帕金森病大鼠模型制作方法研究進展

陳子方，吳海妹，沈凡藝，譚慧，郭沛鑫，解宇環(huán)

云南中醫(yī)藥大學，昆明650500

帕金森?。≒D）是一種多發(fā)于中老年的、最常見的神經(jīng)退行性病變之一。PD 病因及機制極其復(fù)雜，目前多巴胺（DA）神經(jīng)元變性壞死所導(dǎo)致的多巴胺分泌嚴重不足被認為是主要發(fā)病原因。PD 患者?？梢娚窠?jīng)元內(nèi)α-突觸核蛋白（α-SYN）及路易小體的積聚。PD 的發(fā)病機制、新型治療方案及藥物等一直是該領(lǐng)域研究熱點，上述研究也推動了契合臨床的PD 模型研究。PD 的靈長類動物模型能較好模擬臨床癥狀，但花費較多，不利于前期的藥物篩選和實驗研究；而某些嚙齒類小動物如小鼠等由于其腦部體積較小，不易區(qū)分相關(guān)腦區(qū)，手術(shù)操作難度較大，針對特定腦區(qū)的研究存在局限性。PD 大鼠模型制作經(jīng)濟實惠且能較好模擬臨床病變。本課題組前期研究也發(fā)現(xiàn)，在某些PD 模型如6-羥基多巴胺（6-OH?DA）所致的PD 模型復(fù)制過程中，大鼠的存活率和造模成功率明顯高于小鼠，且操作更為簡便。目前常用PD大鼠模型主要有有神經(jīng)毒素誘導(dǎo)模型、脂多糖誘導(dǎo)模型、轉(zhuǎn)基因模型、基因敲除模型、蛋白酶體抑制劑誘導(dǎo)模型、乙型腦炎病毒所致模型等［1］?，F(xiàn)就常用PD大鼠模型制作方法相關(guān)研究進展進行綜述。

1 神經(jīng)毒素誘導(dǎo)的PD模型

1.1 6-OHDA 誘導(dǎo)的PD 模型 6-OHDA 可以引起線粒體融合蛋白的改變，干擾線粒體持續(xù)的融合、分裂和運動，干擾ATP 合成，最終導(dǎo)致DA 神經(jīng)元死亡。6-OHDA 不能穿過血腦屏障，造模時需采用腦立體定位儀將6-OHDA 注射于特定腦區(qū)。有文獻報道，采用單側(cè)兩點法造模成功率高于一點法，其具體方法為：將麻醉后的大鼠固定于腦立體定位儀上，以0.2% 6-OHDA（溶于0.02% 抗壞血酸溶液，防止6-OHDA 氧化）注射到右側(cè)的黑質(zhì)致密部位（SN），兩個注射點相對于前囟的內(nèi)側(cè)、硬腦膜腹側(cè)的表面坐標如下：坐標1 為前囟后（PB）3.0 mm，中位右側(cè)（MRL）2.5 mm，腹側(cè)硬腦膜下（VD）8.6 mm；坐標2為PB 2.4 mm，MRL 2.7 mm，VD 8.6 mm。在注射6-OHDA 2 周后注射0.01% 阿樸嗎啡10 mL/kg 誘導(dǎo)大鼠旋轉(zhuǎn)行為，轉(zhuǎn)速超過7圈/min（Φ 35cm/輪）判定為造模成功［2］。

有研究發(fā)現(xiàn)，6-OHDA 可產(chǎn)生不穩(wěn)定抑郁癥狀［3］，向Wistar 大鼠腦內(nèi)定向注射6-OHDA，術(shù)后2周表現(xiàn)為蔗糖偏好增強，術(shù)后3 周出現(xiàn)明顯的抑郁癥狀，因此6-OHDA 可用于制作PD 伴急、慢性抑郁（PDD）模型。KAMINSKA 等［4］認為在大鼠內(nèi)側(cè)前腦束注入高劑量6-OHDA（16 μg/4 μL）可誘發(fā)神經(jīng)和行為學改變，較適用于建立晚期PDD 模型。邢紅霞等［5］在6-OHDA 所致PD 模型的基礎(chǔ)上，通過給予大鼠急性強迫游泳，制作PD 伴急性抑郁模型；通過慢性不可預(yù)見性的溫和應(yīng)激制作PD伴慢性抑郁模型。研究發(fā)現(xiàn)，上述兩組模型無論動物行為學還是單胺類神經(jīng)遞質(zhì)變化都與PD模型差異不大，推測PDD的成模機制可能以內(nèi)源性因素6-OHDA起主導(dǎo)作用。

