響應面法優(yōu)化混菌發(fā)酵野木瓜果酒產(chǎn)酯工藝的研究

韋廣鑫，張　丹，曾凡坤，周永文，張惟廣（.西南大學食品科學學院，重慶40075；.重慶金立方酒業(yè)股份有限公司，重慶4040）

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響應面法優(yōu)化混菌發(fā)酵野木瓜果酒產(chǎn)酯工藝的研究

韋廣鑫1，張丹1，曾凡坤1，周永文2，張惟廣1
（1.西南大學食品科學學院，重慶400715；2.重慶金立方酒業(yè)股份有限公司，重慶401420）

摘要：通過單因素實驗與響應面分析法優(yōu)化混菌發(fā)酵野木瓜果酒的工藝參數(shù)，探討混菌方式、接種量、SO2添加量、發(fā)酵溫度、pH值對總酯含量的作用規(guī)律。結(jié)果表明，間隔3d接種（異常漢遜酵母接種3d后接種sy釀酒酵母），異常漢遜酵母接種量為1.88×105cfu/mL、sy釀酒酵母接種量為1.63×107cfu/mL，溫度為18℃，SO2添加量為100 mg/L，pH3.55，在此條件下，發(fā)酵產(chǎn)出的野木瓜果酒總酯含量達到19.350 mg/L±0.712 mg/L，比純種發(fā)酵時的總酯含量高出1.7倍。

關鍵詞：野木瓜果酒；混菌發(fā)酵；總酯；響應面法；果酒

優(yōu)先數(shù)字出版時間：2016-03-24；地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/52.1051.TS.20160324.1202.003.html。

野木瓜（Stauntonia chinensis）屬薔薇科灌木叢植物，為中國特有果木之一，素有“百益之果”美稱，主要分布于貴州正安縣、重慶綦江等地。野木瓜皮薄肉厚、風味濃郁、品質(zhì)優(yōu)良，富含氨基酸、維生素、礦物質(zhì)、有機酸和酶等，其中有機酸包括檸檬酸、齊墩果酸等，酶包括過氧化氫酶、超氧化物歧化酶（SOD）等［1］。由于野木瓜鮮食品種存在糖酸比極低、果實堅硬等特點，不適宜直接食用，通常將其制成野木瓜果脯、果酒、果醋等，為在充分利用資源的同時，又提高產(chǎn)品附加值。重慶金立方酒業(yè)集團采用活性干酵母純種發(fā)酵野木瓜果酒，釀制出色澤金黃、果香淡雅、諸味協(xié)調(diào)的野木瓜果酒。雖然果酒成品品質(zhì)得到了保證，但酒液風格單調(diào)、風味淡薄，缺乏果味和酯香，難以達到高品質(zhì)野木瓜果酒的要求。

自然發(fā)酵的葡萄酒與人工接種釀酒酵母發(fā)酵的葡萄酒相比，酒液風味濃郁，香氣怡人，風格典型。主要是因為自然發(fā)酵過程中的酵母群體更為復雜，釀酒酵母主要完成酒精發(fā)酵，而非釀酒酵母能夠合成多種酶，將原料中的前體物質(zhì)轉(zhuǎn)化成為酯類、酸類、高級醇等，后者對于果酒的風味影響更加顯著［2］。于是有研究者提出將非釀酒酵母與釀酒酵母混合發(fā)酵，在保證發(fā)酵效率的同時，提高酒液中的酯類物質(zhì)含量，豐富果酒香氣品質(zhì)。Rojas等［3］將非釀酒酵母（Hanseniaspora guilliermondii 11104和Pichia anomala 10590）與釀酒酵母混合發(fā)酵，發(fā)現(xiàn)前者能夠顯著提高葡萄酒中乙酸乙酯、乙酸異戊酯和2-乙酸苯乙酯的含量。Clemente-Jimenez J M等［4］發(fā)現(xiàn)Pichia fermentans與Saccharomyces cerevisiae順序混菌發(fā)酵，能夠顯著提高乙醛、乙酸乙酯、正丙醇、正丁醇、辛酸乙酯、2，3-丁二醇、甘油等物質(zhì)的含量。汪立平等［5］利用法爾皮有孢漢遜酵母混合酵母屬酵母順序發(fā)酵蘋果酒，使蘋果酒總酯濃度提高為釀酒酵母純種發(fā)酵時的1.60倍，且發(fā)酵時間與純種發(fā)酵相同，均為31d。課題組根據(jù)非釀酒酵母的耐酒精、耐SO2、耐酸、凝聚性、發(fā)酵效率等釀造特性［6］，篩選出1株適宜野木瓜果酒發(fā)酵的異常漢遜酵母（Hansenula anomala），以此與安琪SY釀酒酵母混合發(fā)酵，利用響應面法優(yōu)化混菌發(fā)酵工藝，以期為高品質(zhì)野木瓜果酒的開發(fā)提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1材料與儀器

