化肥優(yōu)化對(duì)烤煙根際微生物及土壤酶的影響差異

武盼盼，劉書武，張曉寧

(1.河南省化工研究所有限責(zé)任公司，河南 鄭州 450052 ； 2.云南省煙草公司 文山州公司，云南 文山 663000 ； 3.中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué) 曲周試驗(yàn)站，河北 邯鄲 057250)

0 引言

煙草生長(zhǎng)發(fā)育必需的元素有19種，其中煙草需要量較大有的氮、磷、鉀等10種元素，需要的微量元素有硼、鎂等9種。必需的元素對(duì)煙草生長(zhǎng)發(fā)育非常重要，影響著煙草的生長(zhǎng)發(fā)育和產(chǎn)量[1]。但近年來(lái)隨著集約化農(nóng)業(yè)的發(fā)展和推廣應(yīng)用，依靠著農(nóng)業(yè)機(jī)械化的推進(jìn)、復(fù)種指數(shù)的增加、長(zhǎng)期無(wú)機(jī)肥料和化學(xué)農(nóng)藥的大量投入及有機(jī)肥比例的急劇減少，雖然大幅提高了煙草的產(chǎn)量，但對(duì)土壤中營(yíng)養(yǎng)元素的消耗量也逐年增加，土壤可持續(xù)性在不斷下降。逐漸出現(xiàn)大量元素的富營(yíng)養(yǎng)化，中、微量元素補(bǔ)充不足的問(wèn)題。

前期的土壤普查檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，土壤缺乏硼、鎂等中微元素且日益突出。鎂是煙草生長(zhǎng)發(fā)育的一種必需元素，作為酶、葉綠素等成分在植物體內(nèi)存在，并參與在逆境條件脅迫下的植物信號(hào)傳導(dǎo)[2]。植物缺鎂的主要癥狀就是失綠黃化，一旦缺鎂，就會(huì)破壞葉綠體結(jié)構(gòu)，損傷被膜，降低基粒數(shù)和類囊體數(shù)目，減弱植物葉片進(jìn)行光合作用的能力[3]。劉厚誠(chéng)等[4]認(rèn)為缺鎂會(huì)比較明顯影響到植物的光合作用，主要表現(xiàn)在葉片的光飽和點(diǎn)、光補(bǔ)償點(diǎn)降低，會(huì)明顯降低飽和光強(qiáng)下的最大凈光合速率。在植物體中，還參與光合作用、呼吸作用、糖酵解、三梭酸循環(huán)等過(guò)程，是這些過(guò)程中一些相關(guān)酶的活化劑。鎂對(duì)煙灰的凝結(jié)性、卷煙的燃燒性和煙葉色澤均有良好的作用。周冀衡等[2]研究發(fā)現(xiàn)，鎂能協(xié)調(diào)煙草化學(xué)成分，提高可溶性糖的含量，降低煙堿與蛋白質(zhì)含量，減少刺激性等影響煙葉的品質(zhì)。硼是煙草必需的一種微量元素，主要參與糖代謝與轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程，能夠促進(jìn)細(xì)胞分裂和細(xì)胞伸長(zhǎng)，促進(jìn)植物半纖維素、細(xì)胞壁的形成，對(duì)碳、氮和酚類代謝及木質(zhì)化作用有重要的調(diào)節(jié)作用，還能夠提高葉片的蒸騰速率和光合作用效率，促進(jìn)根系生長(zhǎng)發(fā)育，提高煙株的抗逆性。韋翔華等[5]研究發(fā)現(xiàn)硼能夠顯著促進(jìn)煙草花粉粒的萌發(fā)和植物花粉管的生長(zhǎng)。當(dāng)煙株缺硼時(shí)，就會(huì)抑制糖的合成，影響同化物的轉(zhuǎn)運(yùn)，從而使煙株中積累大量的淀粉和糖分，嚴(yán)重影響煙葉的品質(zhì)[6]。

這些元素的缺乏成為制約丘北煙區(qū)烤煙產(chǎn)量和品質(zhì)的重要因素。本實(shí)驗(yàn)以無(wú)機(jī)肥料的優(yōu)化配比對(duì)土壤酶活性、微生物數(shù)量和群落結(jié)構(gòu)及其代謝等主要生物學(xué)性狀的影響進(jìn)行研究。

