均勻設(shè)計(jì)優(yōu)化生香酵母產(chǎn)酯發(fā)酵工藝

成 福，肖 洋，王 婷，曹武龍，張秋寒，唐一山，王萬能

（重慶理工大學(xué)藥學(xué)與生物工程學(xué)院，重慶 400054）

生香酵母又名產(chǎn)酯酵母，主要是假絲酵母屬（Candida）和漢遜酵母屬（Hansenula），在白酒生產(chǎn)中漢遜酵母應(yīng)用最多[1]。生香酵母在白酒釀造中主要產(chǎn)生乙酸乙酯以增酯提香[2-3]，其代謝產(chǎn)物中的醇類、酸類、羰基化合物等物質(zhì)對(duì)于協(xié)調(diào)酒體味道也有重要作用[4-5]。生香酵母發(fā)酵過程中水解和酯化反應(yīng)有助于協(xié)調(diào)酒液中的酸、醇和酯水平[6]，有利于維持酒體中物質(zhì)的平衡。

清香型白酒以乙酸乙酯為主體香，其口味清香、醇厚，但我國清香型白酒的生產(chǎn)是以釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）、根霉（Rhizopus）等為主體進(jìn)行發(fā)酵，酒液中酯類含量較低，需要提高酒體口味和品質(zhì)[7]。液態(tài)發(fā)酵法生產(chǎn)白酒是我國生產(chǎn)白酒的組成部分，楊強(qiáng)等[8]從酒曲中通過液態(tài)發(fā)酵法分離出一株高產(chǎn)乙酸乙酯的酵母菌種Y29，較對(duì)照的乙酸乙酯產(chǎn)量顯著提高，且出酒率等未受影響。液態(tài)發(fā)酵釀酒技術(shù)具有工藝簡單、出酒率高、成本低等優(yōu)點(diǎn)，但酒的品質(zhì)差[9]，因此，探究生香酵母發(fā)酵產(chǎn)酯代謝特點(diǎn)，將其應(yīng)用于高品質(zhì)的清香型白酒的生產(chǎn)有重要意義。

目前，針對(duì)生香酵母的產(chǎn)酯工藝優(yōu)化大多是從發(fā)酵糖度、溶液酸堿度、溫度等方面進(jìn)行優(yōu)化[10-12]，對(duì)于生香酵母菌株的生長情況以及產(chǎn)酯發(fā)酵過程中的調(diào)控考慮較少，對(duì)于生香酵母產(chǎn)酯工藝的過程仍需調(diào)整優(yōu)化。因此，本研究通過均勻試驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化生香酵母產(chǎn)酯工藝，針對(duì)生香酵母產(chǎn)酯的過程進(jìn)行分階段調(diào)控，確定生香酵母產(chǎn)酯代謝各階段的時(shí)間，優(yōu)化出最佳的生香酵母產(chǎn)酯工藝，為生產(chǎn)高質(zhì)量的清香型白酒提供思路，為提高液態(tài)發(fā)酵白酒的品質(zhì)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌種漢遜酵母屬（Hansenula）生香酵母H1：分離自安琪生香酵母酒曲，實(shí)驗(yàn)室保藏。

1.1.2 試劑

鹽酸羥胺、氫氧化鈉、乙酸乙酯（均為分析純）：成都市科隆化學(xué)品有限公司；無水乙醇（分析純）：重慶川東化工有限公司；酚酞指示劑：成都市科龍化工試劑廠。

1.1.3 培養(yǎng)基

酵母膏胨葡萄糖（yeast extract peptone dextrose，YEPD）瓊脂培養(yǎng)基：蛋白胨20.0 g、酵母膏10.0 g、葡萄糖20.0 g、瓊脂20.0 g、蒸餾水1 L，pH為6.0，115 ℃高壓濕熱滅菌15 min。YEPD液體培養(yǎng)基中不添加瓊脂。