1.2 1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氫吡啶（MPTP）誘導(dǎo)的PD 模型 MPTP 因其脂溶性可快速通過血腦屏障，其毒性機制與其在腦內(nèi)生成活性物質(zhì)甲基苯基吡啶離子（MPP+）、抑制線粒體復(fù)合物Ⅰ的活性并導(dǎo)致DA 神經(jīng)元變性及凋亡有關(guān)。曾朝蓉等［6］對雄性SD 大鼠腹腔注射MPTP（30 mg/kg，7 d），結(jié)果顯示，大鼠運動功能減退，直接膽紅素水平降低，血紅蛋白、紅細胞、白細胞、中性粒細胞升高，中腦黑質(zhì)出現(xiàn)病理變化。

1.3 魚藤酮誘導(dǎo)的PD模型 魚藤酮是線粒體復(fù)合物Ⅰ抑制劑，脂溶性高，易通過血腦屏障，且無需轉(zhuǎn)運即可進入DA 神經(jīng)元。其毒性機制包括增強氧化應(yīng)激、誘導(dǎo)α-SYN 積聚致使DJ-1 和Parkin 突變，導(dǎo)致線粒體和蛋白酶體功能障礙，最終引起DA 神經(jīng)元凋亡。魚藤酮模型增強了DA 通路中的氧化應(yīng)激和神經(jīng)炎癥，能涵蓋PD 的大部分病理特征［7］。注射魚藤酮誘導(dǎo)大鼠PD模型的方式可分為皮下注射、腹腔注射、靜脈注射和紋狀體定位注射。

1.3.1 皮下注射 有文獻報道，在SD 大鼠頸后皮下注射魚藤酮（2 mg/kg，4 周），大鼠運動緩慢、次數(shù)減少，伴震顫、不穩(wěn)定的步態(tài)，黑質(zhì)致密部有明顯的α-SYN 積聚［8-9］；魚藤酮注射量在2 mg/kg 以上，大鼠體質(zhì)量出現(xiàn)明顯下降，酪氨酸羥化酶（TH）免疫反應(yīng)神經(jīng)元數(shù)量顯著減少，且皮下注射2 mg/kg 魚藤酮有利于α-SYN形成。

1.3.2 腹腔注射 實驗表明，對大鼠連續(xù)腹腔注射魚藤酮（2 mg/kg、4周，或1.5 mg/kg、2月，或2.5 mg/kg、2 月），大鼠體質(zhì)量減輕，紋狀體和前額葉皮層分泌的DA 減少，紋狀體TH 的免疫反應(yīng)活性降低［10］。但也有學者［11］發(fā)現(xiàn)，對大鼠腹腔注射2 mg/（kg·d）的魚藤酮、5 d/周、連續(xù)6周，沒有導(dǎo)致大鼠運動障礙或黑質(zhì)紋狀體DA 神經(jīng)元病變，反而引起了以胃腸功能障礙為表現(xiàn)的非運動癥狀。

1.3.3 靜脈注射 對大鼠靜脈注射相對高劑量魚藤酮（10～18 mg/kg，7～9 d），大鼠出現(xiàn)運動障礙、紋狀體和蒼白球損傷；注射相對低劑量魚藤酮（2 mg/kg或2.5 mg/kg或3 mg/kg，21 d），大鼠出現(xiàn)運動遲緩，其中2 mg/kg 組并未顯示TH 免疫活性降低，但隨著魚藤酮劑量增加，24% 的大鼠出現(xiàn)TH 免疫活性降低［12］。靜脈注射操作簡便、藥效迅速，但也容易增加大鼠因臟器系統(tǒng)毒性死亡的概率。