野木瓜：采收于重慶市綦江區(qū)。sy釀酒酵母：安琪酵母有限公司；異常漢遜酵母（H.anomala SICC 2.96），四川省食品發(fā)酵工業(yè)研究設計院。酵母營養(yǎng)添加物：法國LAFFORT公司。2-辛醇（色譜純）：Sigma公司。正構(gòu)烷烴混標：C3—C9、C10—C25，百靈威科技有限公司。其他試劑均為國產(chǎn)分析純或色譜純。

儀器設備：榨汁機、ZWY-2102C恒溫培養(yǎng)振蕩器（上海智城分析儀器制造有限公司）、LHS-150SC恒溫恒濕培養(yǎng)箱（上海齊欣科學儀器有限公司）、PB-10酸度計（德國賽多利斯集團）、UV1000紫外可見分光光度計（上海天美科學儀器有限公司）、BX43型顯微鏡（日本OLYMPUS公司）、手動SPME進樣器、50/30μm DVB/CAR/PDMS萃取頭（美國SUPELCO公司）；QP2010氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（日本島津公司）。

1.2實驗方法

1.2.1種子液的培養(yǎng)

異常漢遜酵母：從斜面種子上接1環(huán)于40mL豆芽汁培養(yǎng)基于28℃、120r/min條件下振蕩培養(yǎng)18h后，混勻，取1mL于顯微鏡下，通過血球平板記數(shù)法計數(shù)。記下活菌數(shù)為7.50×107cfu/mL。

安琪sy酵母：將酵母粉用10%的糖水活化后，混勻，取1mL于顯微鏡下，通過血球平板記數(shù)法計數(shù)，活菌數(shù)為6.5×107cfu/mL。

107cfu/mL接種方式為取25mL種子液，8000r/min離心15min，用無菌水洗滌2次后，將菌泥接入100mL發(fā)酵液中。H.anomala在發(fā)酵液中初始活菌數(shù)為1.88× 107cfu/mL，sy釀酒酵母初始活菌數(shù)為1.63×107cfu/mL。105cfu/mL、103cfu/mL接種方式為將上述種子液稀釋至相應倍數(shù)接入。

1.2.2野木瓜果酒釀造工藝

操作要點：挑選成熟無霉變的野木瓜，清洗、去皮籽、切碎，按1∶1加水打漿，制成野木瓜汁，加入0.02%果膠酶，45℃處理3～4h，再加入一定量偏重亞硫酸鈉，攪拌均勻。添加蔗糖、碳酸氫鉀，調(diào)整野木瓜汁外觀糖度為22oBrix，適當pH值，準備接種發(fā)酵。取調(diào)整好的野木瓜汁100mL置于150mL發(fā)酵錐形瓶中，調(diào)節(jié)發(fā)酵溫度，接入酵母，同時加入0.3 g/L酵母營養(yǎng)添加物。發(fā)酵至外觀糖度不變時，即為主發(fā)酵結(jié)束。分離酵母，密封酒液，置于4℃冰箱中保存［7］。