產(chǎn)酯發(fā)酵培養(yǎng)基[13]：葡萄糖161 g、酵母膏0.10 g、磷酸二氫鉀0.10 g、磷酸氫二銨0.25 g，氯化鎂0.10 g，5.0%豆芽汁1 L，pH為5.0，115 ℃高壓濕熱滅菌15 min。

1.2 儀器與設(shè)備

L-550臺(tái)式離心機(jī)、TGL-16M高速臺(tái)式冷凍離心機(jī)：長沙湘儀離心機(jī)有限公司；ZHWY-2102C振蕩培養(yǎng)箱：上海智城分析儀器制造有限公司；BSP-100生化培養(yǎng)箱：上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；FE20實(shí)驗(yàn)室pH計(jì)：梅特勒-托利多儀器有限公司；UV-2450分光光度儀：島津國際貿(mào)易有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 生香酵母H1產(chǎn)酯發(fā)酵工藝

根據(jù)生香酵母產(chǎn)酯代謝特點(diǎn)[13-14]，其產(chǎn)酯過程可概括為酵母生長階段、乙醇發(fā)酵階段、產(chǎn)酯階段，本研究通過此三階段對(duì)生香酵母產(chǎn)酯工藝進(jìn)行優(yōu)化。取適量菌液劃線于YEPD瓊脂培養(yǎng)基，28 ℃條件下培養(yǎng)48 h。挑取單菌落接種于200 mL YEPD液體培養(yǎng)基中，28 ℃條件下培養(yǎng)36 h，制備種子液。按10%（V/V）的接種量將種子液接種于產(chǎn)酯發(fā)酵培養(yǎng)基，裝液量為100 mL/250 mL，28 ℃、180 r/min條件下培養(yǎng)，設(shè)置三組平行試驗(yàn)。按照均勻試驗(yàn)設(shè)計(jì)表進(jìn)行試驗(yàn)。如第1組，接種培養(yǎng)4 h后取出錐形瓶，進(jìn)行密封，于28 ℃生化培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)，進(jìn)入乙醇發(fā)酵階段。發(fā)酵72 h之后，解除密封狀態(tài)，進(jìn)入產(chǎn)酯發(fā)酵階段。發(fā)酵88 h后取出發(fā)酵瓶，測定總酯和乙酸乙酯含量。

1.3.2 生香酵母H1產(chǎn)酯發(fā)酵工藝優(yōu)化均勻試驗(yàn)設(shè)計(jì)

以總酯含量（Y1）和乙酸乙酯含量（Y2）為評(píng)價(jià)指標(biāo)，選取菌株生長時(shí)間（A）、乙醇發(fā)酵時(shí)間（B）、產(chǎn)酯發(fā)酵時(shí)間（C）為考察因素，進(jìn)行3因素13水平的均勻設(shè)計(jì)優(yōu)化試驗(yàn)，因素與水平見表1[15]。

表1 生香酵母H1產(chǎn)酯發(fā)酵工藝優(yōu)化均勻試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素與水平Table 1 Factors and levels of uniform test design for ester production process optimization of aroma-producing yeast H1

1.3.3 測定方法

總酸、總酯含量的測定：參照國標(biāo)GB/T 10345—2007《白酒分析方法》[16]。

乙酸乙酯含量的測定[17]：乙酸乙酯可以與鹽酸羥胺乙醇溶液及三氯化鐵反應(yīng)，生成一種洋紅色的絡(luò)合物，這種洋紅色的絡(luò)合物在波長530 nm處有特征吸收峰，采用紫外-可見光分光光度計(jì)對(duì)其含量進(jìn)行測定。

1.3.4 均勻試驗(yàn)設(shè)計(jì)數(shù)學(xué)建模

對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析處理，采用逐步遞進(jìn)回歸分析法[18]建立發(fā)酵液中總酯含量、乙酸乙酯含量與酵母生長時(shí)間、乙醇發(fā)酵時(shí)間、產(chǎn)酯發(fā)酵時(shí)間的數(shù)學(xué)模型，采用網(wǎng)格法[19]對(duì)生香酵母H1發(fā)酵液中的總酯含量、乙酸乙酯含量的回歸方程擬定出最優(yōu)組合。