1 材料與方法

1.1 研究區(qū)概況

試驗(yàn)地在云南省文山州丘北。海拔為1 465 m，年平均氣溫16.20 ℃，年降雨量1 174.2 mm，自然氣候優(yōu)越，立體氣候明顯，地勢(shì)平坦，灌溉方便。試驗(yàn)面積共0.13 hm2，前茬閑置，土壤類型為紅壤，質(zhì)地為中壤土，肥力均勻。供試品種為云煙87，在0～20 cm耕作層土壤養(yǎng)分含量和理化性質(zhì)見表1。

表1 供試土壤的基本理化性狀

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)設(shè)置 4 個(gè)處理：處理CK1，煙農(nóng)施肥量；處理Y，煙農(nóng)優(yōu)化施肥；處理T1，推薦施肥1；處理T2，推薦施肥2。每個(gè)處理設(shè)3次重復(fù)，共12個(gè)小區(qū)，采用單因素隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)。每個(gè)小區(qū)種煙30株，株行距為55 cm×110 cm，小區(qū)四周均設(shè)保護(hù)行。試驗(yàn)區(qū)大田管理措施按文山州優(yōu)質(zhì)煙葉生產(chǎn)技術(shù)規(guī)范進(jìn)行。具體施肥量如表2所示。

表2 實(shí)驗(yàn)施肥量

1.3 樣品采集

分別于煙苗移栽后35、75、118天3個(gè)時(shí)期采用五點(diǎn)取樣法選采樣點(diǎn)，在各處理小區(qū)去除表層土后用抖土法采集根際土并混勻?qū)⑼寥罉悠贩殖?份，其中過(guò)2 mm篩的一份新鮮土樣裝入無(wú)菌袋中，用冰盒帶回并保存于4 ℃冰箱，用于土壤微生物數(shù)量及群落功能多樣性的分析；另一份土樣風(fēng)干，磨細(xì)過(guò)830 μm(20目)篩后用于測(cè)定土壤脲酶、過(guò)氧化氫酶、酸性磷酸酶、蔗糖酶。

1.4 測(cè)定項(xiàng)目和方法

1.4.1土壤酶活性

土壤過(guò)氧化氫采用高錳酸鉀氧化法；土壤蔗糖酶活性、土壤脲酶活性、土壤酸性磷酸酶活性測(cè)定參照文獻(xiàn)[7]。

1.4.2微生物數(shù)量和群落功能多樣性

細(xì)菌、真菌、放線菌的數(shù)量用稀釋平板法，細(xì)菌用牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基、真菌用馬丁氏培養(yǎng)基、放線菌用高氏一號(hào)培養(yǎng)基培養(yǎng)[8]。研究不同施肥處理對(duì)土壤微生物群落功能多樣性的影響用Biolog-ECO微平板法，具體操作步驟參照文獻(xiàn)[9]。

1.5 數(shù)據(jù)處理

采用培養(yǎng)120 h的590 nm下的光密度值數(shù)據(jù)進(jìn)行土壤微生物碳源利用分析和主成分分析，平均每孔顏色變化率(AWCD)計(jì)算公式如(1)所示。

AWCD=∑[(Ai-A1)/31]

(1)

式中：Ai為第i個(gè)反應(yīng)孔的光密度值；A1是對(duì)照孔的光密度值。

功能多樣性指數(shù)：Shannon 指數(shù)(H)、Simpson指數(shù)(D)和McIntosh指數(shù)(U)，計(jì)算公式如(2)～(4)所示[15]。

H=-∑(PilnPi)

(2)

(3)

式中：Pi=(Ai-A1)/∑(Ai-A1)，表示第i孔的相對(duì)光密度值與整個(gè)微板相對(duì)光密度值總和的比值；N表示第i孔的相對(duì)光密度值(Ai-A1)。

采用Microsoft Excel 2010作圖表和SPSS 19.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，Duncan法對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行差異顯著分析處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 化肥優(yōu)化對(duì)烤煙根際微生物數(shù)量動(dòng)態(tài)變化