1.2.3香氣提取方法（固相微萃取法）

取8mL酒液放入20mL萃取瓶中，加入2 g NaCl促進香氣的揮發(fā)，加入20 μL2-辛醇（濃度為0.4914 mg/mL）作內(nèi)標，用聚四氟乙烯隔墊密封，于45℃下水浴平衡15min后，插入活化好的萃取頭，推出纖維頭，頂空吸附40min后，插入到GC進樣口解析5min。

GC條件：DB-5MS石英毛細管柱（30m×0.25 mm× 0.25μm）；進樣口溫度為230℃；升溫程序：35℃保持4min，以5℃/min升至55℃，保持2min，再以8℃/min升至120℃，再以10℃/min升至230℃，保持4min。載氣為氦氣，流速1mL/min，壓力47.7 kPa。分流比為5∶1。

MS條件：電離方式EI；電子能量70 eV；離子源溫度230℃；采集模式：全掃描；四級桿溫度150℃；質(zhì)量掃描范圍m/z 40～450；掃描速率769 u/s。

1.2.4總酯含量的測定

安琪sy釀酒酵母釀造出的野木瓜酒［7］主要酯類物質(zhì)為乙酸異戊酯、己酸乙酯、苯甲酸乙酯、辛酸乙酯、乙酸苯乙酯、癸酸乙酯、反式-4-癸烯酸乙酯、月桂酸乙酯、棕櫚酸乙酯?？傰ビ洖樯鲜?種酯類物質(zhì)之和。各組分含量采用內(nèi)標法進行半定量，2-辛醇為內(nèi)標物。

計算公式：香氣成分的含量=f（校正因子）×各組分的峰面積×內(nèi)標樣濃度/內(nèi)標樣的峰面積（校準因子設為1）［8］。

1.2.5單因素實驗

改變混菌方式、接種量、發(fā)酵溫度、SO2添加量、pH值中的一個因素，固定其他因素不變，進行單因素實驗。因素水平如下：pH值（3.00、3.25、3.50、3.75、4.00）；SO2添加量（80 mg/L、100 mg/L、120 mg/L、140 mg/L、160 mg/L）；發(fā)酵溫度（15℃、18℃、20℃、22℃、25℃）；混菌方式（同時接種、間隔3d接種、間隔5d接種、間隔10d接種和間隔15d接種）；接種量（2種酵母分別為103cfu/mL、105cfu/mL、107cfu/mL）。

1.2.6響應面優(yōu)化實驗

根據(jù)單因素實驗結(jié)果，選擇合適的因素水平進行響應面實驗設計，以獲得最高總酯含量。利用Design-Eepert8.0.6軟件中的多元二次回歸方程擬合因素與響應值之間的關系，通過分析回歸方程得出最佳工藝及最大響應值。

計算公式為Y=a+i=1kbxi+j=1kcxj2+dxixj，式中Y為預測值，a為常數(shù)項，b為一次項系數(shù)，c為二次項系數(shù)，d為交互作用項系數(shù)。

2結(jié)果與分析

2.1單因素實驗結(jié)果與分析

pH值對總酯含量的影響：混菌方式為同時接種，異常漢遜酵母與安琪sy果酒酵母的接種量均為107cfu/mL，發(fā)酵溫度為22℃，SO2添加量為100 mg/L的條件下，用碳酸氫鉀調(diào)節(jié)野木瓜發(fā)酵汁pH值為3.00、3.25、3.50、3.75、4.00，探討pH值對總酯含量的影響。由圖1可知，野木瓜果酒的總酯含量隨著pH值的增大呈先增大后下降的趨勢。pH值為3.5時，總酯含量最大，為8.30 mg/L；pH值在3.00～3.50之間時，總酯含量增大，原因是酵母在過酸條件下生長代謝受到抑制，隨著pH值的增大，酵母生長逐漸恢復正常。當pH值增大到3.50以上時，總酯含量反而開始降低，這是因為酯類化合物產(chǎn)生途徑之一為酸類化合物與醇類化合物在酯酶作用下縮合而成［9］，碳酸氫鉀調(diào)節(jié)pH值的過程中，會中和部分有機酸，導致總酯含量降低。