1.3.5 驗(yàn)證試驗(yàn)

對(duì)回歸分析優(yōu)化后的結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證，并與模擬結(jié)果進(jìn)行比對(duì)分析，確定生香酵母產(chǎn)酯發(fā)酵的最優(yōu)生產(chǎn)工藝。

2 結(jié)果與分析

2.1 生香酵母H1產(chǎn)酯發(fā)酵工藝優(yōu)化均勻試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

表2 生香酵母H1產(chǎn)酯發(fā)酵工藝優(yōu)化均勻試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Table 2 Design and results of uniform test for ester production process optimization of aroma-producing yeast H1

續(xù)表

生香酵母代謝復(fù)雜，與發(fā)酵培養(yǎng)時(shí)間、溫度、供氧情況等多種因素相關(guān)[20]。有研究發(fā)現(xiàn)，溫度可以影響氧氣和二氧化碳的溶解度，進(jìn)而對(duì)酵母代謝產(chǎn)生影響[21]，過高的溫度會(huì)積累較多的乙醇，產(chǎn)生細(xì)胞毒性[22]。因此，本研究在28 ℃條件下研究生香酵母H1產(chǎn)酯發(fā)酵工藝條件[23]，利用均勻試驗(yàn)設(shè)計(jì)對(duì)生香酵母H1發(fā)酵產(chǎn)酯工藝進(jìn)行優(yōu)化，結(jié)果見表2。

由表2可知，乙酸乙酯含量和總酯含量變化趨勢相同，且每組試驗(yàn)中乙酸乙酯含量均高于總酯含量的60%，說明生香酵母H1主要產(chǎn)生乙酸乙酯，為其在生產(chǎn)清香型白酒中的應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。當(dāng)總酯含量達(dá)到最大值（2.090 g/L）時(shí)，發(fā)酵液中的總酸含量達(dá)到最低值（1.680 g/L），總酸含量與酯類物質(zhì)的含量呈現(xiàn)相反的變化趨勢，表明發(fā)酵液中酸參與了生香酵母的產(chǎn)酯代謝過程，并作為合成酯的前體物質(zhì)被發(fā)酵利用。

酵母生長時(shí)間不足會(huì)影響酵母代謝產(chǎn)物的積累，影響白酒的質(zhì)量。由表2可知，當(dāng)酵母生長時(shí)間僅為4 h 時(shí)，總酯含量為1.085 g/L，總酸的含量較高為2.437 g/L。由于酵母在發(fā)酵初期需要生長積累數(shù)量，為后續(xù)發(fā)酵保證有足夠數(shù)量的“發(fā)酵工廠”，因此，當(dāng)酵母的生長時(shí)間過短時(shí)，對(duì)于酸的利用較少，總酯的積累受到限制。發(fā)酵過程中的酯類物質(zhì)含量受乙醇發(fā)酵時(shí)間的影響較大，乙醇發(fā)酵階段過長，乙醇過多產(chǎn)生可能導(dǎo)致細(xì)胞毒性，影響酯的積累，如乙醇發(fā)酵時(shí)間為104 h時(shí)，總酯含量（1.399 g/L）比乙醇發(fā)酵時(shí)間為64 h的總酯含量（2.090 g/L）低，表明需要合理控制乙醇發(fā)酵時(shí)間，并對(duì)該階段工藝進(jìn)行優(yōu)化。此外，產(chǎn)酯時(shí)間也是影響酯積累的重要因素。當(dāng)產(chǎn)酯發(fā)酵時(shí)間為8 h時(shí)，總酯含量僅為0.554 g/L。但如果菌體數(shù)量積累過大，發(fā)酵時(shí)間過長，也會(huì)導(dǎo)致營養(yǎng)物質(zhì)匱乏，產(chǎn)酯量降低[24]，如當(dāng)發(fā)酵產(chǎn)酯時(shí)間為104 h時(shí)，其總酯含量僅為1.187 g/L，提示在生產(chǎn)工藝的控制中，需要選擇合適產(chǎn)酯發(fā)酵時(shí)間，以保證白酒的生產(chǎn)質(zhì)量。此外，結(jié)果顯示，總酯及乙酸乙酯含量最高的一組（4號(hào)），其產(chǎn)酯發(fā)酵時(shí)間僅為16 h，表明酵母產(chǎn)酯發(fā)酵時(shí)間是影響酵母產(chǎn)酯的重要因素，需要進(jìn)行優(yōu)化。在酒液中，酸、醇、酯等物質(zhì)對(duì)于白酒口味的協(xié)調(diào)非常重要，因此，本研究針對(duì)酵母生長時(shí)間、乙醇發(fā)酵時(shí)間、產(chǎn)酯發(fā)酵時(shí)間三個(gè)階段進(jìn)行優(yōu)化合理，利于提高白酒的質(zhì)量，有助于白酒釀造工藝的發(fā)展。