不同施肥處理根際土壤可培養(yǎng)微生物數(shù)量土壤微生物AWCD隨培養(yǎng)時(shí)間的變化見圖1。

CK：煙農(nóng)施肥；Y：煙農(nóng)優(yōu)化；T1：推薦1；T2：推薦2

從圖1的細(xì)菌數(shù)量上看，表現(xiàn)為先上升后下降的趨勢(shì)且在移栽后75 d的時(shí)候達(dá)到了峰值。從3個(gè)時(shí)期與對(duì)照CK相比，推薦2的各個(gè)時(shí)期的微生物數(shù)量都比較高且與其他處理達(dá)到了顯著水平，T1大體上要優(yōu)于Y，其兩者細(xì)菌的數(shù)量都好于CK且在移栽后75 d達(dá)到了顯著水平。細(xì)菌數(shù)量大小的大致表現(xiàn)為T2(推薦2)>T1(推薦1)>Y(煙農(nóng)優(yōu)化)>CK(煙農(nóng)施肥)，表明T1與T2均能增加烤煙根際的細(xì)菌數(shù)量，Y的總體上比CK好但兩者未達(dá)到顯著水平。

從圖1的放線菌數(shù)量結(jié)果看出，各個(gè)時(shí)期各個(gè)處理土壤放線菌的數(shù)量都有差異，隨著煙草生育期的推進(jìn)，是先上升后下降的現(xiàn)象。在整個(gè)生育期內(nèi)，以T1、T2的根際放線菌數(shù)量較高，在移栽后75 d放線菌較CK提高量達(dá)到了峰值，丘北較CK分別提高139.5%、113.8%。Y處理在放線菌數(shù)量都要好于CK且達(dá)到顯著水平(P<0.05)。放線菌的數(shù)量總體趨勢(shì)是T2、T1>Y>CK，說(shuō)明與CK相比，本實(shí)驗(yàn)的各個(gè)處理均能提高根際放線菌數(shù)量，總體以T1最佳。

由圖1的真菌數(shù)量上看，4個(gè)施肥處理均表現(xiàn)為在煙草移栽后75 d數(shù)量達(dá)到最大值后逐漸下降的趨勢(shì)。其中丘北的變化幅度比較大，丘北的T2各個(gè)時(shí)期的真菌數(shù)量都要少于各個(gè)處理且達(dá)到了顯著水平(P<0.05)。

2.2 化肥優(yōu)化對(duì)烤煙根際微生物群落代謝功能多樣性的影響

2.2.1根際土壤微生物對(duì)碳源總的利用能力(AWCD)的變化

AWCD反映的是隨時(shí)間的變化微生物對(duì)碳源利用強(qiáng)度的變化，也是微生物碳源代謝活性的一個(gè)關(guān)鍵指標(biāo)，數(shù)值越大微生物的代謝活性越大。AWCD值是與土壤微生物群落中能利用單一碳源的微生物種類和數(shù)目密切相關(guān)的。由圖1可以看出，各個(gè)處理的AWCD值在24～48 h的變化比較平穩(wěn)，在96～120 h快速上升以后進(jìn)入一個(gè)相對(duì)均衡的上升過(guò)程，因此采用120 h的數(shù)據(jù)進(jìn)行分析是比較能反應(yīng)微生物整體的活性的。在培養(yǎng)的192 h中，隨著煙草的生長(zhǎng)發(fā)育，各處理的土壤微生物AWCD值逐漸升高，表明微生物的整體代謝活性逐漸增強(qiáng)。其中，推薦2處理的 AWCD值總體上在各個(gè)時(shí)期不同的地方均表現(xiàn)為最高。表明在煙草的生長(zhǎng)過(guò)程中，推薦2處理會(huì)顯著提高微生物的代謝活性，增強(qiáng)其利用碳源的能力。而推薦1的AWCD 值在各個(gè)時(shí)期大致要略高于優(yōu)化處理且兩者都高于CK，說(shuō)明3個(gè)處理均能不同程度地提高根際微生物的整體代謝活性和數(shù)量。