圖1 pH值對野木瓜果酒總酯含量的影響

SO2添加量對總酯含量的影響：混菌方式為同時接種，異常漢遜酵母與安琪sy果酒酵母的接種量均為107cfu/mL，發(fā)酵溫度為22℃，pH3.50，用偏重亞硫酸鈉調(diào)節(jié)SO2添加量為80 mg/L、100 mg/L、120 mg/L、140 mg/L、160 mg/L，探討SO2對總酯含量的影響。由圖2可知，在一定范圍內(nèi)（120 mg/L以下），總酯含量無明顯變化，繼續(xù)增加SO2添加量，總酯含量逐漸降低。這是因為SO2的添加抑制了發(fā)酵初期生長旺盛的異常漢遜酵母，而對sy釀酒酵母影響較小，非釀酒酵母對于酯類物質(zhì)的產(chǎn)生更有意義［10］。SO2添加量過低會存在食品安全風險，因此SO2添加量選為100 mg/L。

圖2 SO2添加量對野木瓜果酒總酯含量的影響

發(fā)酵溫度對總酯含量的影響：混菌方式為同時接種，異常漢遜酵母與安琪sy果酒酵母的接種量均為107cfu/mL，發(fā)酵溫度為22℃，SO2添加量為100 mg/L時，探討發(fā)酵溫度分別為15℃、18℃、20℃、22℃、25℃對野木瓜果酒總酯含量的影響。由圖3可知，總酯含量在上述溫度區(qū)間內(nèi)，隨溫度的升高先增加再減少。18℃條件下，產(chǎn)酯量最高，為15.14 mg/L。15℃、18℃、20℃產(chǎn)酯量明顯高于22℃、25℃，這是因為低溫發(fā)酵趨向于產(chǎn)生更多的酯類化合物，Molina A.M［11］對比了15℃和28℃發(fā)酵溫度下的葡萄酒總酯含量（包括乙酯類化合物和乙酸酯類化合物），發(fā)現(xiàn)前者比后者高出88.55%。圖3中，15℃總酯含量低于18℃，可能是因為低溫抑制了酵母的生長，導致發(fā)酵不徹底，15℃發(fā)酵出的果酒殘?zhí)牵?.32 mg/mL）高于18℃（6.78 mg/mL）也證實了這一點。

圖3發(fā)酵溫度對野木瓜果酒總酯含量的影響

混菌方式對總酯含量的影響：異常漢遜酵母與安琪sy果酒酵母的接種量均為107cfu/mL，發(fā)酵溫度為22℃，pH3.50，SO2添加量為100 mg/L時，根據(jù)果酒發(fā)酵降糖規(guī)律，設定2種酵母同時接種、間隔3d接種、間隔5d接種、間隔10d接種和間隔15d接種，探討混菌方式對總酯含量的影響。由圖4可知，總酯含量隨酵母接種間隔時間的延長，呈先增加后減少的趨勢。先接種異常漢遜酵母，間隔3d接種釀酒酵母所釀制的野木瓜果酒產(chǎn)酯最高，為13.32 mg/L。間隔3d、5d發(fā)酵果酒酯類物質(zhì)高于同時接種發(fā)酵果酒，說明順序發(fā)酵優(yōu)于同時發(fā)酵，順序發(fā)酵更接近傳統(tǒng)葡萄酒釀造過程中酵母種群數(shù)量變化規(guī)律［12-13］。另外，2種酵母接種間隔時間過長，也不利于產(chǎn)酯。綜合考慮，選擇間隔3d接種的順序發(fā)酵方式進行混菌發(fā)酵實驗。