2.2 均勻試驗(yàn)設(shè)計(jì)數(shù)學(xué)建模回歸分析

2.2.1 總酯含量模型回歸分析

通過均勻試驗(yàn)設(shè)計(jì)軟件對(duì)表2總酯含量的試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，采用逐步遞進(jìn)法回歸分析后得到了發(fā)酵液中總酯含量（Y1）與生香酵母的生長時(shí)間（A）、乙醇發(fā)酵時(shí)間（B）、產(chǎn)酯發(fā)酵時(shí)間（C）的數(shù)學(xué)模型：

采用網(wǎng)格法對(duì)發(fā)酵過程中總酯的回歸方程搜索最優(yōu)化組合，結(jié)果表明，當(dāng)生香酵母H1的生長時(shí)間為18 h，乙醇發(fā)酵時(shí)間為74 h，產(chǎn)酯發(fā)酵時(shí)間為20 h時(shí)，預(yù)期最優(yōu)總酯含量可達(dá)到2.260 g/L，顯著性水平α=0.100 0；剩余標(biāo)準(zhǔn)差s=0.084 7；復(fù)相關(guān)系數(shù)R2=0.996 7；決定系數(shù)R2=0.993 3。

2.2.2 乙酸乙酯含量模型回歸分析

發(fā)酵液中乙酸乙酯含量變化趨勢和總酯含量變化趨勢相同，因此，對(duì)于總酯和乙酸乙酯的數(shù)學(xué)模型的優(yōu)化結(jié)果較一致，通過均勻試驗(yàn)設(shè)計(jì)軟件對(duì)表2中乙酸乙酯含量的試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，采用逐步遞進(jìn)法回歸分析后得到了發(fā)酵液中乙酸乙酯含量（Y2）與生香酵母生長時(shí)間（A）、乙醇發(fā)酵時(shí)間（B）、產(chǎn)酯發(fā)酵時(shí)間（C）的數(shù)學(xué)模型：

采用網(wǎng)格法對(duì)發(fā)酵產(chǎn)生乙酸乙酯的回歸方程搜索最優(yōu)化組合，結(jié)果表明，當(dāng)酵母菌體生長時(shí)間為16 h，乙醇發(fā)酵時(shí)間為69 h，產(chǎn)酯發(fā)酵時(shí)間為18 h時(shí)，預(yù)期最優(yōu)乙酸乙酯含量可達(dá)到1.933 g/L，顯著性水平α=0.100 0；剩余標(biāo)準(zhǔn)差s=0.078 8；復(fù)相關(guān)系數(shù)R2=0.996 6；決定系數(shù)R2=0.993 1。

2.2.3 驗(yàn)證試驗(yàn)