2.2.2化肥優(yōu)化施肥措施下根際土壤微生物對(duì)不同類型碳源利用的差異

微生物對(duì)不同碳源的利用能力可表征土壤微生物的代謝功能類群。Biolog-ECO微平板上含有31種碳源，根據(jù)官能團(tuán)不同將其分為6大類，采用120 h的AWCD值計(jì)算得到微生物對(duì)6大類碳源的相對(duì)利用率圖譜。由圖2可知，在煙草的整個(gè)生育期內(nèi)，各處理碳源利用種類有很大差別，與CK相比，各個(gè)施肥處理均不同程度增加了糖類碳源、氨基酸類碳源。在移栽后55 d，各施肥處理的微生物均增加了糖類碳源、氨基酸類碳源的相對(duì)利用率，降低了羧酸類碳源的相對(duì)利用率。微生物在碳源的利用上增加了多胺碳源的相對(duì)利用。在移栽后75 d，各施肥處理均顯著增加了微生物對(duì)糖類碳源、氨基酸類碳源、羧酸類碳源的相對(duì)利用率。在采烤結(jié)束后，各施肥處理均顯著增加了微生物對(duì)氨基酸類碳源、羧酸類碳源的相對(duì)利用率。

CH：糖類；AA：氨基酸類；CA：羧酸類；PM：聚合物類；AM：胺類；PA：酚酸類

2.3 化肥優(yōu)化對(duì)烤煙根際土壤酶活性的影響

由圖2可見，在煙草整個(gè)生育期內(nèi)不同施肥處理的脲酶活性變化類似都是逐漸增加的，在移栽后75 d達(dá)到峰值后開始下降。在煙草的整個(gè)生長(zhǎng)發(fā)育時(shí)期3個(gè)施肥處理均要高于CK且達(dá)到顯著水平，酶活性的大小為T2>T1>Y，分別比CK最大增加為120.3%、88.3%、83.5%，說(shuō)明3個(gè)施肥處理均能提高土壤的脲酶活性，而T2處理在提高土壤酶活性比其他的處理有更加明顯的效果。

由圖2可以看出，各個(gè)時(shí)期各個(gè)處理的蔗糖酶活性是呈上升的趨勢(shì)，其中3個(gè)處理在3次采樣中的蔗糖酶活性都要高于CK且達(dá)到了顯著水平。蔗糖酶活性大體上為T2>T1、Y>CK，T2、T1、Y處理比CK最大提高分別為51.2%、48.1%、98.7%，說(shuō)明3個(gè)處理均能提高土壤蔗糖酶活性且T2增加的效應(yīng)更好。

磷酸酶主要來(lái)源于植物根系和土壤微生物的分泌物，對(duì)土壤中有機(jī)磷的水解有重要貢獻(xiàn)，其活性的高低甚至可以用作診斷植株磷素豐缺的指標(biāo)[10]。由圖2可得，在煙草的生育期內(nèi)各處理的土壤酸性磷酸酶活性變化的趨勢(shì)與脲酶類似都是先升高后下降。土壤酸性磷酸酶活性表現(xiàn)趨勢(shì)與蔗糖酶的表現(xiàn)趨勢(shì)大致相似，4個(gè)施肥處理在兩地的蔗糖酶活性總體上是T2>T1、Y>CK，其中與CK都達(dá)到了顯著性差異以T2處理的酸性磷酸酶活性最高，說(shuō)明3個(gè)處理均能增強(qiáng)烤煙土壤酸性磷酸酶活性。