1.3.4 紋狀體注射 有研究者將魚藤酮溶解在DMSO、聚氧乙烯蓖麻油和生理鹽水的混合溶劑中，以三點分別定向注射4 μg/2 μL 的魚藤酮溶液到雄性SD大鼠右側(cè)紋狀體，發(fā)現(xiàn)該模型使大鼠紋狀體和黑質(zhì)中TH 免疫活性降低，且能保持大鼠100% 的存活率［13］。

2 脂多糖（LPS）誘導(dǎo)的PD模型

LPS 是革蘭陰性菌細胞壁的主要成分，是重要的內(nèi)毒素。LPS 不能透過血腦屏障，通過腦內(nèi)定位注射而誘導(dǎo)的神經(jīng)炎癥可以復(fù)制PD的部分特征，包括小膠質(zhì)細胞過度激活引起的機體炎癥反應(yīng)及黑質(zhì)紋狀體系統(tǒng)DA神經(jīng)元的選擇性損傷。

2.1 黑質(zhì)內(nèi)注射 黑質(zhì)區(qū)域定位注射LPS 可特異性地激活黑質(zhì)區(qū)域的小膠質(zhì)細胞，排除因其他神經(jīng)退行性疾病所致小膠質(zhì)細胞激活帶來的干擾［14］。HERRERA 等［15］通過立體定位注射2.0 μL 的LPS 至Wistar 雄性大鼠的黑質(zhì)，發(fā)現(xiàn)大鼠TH 免疫活性降低，DA神經(jīng)元受損，且損害不可逆。

2.2 注射至蒼白球 實驗證明，將LPS（10 μg/4 μL）注射到大鼠蒼白球兩坐標，大鼠出現(xiàn)黑質(zhì)紋狀體系統(tǒng)中TH 陽性神經(jīng)元減少、小膠質(zhì)細胞持續(xù)激活、黑質(zhì)中α-SYN 積聚增強等病理變化，其變化程度隨著大鼠年齡的增長更顯著，側(cè)面論證了老齡化是PD誘因之一的觀點［16-17］。

2.3 紋狀體內(nèi)注射 有學者將LPS 分4 個坐標（3μL/坐標）注射到雄性SD 大鼠右側(cè)紋狀體，實驗結(jié)果顯示，大鼠黑質(zhì)內(nèi)DA 神經(jīng)元減少，神經(jīng)元內(nèi)α-SYN和泛素蛋白積聚，大鼠出現(xiàn)行為學障礙［18］。

2.4 腦室內(nèi)注射 李軍泉等［19］在雄性SD大鼠前囟后0.8 mm、旁開1.3 mm、硬膜下3.5 mm 處，立體定位分別向腦室內(nèi)注射LPS 10、25、50 μg，發(fā)現(xiàn)腦室內(nèi)炎癥反應(yīng)促使黑質(zhì)部位小膠質(zhì)細胞被廣泛激活，且至24 周仍呈現(xiàn) 不同程 度 的激活。ZHOU 等［20］將25 μg LPS 立體定向注射到SD 大鼠右側(cè)腦室，結(jié)果表明，LPS 注射到側(cè)腦室內(nèi)相較于注射到黑質(zhì)致密部位（SN）或紋狀體內(nèi)局部區(qū)域，能更好地模擬PD的進行性病變過程。

