基于核黃素磷酸鈉功能化MoS2納米片的電化學(xué)基因傳感器研究

聶思雨，韓天成，李遠(yuǎn)卓，王先洋，張 偉

(臨沂大學(xué) 化學(xué)化工學(xué)院，山東 臨沂 276000)

起催化作用的磷酸肌醇-3-激酶(PIK3CA)基因是人類(lèi)癌癥中最常見(jiàn)的突變基因之一，在癌癥的早期診斷、治療和預(yù)后判斷方面具有重要的價(jià)值。因此，越來(lái)越多的檢測(cè)PIK3CA基因突變的方法被用來(lái)準(zhǔn)確預(yù)測(cè)和診斷癌癥[1]。目前，基因突變的檢測(cè)常用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)這一方法。然而，PCR技術(shù)主要有樣品處理過(guò)程復(fù)雜、容易污染以及設(shè)備昂貴等缺陷。為了克服上述限制，近年來(lái)比色法、拉曼光譜法、熒光、化學(xué)發(fā)光和電化學(xué)法等方法已被用來(lái)測(cè)定基因突變[2]。在這些技術(shù)中，電化學(xué)生物傳感技術(shù)因其能在一定程度上極大地降低信號(hào)輸出的成本和復(fù)雜性，從而得到廣泛的應(yīng)用。

2D層狀過(guò)渡金屬硫族化合物(TMDCs)，化學(xué)通式為MX2。TMDCs層間通過(guò)范德瓦爾斯力層間生長(zhǎng)的。所以，塊材TMDCs可以像石墨烯一樣，被剝離成單層或者多層的納米片[3-4]。MoS2是TMDCs家族的典型代表，它是由Mo原子和S原子通過(guò)共價(jià)鍵合組成的層狀晶體，呈現(xiàn)出“三明治”結(jié)構(gòu)。納米尺寸的MoS2作為一種層狀材料，具有石墨烯類(lèi)似的結(jié)構(gòu)，更是具備比表面積大、生物相容性好、吸附能力強(qiáng)、易于修飾等特點(diǎn)。憑借上述優(yōu)異的性能，MoS2納米片近年來(lái)在光電子器件、催化、能量存儲(chǔ)等領(lǐng)域都有著廣泛的應(yīng)用，其在生物傳感分析方面更是存在著巨大的潛質(zhì)[5]。

作為維生素B2磷酸化衍生物的核黃素磷酸鈉(RFSP)已被用作一種高效分散劑，用于增加石墨烯納米薄片在水相中的穩(wěn)定性。在本研究中，由于MoS2納米片對(duì)具有共軛結(jié)構(gòu)的RFSP分子具有良好的物理吸附能力，因此RFSP被作為一種高性能的分散劑和穩(wěn)定劑，在水介質(zhì)中穩(wěn)定地分散MoS2納米片，通過(guò)MoS2納米片與新型自信號(hào)分子RFSP的有效結(jié)合構(gòu)建納米復(fù)合界面，用于核酸雜交的電化學(xué)檢測(cè)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑和儀器

RFSP(上海麥克林生化有限公司)；本體MoS2(南京先鋒納米材料科技有限公司)；DNA序列(上海生工生物工程有限公司)。實(shí)驗(yàn)中使用的所有試劑均為分析純，實(shí)驗(yàn)用水為超純水。CHI660E電化學(xué)工作站(上海辰華儀器有限公司)；玻碳電極(GCE，Φ=3 mm)及其修飾電極為工作電極；飽和甘汞電極為參比電極；鉑絲電極為對(duì)電極；JEM-2100型透射電子顯微鏡(日本JEOL)。

1.2 修飾電極的制備

將10 mg本體MoS2加入10 mL濃度為1.0 g/L的RFSP水溶液中，然后超聲處理10 h。將獲得的懸浮液以12 000 r/min的速度離心處理30 min，循環(huán)操作兩次后，沉淀物被重新分散到超純水中，得到的RFSP/MoS2水分散液的濃度為1.0 g/L。將上述制備的RFSP/MoS2分散液滴涂在裸GCE表面上，室溫下風(fēng)干得到RFSP/MoS2/GCE。

1.3 DNA的固定和雜交

將制備的RFSP/MoS2/GCE浸入含有1.0×10-10mol/L ssDNA探針的0.3 mol/L的磷酸鹽緩沖液(PBS，pH值=7.0)中2 h，得到ssDNA/RFSP/MoS2/GCE。將含有互補(bǔ)DNA的雜交液(PBS，pH值=7.0)滴在ssDNA/RFSP/MoS2/GCE表面，進(jìn)行探針ssDNA與互補(bǔ)靶DNA的雜交。此外，ssDNA探針電極與非互補(bǔ)DNA、堿基錯(cuò)配DNA的雜交也通過(guò)類(lèi)似的步驟進(jìn)行。

1.4 電化學(xué)測(cè)量

循環(huán)伏安(CV)實(shí)驗(yàn)在濃度為0.3 mol/L PBS(pH值=7.0)中進(jìn)行，掃描速率為100 mV/s，電位掃描范圍為-1.0～-0.4 V。微分脈沖伏安(DPV)實(shí)驗(yàn)也在0.3 mol/L PBS(pH值7.0)中進(jìn)行，電位范圍從-0.95～-0.55 V，脈沖幅度為0.05 V，脈沖周期是0.2 s，脈沖寬度為0.06 s。