3 結(jié)果與討論

微生物群落在土壤中是處于一個(gè)動(dòng)態(tài)平衡的過(guò)程，土壤理化因子的變化會(huì)影響其平衡，從而影響土壤微生物的活性及生態(tài)功能，進(jìn)而影響土壤肥力和環(huán)境質(zhì)量[11]。云南土壤的pH值偏酸性，化學(xué)肥料(主要是施氮、磷、鉀肥或氮、磷、鉀不同配比的復(fù)混肥)連年施用，許多研究表明，化肥的過(guò)量連續(xù)施用會(huì)降低土壤pH值，造成土壤酸化[12-13]。土壤的酸化導(dǎo)致土壤的碳氮比失衡及進(jìn)一步造成磷、硼、鈣、鎂等營(yíng)養(yǎng)元素的缺失，造成養(yǎng)分失衡問(wèn)題。對(duì)文山的土壤質(zhì)量進(jìn)行普查發(fā)現(xiàn)，土壤問(wèn)題之一是土壤B、Mg等元素偏低。B、Mg是植物生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中必需元素，它們涉及植物幾乎全部的新陳代謝過(guò)程，如氮、磷和碳初級(jí)和次級(jí)代謝，酶系統(tǒng)的運(yùn)作等，葉綠素的合成、激素信號(hào)傳導(dǎo)、基因調(diào)節(jié)、細(xì)胞的自我保護(hù)都需要微量元素的參與[14-17]。缺乏時(shí)嚴(yán)重影響作物的產(chǎn)量和品質(zhì)，這與土壤中缺乏相應(yīng)元素是密切相關(guān)的。土壤中這些元素含量對(duì)植物中這些元素含量有重要的直接影響。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，不同的化肥措施對(duì)煙草根際土壤微生物數(shù)量是不相同的，可以看出添加微量元素及補(bǔ)充P、K方面，推薦1的細(xì)菌、放線菌數(shù)量施肥處理要顯著高于煙農(nóng)施肥處理。其次對(duì)于只施了微量元素的Y處理細(xì)菌、放線菌數(shù)量也要好于煙農(nóng)施肥，說(shuō)明中、微量元素的施入可以增加烤煙根際微生物的細(xì)菌、放線菌的數(shù)量。這可能是微量元素的加入增加了土壤養(yǎng)分，更能滿足微生物中某些種群的生長(zhǎng)，另一方面也滿足植物對(duì)多種養(yǎng)分的需求，增加根的生物量使根際微生物的活動(dòng)范圍更加廣泛，促進(jìn)植物對(duì)養(yǎng)分的吸收，同時(shí)也提高了肥料利用率。減少氮肥、添加中、微量元素及調(diào)節(jié)肥料配比方法(推薦2)處理的效果最好，說(shuō)明適當(dāng)減肥并調(diào)節(jié)基追比更能促進(jìn)細(xì)菌、放線菌的生長(zhǎng)。在真菌的數(shù)量上4個(gè)處理有一些差異，總體上 CK>Y>T1、T2。這3類微生物數(shù)量上的表現(xiàn)與黃玉茜[18]的研究結(jié)果是比較相似的。在兩地的碳源利用情況可以看出，AWCD值的大小變化與細(xì)菌放線菌數(shù)量的變化比較一致，都是T2>T1>Y>CK。表明與煙農(nóng)施肥相比，推薦1、推薦2、煙農(nóng)優(yōu)化施肥都可以增加根際微生物的代謝活性。這與花東來(lái)等[19]研究的合理施肥可以提高微生物的代謝活性的結(jié)果相一致。與CK相比，3個(gè)處理均增加了在碳源的利用，在利用率上有比較大的差異，主要表現(xiàn)在對(duì)糖類碳源和氨基酸碳源的利用上。丘北的微生物對(duì)多胺類碳源出現(xiàn)了偏好。從總體的碳源利用率可以將其劃分為3類，一類是T2，一類是Y、T1，一類是CK。

在土壤酶活性上，可以看到3個(gè)處理的酶活性都要高于處理前，這與前人的研究結(jié)果是一致的[20-21]。無(wú)機(jī)肥料的施用上適當(dāng)添加一定量的中、微量元素，比單施氮磷鉀肥更有利于提高微生物數(shù)量、增加多樣性及土壤酶活性的。其中調(diào)配磷鉀比并適當(dāng)減肥增加基追比為5∶5的施肥處理效果最佳。丁效東等[22]發(fā)現(xiàn)在一定的氮水平下，追施比(5∶5)比基追比為7∶3時(shí)更吻合優(yōu)質(zhì)烤煙對(duì)氮需求規(guī)律。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果與之類似。鄭德劍等[23]研究中微量復(fù)合肥可以有效促進(jìn)葉綠素的合成增強(qiáng)光合作用，增強(qiáng)甘蔗抗逆性，病蟲害減少顯著增產(chǎn)的效果。因此在煙草生產(chǎn)上要根據(jù)當(dāng)?shù)胤柿η闆r在保證氮、磷、鉀大量元素施用的基礎(chǔ)上，補(bǔ)充一定量的微量元素，同時(shí)減少氮肥用量，調(diào)節(jié)基追比，可以更好地調(diào)節(jié)土壤微生態(tài)環(huán)境。