表7 不同接種量乳酸菌發(fā)酵的泡菜的感官評(píng)價(jià)結(jié)果Table 7 Sensory evaluation results of pickles fermented by lactic acid bacteria with different inoculum

由表7可知，綜合色澤、氣味、滋味、脆度評(píng)分，當(dāng)乳酸菌接種量為4%時(shí)得分由高到低依次是乳酸菌A50f7＞乳酸菌A50b9＞自然發(fā)酵。但是滋味評(píng)分中乳酸菌A50b9＞乳酸菌A50f7＞自然發(fā)酵，說明菌種不同發(fā)酵泡菜的品質(zhì)也有所不同。而且當(dāng)乳酸菌的接種量過大時(shí)，會(huì)對(duì)泡菜風(fēng)味有一定程度的破壞。證明了人工接種適量乳酸菌發(fā)酵泡菜可以提高泡菜的品質(zhì)和風(fēng)味，有效的縮短泡菜的發(fā)酵周期。說明乳酸菌A50b9、A50f7具有做為泡菜發(fā)酵劑的潛能。

3 結(jié)論

本研究從貴州遵義市自制泡菜中分離得到143株乳酸菌，篩選得到11株產(chǎn)酸量較高的乳酸菌，產(chǎn)酸量均在1.89 g/L以上，經(jīng)鑒定5株為植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum），6株為副植物乳桿菌（Lactobacillus paraplantarum），11株高產(chǎn)酸乳酸菌經(jīng)過耐酸、耐膽鹽、抑菌和耐鹽性能的測(cè)定篩選得到兼有多種優(yōu)良發(fā)酵性能的乳酸菌A50f7和A50b9并應(yīng)用于泡菜。接種4%乳酸菌A50f7可以改善泡菜的品質(zhì)和風(fēng)味，發(fā)酵12 d就能達(dá)到所需pH值，縮短了泡菜的發(fā)酵周期，解決了工業(yè)生產(chǎn)中泡菜發(fā)酵周期長，生產(chǎn)效率低等問題，為乳酸菌泡菜發(fā)酵劑開發(fā)的菌種選育提供了依據(jù)。