圖4混菌方式對野木瓜果酒總酯含量的影響

接種量對總酯含量的影響：混菌方式為同時接種，發(fā)酵溫度為22℃，pH3.50，SO2添加量為100 mg/L時，依據(jù)Comitini F等［14］混菌發(fā)酵接種量，探討異常漢遜酵母與安琪sy果酒酵母的接種量分別為103cfu/mL、105cfu/mL、107cfu/mL時對總酯含量的影響。由表1可知，sy接種量取一定值，異常漢遜酵母接種量增大時，總酯含量并無明顯提高（p＞0.05）。反之，異常漢遜酵母接種量一定時，sy接種量增大時，總酯含量變化也不顯著（p〉0.05），但其還原糖含量顯著降低（p=0.025＜0.05），當安琪sy果酒酵母接種量達到107cfu/mL時，殘?zhí)呛枯^低，表明其發(fā)酵完成度較高。選擇安琪sy果酒酵母接種量為107cfu/mL，異常漢遜酵母分別為103cfu/mL、105cfu/mL、107cfu/mL，進行響應面分析實驗。

表1接種量對總酯含量及還原糖含量的影響

2.2響應面優(yōu)化實驗

在單因素實驗的結(jié)果基礎之上，選取接種量（異常漢遜酵母分別為103cfu/mL、105cfu/mL、107cfu/mL，安琪sy果酒酵母為107cfu/mL）、溫度（16℃、18℃、20℃）、pH值（3.40、3.50、3.60）為自變量，以總酯含量作為響應值，根據(jù)Box-Behnken實驗設計原理設計3因素3水平的響應面實驗。實驗方案及結(jié)果見表2。

對響應面實驗結(jié)果進行多元線性回歸和二項式擬合，得到關于Y的回歸方程：

表2響應面實驗設計及結(jié)果

Y=19.18-0.73A-1.52B+0.30C+0.46AB-0.44AC+ 0.24BC-1.50A2-1.34B2-0.26C2。

式中：A表示異常漢遜酵母接種量，B表示發(fā)酵溫度，C表示發(fā)酵初始液pH值。

表3響應面分析法對總酯含量的方差分析

由表3可知，以總酯含量為響應值時，模型p＜0.01，表明二次方程模型極顯著。失擬項p=0.1911＞0.05不顯著，說明回歸方程擬合度較高，數(shù)學模型穩(wěn)定，可用該數(shù)學模型對不同發(fā)酵條件下野木瓜果酒中的總酯含量進行預測。方程相關系數(shù)為R2=0.9794，表明該模型反映97.94%的因變量與自變量的關系。

由p值可知，一次項A、B和二次項A2、B2對野木瓜果酒的總酯含量影響極顯著（p＜0.01），二次項AB、AC影響顯著（p＜0.05），C、BC、C2影響不顯著（p＞0.05）。根據(jù)F值，判斷各因素對總酯含量的影響大小依次為溫度、接種量、pH值，說明溫度對于總酯含量的影響最顯著。

響應面圖的曲面坡度越大，則因素的改變對于響應值的影響越顯著，表明兩因素交互作用對響應值的影響越大。反之，響應面圖曲面越平緩，則因素對于響應值的影響不顯著，兩因素交互作用對響應值的影響較小。等高線直觀地反映出兩個因素之間交互作用的顯著程度，其中橢圓越扁平或橢圓的軸線與坐標軸之間角度越大，則表明兩因素交互作用越顯著，反之，則不顯著［15-16］。根據(jù)上述性質(zhì)圖5—圖7可知，接種量與溫度、接種量與pH值交互作用顯著，而接種量與溫度交互作用不顯著。在因素所考察的范圍內(nèi)，總酯含量隨著溫度、接種量的增加，先增加后減小。而在pH3.40～3.60范圍內(nèi)，其改變對總酯含量影響不顯著。這與表3方差分析結(jié)果一致。