3 轉(zhuǎn)基因PD模型和基因敲除PD模型

PD 以散發(fā)性為主，約10%～15% 呈家族性。PD遺傳基因相關(guān)研究顯示，至少有20個位點和15個致病基因與家族性和散發(fā)性PD相關(guān)［21］。提示PD存在潛在的基因治療靶點。隨著哺乳動物基因組工程和技術(shù)的發(fā)展以及病毒表達載體的優(yōu)化，能夠運用的PD 轉(zhuǎn)基因大鼠模型和基因敲除大鼠模型也逐漸增多。雖然使大鼠誘發(fā)基因突變的難度大于小鼠，且無法完全復(fù)制人類疾病的各種特征，但大鼠模型能更好地再現(xiàn)PD 的典型特征，包括黑質(zhì)DA 神經(jīng)元的進行性損害、局部運動行為缺陷和年齡依賴性的α-SYN異常積聚，其中以α-SYN異常積聚最為明顯［22］。因此，轉(zhuǎn)基因或基因敲除大鼠模型可能有更大的研究價值。

3.1 轉(zhuǎn)基因PD模型

3.1.1 LRRK2轉(zhuǎn)基因模型 LRRK2是位于細胞膜上的多結(jié)構(gòu)域蛋白。攜帶LRRK2 基因突變者發(fā)展為PD的可能性隨著年齡的增長而增高。尸檢發(fā)現(xiàn)，大多數(shù)LRRK2 突變的PD 患者腦內(nèi)有α-SYN 包涵體，表明LRRK2與α-SYN 所致PD 發(fā)病有共同機制。有研究將不同量的純化LRRK2p.G2019S 稀釋于微量注射緩沖液后注入SD大鼠受精卵的原核中，培育出的雄性BACLRRK2 p.G2019S 大鼠出生后3、6、12月運動能力逐漸降低，但12 月齡時紋狀體DA 功能無異常，TH 表達也無明顯變化，推測LRRK2 突變可能是PD發(fā)病原因的一部分，可能需要其他基因或環(huán)境共同作用，包括神經(jīng)變性、DA 分泌減少在內(nèi)的PD典型特征可能發(fā)生在晚期［23］。研究者認為，雖然上述LRRK2p.G2019S 大鼠沒有成為典型的PD 模型，但它們?nèi)匀皇茄芯縇RRK2 相關(guān)神經(jīng)生物學病變的有用資源［24］。相反的，另有研究者把人LRRK2R1441G基因注入到SD 大鼠受精卵的原核中，大鼠出生后3、6、9、12 月均表現(xiàn)出PD 相關(guān)的運動缺陷；大鼠12月齡時給予腹腔注射百草枯2 次，至16 月齡才出現(xiàn)明顯的運動缺陷，且沒有表現(xiàn)出受百草枯影響的傾向，故研究者認為轉(zhuǎn)基因LRRK2R1441GBAC 大鼠不是PD的可行模型［25］。

3.1.2 α-SYN 轉(zhuǎn)基因模型 α-SYN 與PD 發(fā)病密切相關(guān)，α-SYN 通常以無結(jié)構(gòu)狀態(tài)存在于突觸前膜，具有調(diào)節(jié)突觸可塑性、整合突觸前信號等功能。α-SYN 突變是常染色體顯性遺傳PD 的罕見形式，目前已發(fā)現(xiàn)3 種突變形式，包括A30P、A53T、E46K。突變的α-SYN 容易產(chǎn)生錯誤折疊，進而可引起細胞損傷。有學者［26］在Wistar大鼠黑質(zhì)部位注射攜帶A53Tα-SYN 的重組腺相關(guān)病毒的載體溶液3 μL，21 d 后觀察到大鼠出現(xiàn)明顯運動障礙；28 d 后發(fā)現(xiàn)大鼠注射部位對側(cè)（左）前爪使用率降低了50%；32 d后PET成像觀察到多巴胺轉(zhuǎn)運體結(jié)合率降低85%，免疫組化顯示黑質(zhì)中α-SYN 陽性聚集體形成。另有實驗利用腺相關(guān)病毒作為載體，將α-SYN基因遞送至雄性SD大鼠黑質(zhì)區(qū)，13周后經(jīng)皮下植入滲透性微型泵，并連續(xù)注入魚藤酮4周，大鼠出現(xiàn)典型的PD 三聯(lián)征（進行性運動功能障礙、黑質(zhì)紋狀體神經(jīng)變性、α-SYN 積聚），且受損神經(jīng)元對魚藤酮更加敏感［27］。