總酯中含量最多的為乙酸乙酯，因此，在進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)時(shí)根據(jù)總酯含量的數(shù)學(xué)模型優(yōu)化結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，對(duì)發(fā)酵液中總酯、乙酸乙酯含量進(jìn)行分析。結(jié)果表明，當(dāng)生香酵母H1生長時(shí)間為18 h、乙醇發(fā)酵時(shí)間為74 h、產(chǎn)酯發(fā)酵時(shí)間為20 h時(shí)，發(fā)酵液中最終的總酯含量可達(dá)2.463 g/L，比預(yù)期試驗(yàn)結(jié)果（2.260 g/L）提高8.980%；乙酸乙酯含量為2.164 g/L，比預(yù)期試驗(yàn)結(jié)果（1.933 g/L）提高11.95%。在此最優(yōu)發(fā)酵工藝下，發(fā)酵液中總酯及乙酸乙酯含量均高于表2中4號(hào)試驗(yàn)組。因此，確定生香酵母H1產(chǎn)酯的最優(yōu)發(fā)酵工藝為菌株生長時(shí)間18 h、乙醇發(fā)酵時(shí)間74 h、產(chǎn)酯發(fā)酵時(shí)間20 h。優(yōu)化后的生香酵母H1的生長時(shí)間為18 h，此時(shí)的酵母細(xì)胞新陳代謝旺盛，對(duì)環(huán)境變化適應(yīng)能力強(qiáng)，酵母細(xì)胞積累適量，培養(yǎng)基營養(yǎng)物質(zhì)充裕，此時(shí)進(jìn)入乙醇發(fā)酵階段，充裕的營養(yǎng)物質(zhì)可以為乙醇的積累提供保障?？傰ツＰ椭泻幸掖及l(fā)酵時(shí)間（B）的優(yōu)化項(xiàng)較多，表明乙醇發(fā)酵時(shí)間是影響生香酵母產(chǎn)酯發(fā)酵的重要因素。生香酵母乙醇發(fā)酵能力大多較釀造型酵母低，可能需要花費(fèi)較長的時(shí)間進(jìn)行乙醇的積累，而乙醇作為酯類物質(zhì)合成的重要物質(zhì)，乙醇的積累對(duì)于總酯、乙酸乙酯的積累量有重要的作用。優(yōu)化后的乙醇發(fā)酵時(shí)間為74 h，符合實(shí)際，優(yōu)化合理。產(chǎn)酯發(fā)酵階段是利用前期積累的前提物質(zhì)進(jìn)行酯類物質(zhì)的合成，但如果產(chǎn)酯時(shí)間過長，產(chǎn)酯的前體物質(zhì)消耗殆盡，總酯不再積累，甚至伴隨著氧氣供給酯酶活力恢復(fù)，導(dǎo)致發(fā)酵液總酯含量下降，符合優(yōu)化目的。驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果表明優(yōu)化后的工藝符合并優(yōu)于預(yù)期試驗(yàn)結(jié)果，表明數(shù)學(xué)模型建立成功，優(yōu)化后的工藝組合可靠，達(dá)到實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹?/p>

3 結(jié)論

以生香酵母菌種H1進(jìn)行產(chǎn)酯發(fā)酵研究，通過均勻試驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化、數(shù)學(xué)建模回歸分析后確定其產(chǎn)酯最優(yōu)發(fā)酵工藝為菌株生長時(shí)間18 h，乙醇發(fā)酵時(shí)間74 h，產(chǎn)酯發(fā)酵時(shí)間20 h。在此最優(yōu)發(fā)酵工藝下，發(fā)酵液中總酯含量為2.463 g/L，乙酸乙酯含量為2.164 g/L，與預(yù)期結(jié)果相符，表明數(shù)學(xué)模型建立可靠、數(shù)據(jù)可信度高。優(yōu)化生香酵母產(chǎn)酯發(fā)酵條件，對(duì)于提高白酒品質(zhì)有重要意義，也為液態(tài)發(fā)酵釀酒技術(shù)提供了參考，具有較高的應(yīng)用價(jià)值。