表4混菌發(fā)酵與單菌發(fā)酵野木瓜果酒主要酯類物質(zhì)含量比較

圖5接種量與溫度對總酯含量影響的等高線和響應面圖

圖6接種量和pH值對總酯含量影響的等高線和響應面圖

圖7溫度與pH值對總酯含量影響的等高線和響應面圖

2.3驗證性實驗

圖5—圖7反映了響應面圖在考察因素范圍內(nèi)存在極值，通過Design-Expert8.0.6軟件進行驗證優(yōu)化，得到野木瓜果酒總酯含量最高時的工藝參數(shù)：接種量為4.36 Log cfu/mL、溫度為17.63℃、pH3.54，預測的總酯含量達到19.64 mg/L。結(jié)合實際情況，驗證實驗設置時間為間隔3d接種、異常漢遜酵母接種量為105cfu/mL、溫度為18℃、SO2添加量為100 mg/L、pH3.55，總酯含量達到19.350 mg/L±0.712 mg/L，與響應面的預測值接近，說明該模型可用于預測混菌發(fā)酵野木瓜果酒總酯含量。經(jīng)優(yōu)化后的混菌發(fā)酵野木瓜果酒比未優(yōu)化前單菌發(fā)酵的總酯含量（7.165 mg/L±0.325 mg/L）高出1.7倍之多，證明通過混菌發(fā)酵提高野木瓜果酒總酯含量，所以改善野木瓜果酒香氣品質(zhì)的措施可行。單菌發(fā)酵野木瓜果酒與混菌發(fā)酵優(yōu)化工藝后野木瓜果酒各酯類化合物含量見表4。從表4中也可看出各種酯類化合物的含量都有了顯著的提高。

3　結(jié)論

本研究通過單因素實驗與響應面實驗，建立了混菌發(fā)酵野木瓜果酒總酯含量的多元二次回歸方程：Y= 19.18-0.73A-1.52B+0.30C+0.46AB-0.44AC+0.24BC-1.50A2-1.34B2-0.26C2，并確定了混菌發(fā)酵的最優(yōu)工藝參數(shù)：間隔3d接種（異常漢遜酵母接種3d之后接種sy釀酒酵母）、異常漢遜酵母接種量為1.88×105cfu/mL、sy釀酒酵母接種量為1.63×107cfu/mL，溫度為18℃，SO2添加量為100 mg/L，pH3.55，在此工藝條件下，發(fā)酵釀出的野木瓜果酒總酯含量達到19.350 mg/L±0.712 mg/L。與未優(yōu)化前單菌發(fā)酵野木瓜果酒相比總酯含量提高了1.7倍。證實了通過混菌發(fā)酵改善野木瓜果酒香氣措施的可行性，為高品質(zhì)野木瓜果酒的生產(chǎn)提供了一定的理論依據(jù)。

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Optimization of Mixed Bacteria Fermentation of Stauntonia chinensis Wine by Response Surface Method

WEI Guangxin1，ZHANG Dan1，ZENG Fankun1，ZHOU Yongwen2and ZHANG Weiguang1
（1.College of Food Science，Southwest University，Chongqing 400715；2.Chongqing Jinlifang Winery Co.Ltd.，Chongqing 401420，China）

Abstract:In this study，mixed bacteria fermentation of Stauntonia chinensis wine was optimized by single factor test and response surface method.The effects of mixed bacteria mode，inoculating quantity，addition level of SO2，fermenting temperature and pH value on total esters content were explored.The results showed that，under condition of inoculation at a three-day interval（Sy Saccharomyces cerevisiae inoculated 3d after H.anomala inoculation and their inoculating quantity were 107cfu/mL and 105cfu/mL respectively），fermenting temperature at 18℃，pH3.55，and the addition level of SO2=100 mg/L，total esters content in the produced Stauntonia chinensis wine reached up to 19.350 mg/L± 0.712 mg/L，1.7 times higher than that in Stauntonia chinensis wine fermented by pure yeast strain.

Key words:Stauntonia chinensis wine；mixed bacteria fermentation；total esters；response surface method；fruit wine

中圖分類號：TS262.7；TS261.4；TS261.1

文獻標識碼：A

文章編號：1001-9286（2016）06-0097-05

DOI：10.13746/j.njkj.2016041

基金項目：重慶市科委應用開發(fā)項目“皺皮木瓜發(fā)酵酒品質(zhì)提升與產(chǎn)業(yè)化”，立項編號：cstc2013yykfB0174。

收稿日期：2016-02-03

作者簡介：韋廣鑫（1990-），男，碩士研究生，研究方向：食品生物技術，E-mail：415516496@qq.com。