2 結(jié)果與討論

2.1 復(fù)合材料的透射電鏡表征

圖1為制備的RFSP/MoS2納米復(fù)合材料的透射電鏡圖(TEM)。

圖1 RFSP/MoS2的透射電鏡圖

從圖1可以看出，RFSP/MoS2納米復(fù)合材料呈現(xiàn)出褶皺的片狀結(jié)構(gòu)，沒(méi)有明顯的結(jié)塊。這表明RFSP是一種高性能的分散劑和穩(wěn)定劑，結(jié)合MoS2基面對(duì)具有芳香共軛結(jié)構(gòu)的RFSP的物理吸附作用，可以將MoS2納米片穩(wěn)定地分散在水中。

2.2 不同修飾電極的電化學(xué)行為

在0.3 mol/L PBS(pH值=7.0)溶液中，采用CV研究不同修飾電極的電化學(xué)特性，其結(jié)果如圖2所示。

a.裸GCE b.MoS2/GCE

在裸GCE(曲線(xiàn)a)和MoS2/GCE(曲線(xiàn)b)處沒(méi)有觀(guān)察到陽(yáng)極峰或陰極峰。但是，在RFSP/GCE(曲線(xiàn)c)處可以看到與RFSP的自身氧化還原反應(yīng)相對(duì)應(yīng)的一對(duì)氧化還原峰。由于MoS2納米片具有大的比表面積，從而可以明顯加速電子在RFSP和電極之間的傳輸，所以RFSP/MoS2/GCE(曲線(xiàn)d)的CV峰電流響應(yīng)比RFSP/GCE(曲線(xiàn)c)的CV響應(yīng)大得多。此外，以上結(jié)果表明RFSP通過(guò)物理吸附已經(jīng)被結(jié)合在MoS2納米片表面。

2.3 DNA固定和雜交的電化學(xué)表征

利用RFSP在0.3 mol/L PBS溶液中的自身氧化還原信號(hào)來(lái)監(jiān)測(cè)探針在RFSP/MoS2納米復(fù)合材料上的固定和雜交情況，結(jié)果如圖3所示。

a.RFSP/MoS2/GCE b.ssDNA/RFSP/MoS2/GCE

由于探針ssDNA的柔性結(jié)構(gòu)特征，可能會(huì)改變構(gòu)象并阻礙電子傳導(dǎo)，所以當(dāng)ssDNA探針通過(guò)其堿基與具有共軛結(jié)構(gòu)的RFSP/MoS2納米復(fù)合材料之間的π-π相互作用固定在納米復(fù)合界面上后，如曲線(xiàn)b所示，其氧化還原信號(hào)明顯降低。探針ssDNA與互補(bǔ)DNA雜交后，由于核酸堿基被包埋，形成的dsDNA從共軛納米復(fù)合物的表面脫落，其自信號(hào)(曲線(xiàn)c)較曲線(xiàn)b相比明顯增加。總之，RFSP分子的自信號(hào)變化可以直接來(lái)指示DNA的固定和雜交，不用引入任何外來(lái)的指示劑。

2.4 不同基因序列的選擇性識(shí)別

在0.3 mol/L PBS溶液中，通過(guò)探針修飾電極與PIK3CA基因相關(guān)的不同序列之間的雜交，研究了該生物傳感器的選擇性，結(jié)果如圖4所示。

曲線(xiàn)a為ssDNA/RFSP/MoS2/GCE的DPV響應(yīng)，當(dāng)探針ssDNA與互補(bǔ)DNA雜交后，dsDNA/RFSP/MoS2/GCE(曲線(xiàn)e)的DPV響應(yīng)顯著增加。ssDNA電極與非互補(bǔ)DNA雜交后的變化不明顯(曲線(xiàn)b)，表明幾乎沒(méi)有雜交。當(dāng)探針與單堿基錯(cuò)配DNA(曲線(xiàn)d)和三堿基錯(cuò)配DNA(曲線(xiàn)c)雜交時(shí)，其DPV信號(hào)與曲線(xiàn)e有明顯區(qū)別。以上結(jié)果表明，構(gòu)建的識(shí)別界面展現(xiàn)出良好的選擇性，可以區(qū)分不同的基因序列。

a.ssDNA/RFSP/MoS2/GCE b.探針電極與非互補(bǔ)DNA雜交 c.與三堿基錯(cuò)配DNA雜交后 d.與單堿基錯(cuò)配DNA雜交 e.dsDNA/RFSP/MoS2/GCE

2.5 不同濃度互補(bǔ)目標(biāo)DNA的定量測(cè)定

利用探針修飾電極與不同濃度的PIK3CA基因相關(guān)的互補(bǔ)目標(biāo)DNA雜交，探討了該生物傳感器的定量識(shí)別能力。如圖5所示。

a.ssDNA/RFSP/MoS2/GCE b.1.0×10-14 mol/L c.1.0×10-13 mol/L d.1.0×10-12 mol/L e.1.0×10-11 mol/L f.1.0×10-10 mol/L

當(dāng)互補(bǔ)目標(biāo)DNA濃度從1.0×10-14mol/L到1.0×10-10mol/L變化時(shí)，DPV峰電流響應(yīng)隨著濃度的增大而增強(qiáng)，其檢測(cè)限為2.3×10-15mol/L。該基于RFSP/MoS2納米復(fù)合材料的電化學(xué)生物傳感器展示了較低的檢測(cè)限和寬的線(xiàn)性范圍。

3 結(jié)論

本文設(shè)計(jì)了一種基于RFSP/MoS2納米復(fù)合材料的自信號(hào)電化學(xué)傳感平臺(tái)，用于檢測(cè)乳腺癌患者外周血中的循環(huán)腫瘤PIK3CA基因。RFSP分子不僅可以作為水介質(zhì)中MoS2納米片的有效分散劑，

而且還提供了識(shí)別核酸雜交的自身電化學(xué)自信號(hào)。該生物傳感器展示了良好的選擇性和較高的靈敏度，為下一步用于基因變異和疾病的診斷提供了思路。