3.2 基因敲除PD 模型 Parkin 是由PARK2 基因編碼的一種蛋白，具有E3 泛素連接酶功能，參與泛素蛋白水解酶系統(tǒng)，有助于維持細胞正常生命活動，在PD的氧化應(yīng)激、線粒體損傷及蛋白酶體功能紊亂中也起到重要作用［28］。PINK1基因是第一個定位在線粒體上與PD 相關(guān)的基因，PINK1蛋白定位于線粒體膜的Ser/Thr 激酶，參與線粒體運輸、線粒體和蛋白酶體功能表達等過程，其正常表達可以減輕氧化應(yīng)激對線粒體功能的損害和蛋白酶抑制劑所致的細胞凋亡。DJ-1 作為抗氧化劑和分子伴侶，在體內(nèi)廣泛表達，其突變與常染色體隱性遺傳的早發(fā)PD 有關(guān)。DJ-1 可通過氧化應(yīng)激使蛋白酶體降解系統(tǒng)紊亂，并能將胞質(zhì)內(nèi)蛋白移至線粒體，致使線粒體功能異?；蚪档?。

DAVE 等［29］在4～5 周齡Long Evans Hooded 雌性大鼠體內(nèi)注射20 U 的妊娠馬血清促性腺激素，48 h后注射50 U 人絨毛膜促性腺激素，立即與雄性大鼠交配，1 d 后得到受精卵；將ZFN mRNA 以10 ng/μL注射到受精卵原核中，受精卵植入雌鼠體內(nèi)，產(chǎn)生第一代雜合鼠；篩選帶有所需基因的雜合鼠進行交配，最終得到純合子的Parkin、Pink1、DJ-1 基因敲除大鼠。與野生型（WT）大鼠進行比較，Pink1 敲除大鼠和DJ-1敲除大鼠從4月齡開始表現(xiàn)出明顯的運動缺陷，8 月齡時約50% 的DA 細胞喪失，出現(xiàn)黑質(zhì)神經(jīng)變性；而Parkin敲除大鼠沒有顯示出PD 相關(guān)病理表現(xiàn)。另外，Pink1 敲除大鼠和DJ-1 敲除大鼠不顯示臨床PD 表型的其他特征，腦區(qū)內(nèi)無α-SYN 積聚，但仍能夠?qū)е麓笫蠖喟桶纺苌窠?jīng)元變性［30-31］。

此外，還有學者用蛋白酶體抑制劑或乙型腦炎病毒誘導(dǎo)出PD 模型。張克忠等［32］將蛋白酶體抑制劑Lac tacystin 以兩點法立體定位注射到SD 雄性大鼠黑質(zhì)部位，大鼠1周后出現(xiàn)運動障礙且逐步加重、TH 陽性細胞數(shù)明顯減少、α-SYN 表達明顯增加，該模型具有穩(wěn)定、可重復(fù)、簡便易操作的特點，是目前認為比較接近PD 實際情況的模型。HAMAUE 等［33］將提取的乙型腦炎病毒株JaGAr-01 稀釋后加入MEM培養(yǎng)基內(nèi)，并注入出生13 d的Fischer大鼠黑質(zhì)區(qū)域，結(jié)果顯示黑質(zhì)內(nèi)TH 陽性DA 神經(jīng)元數(shù)目明顯減少，大鼠出現(xiàn)運動遲緩癥狀，但該方法造模的可行性及穩(wěn)定性有待進一步驗證?？傊?，目前用于科學研究的PD模型均存在一定局限性，并不能完全契合臨床的實際狀況。因此，在實際研究過程中，可采用多種模型結(jié)合、共同評價的方式進行。盡早構(gòu)建出穩(wěn)定、高度契合臨床的PD 模型，對PD 的發(fā)病機制、新型治療方案及藥物研究都至關(guān)重要。