Caveolin 3蛋白與心臟Kv1.5鉀通道的相互作用及鑒定△

馬青艷，林吉進(jìn)，黃 蕾

［1.廣東省人民醫(yī)院（廣東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院）廣東省心血管病研究所心血管輔助診斷科，廣州 510080；2.廣東省人民醫(yī)院（廣東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院）廣東省心血管病研究所心內(nèi)科，廣州510080］

Caveolin 3是細(xì)胞膜穴樣內(nèi)陷分子的錨定蛋白，具有心肌特異性，只在心臟和骨骼肌中表達(dá)［1］，在蛋白質(zhì)信號(hào)傳導(dǎo)中發(fā)揮著活性調(diào)節(jié)因子的作用。既往研究表明，caveolin 3 不僅參與心肌缺血再灌注損傷、心肌肥大、心律失常等疾病的病理生理機(jī)制［2］，而且調(diào)控caveolin 3 功能或表達(dá)水平可能起到治療相關(guān)心血管疾病的作用［3］。由KCNA5 基因編碼的Kv1.5 鉀電流，是心房的超速激活延遲整流鉀電流（ultrarapidly activating delayed rectifier potassium current，Ikur）。此電流只影響心房動(dòng)作電位持續(xù)時(shí)間（APD）復(fù)極化過程，而未影響心室復(fù)極化，是目前研發(fā)心房顫動(dòng)藥物的新靶點(diǎn)［4］。近幾年已報(bào)道，caveolin 3 蛋白與心肌鈣離子通道存在相互作用并調(diào)控該通道蛋白的表達(dá)、轉(zhuǎn)運(yùn)及功能［5］；而caveolin 3 蛋白與Kv1.5 鉀通道是否存在相互作用，目前還未見報(bào)道。因此，本研究采用酵母雙雜交技術(shù)初步探索caveolin 3 蛋白與Kv1.5 鉀通道是否存在相互作用，然后應(yīng)用免疫熒光細(xì)胞分析和膜片鉗技術(shù)，證實(shí)caveolin 3 在心肌細(xì)胞中與Kv1.5存在相互作用。

1 材料和方法

1.1 材 料

脂質(zhì)體2000（Lipofectamine 2000）購自Invitrogen 公司，pGBKT7 載體和人類心臟cDNA 文庫（載體為pACT2）購買自Clontech 公司，膜片鉗放大器為美國Axon 公司的Axopatch 200 B。

1.2 Caveolin 3 質(zhì)粒的構(gòu)建

利用合成的帶有EcoR I 和BamH I 限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)的特異性引物（Forward：5′-CGGAATTCATGATGGCAGAAGAGCA-3′；reverse：5′-CGGGATCCTTAGCTGTAGGTGCCCACAGG-3′）進(jìn)行聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR），PCR 擴(kuò)增caveolin 3 基因的N 端全長（caveolin 3-NT，aa 1-159）。應(yīng)用EcoR I 和BamH I 限制性內(nèi)切酶酶切PCR 產(chǎn)物和pGBKT7 載體（Clontech），通過凝膠回收純化得到兩端分別為EcoR I 和BamH I 限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)的線性pGBKT7 載體和PCR 產(chǎn)物，應(yīng)用T4 連接酶將兩者連接，從而構(gòu)建了pGBKT7-caveolin 3-NT 誘餌質(zhì)粒。為了確保構(gòu)建好的pGBKT7-caveolin 3-NT 質(zhì)粒能表達(dá)“caveolin 3-NT-Gal4 DNA binding domain”融合蛋白，將其送往TaKaRa公司測序，證明caveolin 3-NT 和“”GAL4 DNA-BDC-Myc”在同一讀框，沒有PCR 引起的任何突變。

1.3 感受態(tài)酵母菌的制備和轉(zhuǎn)化

詳細(xì)方法參見我們既往的報(bào)道［6］。

1.4 Caveolin 3 誘餌蛋白是否自我激活報(bào)告基因的檢測

為判斷誘餌蛋白本身是否自我激活A(yù)de2，His3和Mel1報(bào)告基因，分別將被pGBKT7-caveolin 3-NT、pGBKT7空載體、陽性對(duì)照質(zhì)粒（p53+Large T-antigen）轉(zhuǎn)化的酵母菌AH109 分別涂布于SD/-Trp、SD/-Trp/-His、SD/-Trp/-Ade 和SD/-Trp/X-α-Gal不同平板上，于30℃培養(yǎng)2 周，觀察生長情況及菌落是否變成藍(lán)色。同時(shí)也進(jìn)行了β-半乳糖苷酶菌落影印濾膜分析來測定不同誘餌質(zhì)粒對(duì)LacZ基因激活的水平。

1.5 內(nèi)源性His3 表達(dá)檢測

由于不同酵母菌菌株會(huì)產(chǎn)生不同水平的內(nèi)源性組氨酸，通常可以通過加入抑制劑3-氨基-1，2，4-三唑（3-Amino-1，2，4-triazole，3-AT）來抑制這種內(nèi)源性組氨酸的產(chǎn)生。為使3-AT 的濃度最優(yōu)化，將已被各種誘餌質(zhì)粒載體或pGBKT7空載體、陽性對(duì)照質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的酵母菌涂布于3-AT 濃度分別為0、2.5、5、7.5、10 mmol/L 的SD/-His/-Trp 平板上，于30℃培養(yǎng)2 周，觀察菌落生長情況。

1.6 酵母雙雜交篩選人類心臟cDNA 文庫

挑選新鮮的已被誘餌質(zhì)粒pGBKT7-caveolin 3-NT 轉(zhuǎn)化的AH109 菌落接種于50 mL SD/-Trp 培養(yǎng)液中，培養(yǎng)20 h 后，離心取沉淀物，與含人類心臟cDNA文庫（載體為pACT2，Clontech）的酵母菌Y187混合培養(yǎng)24 h。24 h 后離心取沉淀物加入0.5×YPDA/kanamycin 培養(yǎng)液中，涂布于50 個(gè)含5 mmol/L 3-AT 的SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade（Quadruple Dropout，QDO）平板上進(jìn)行培養(yǎng)2 周。然后，挑取分離生長良好菌落依次劃線接種于QDO/X-α-Gal、SD/-Trp/-Leu（Double Dropout，DDO）/X-α-Gal、DDO/X-α-Gal、DDO/X-α-Gal、QDO/X-α-Gal 平板上。挑取最后一次的QDO/X-α-Gal 平板上生長良好的單個(gè)藍(lán)色菌落，接種于0.5 mL 的SD/-Leu/-Trp 培養(yǎng)液，于30℃250 r/min 振蕩培養(yǎng)20 h。然后，使用Lyticase 溶壁酶提取酵母菌中的總DNA（包括酵母菌的基因組DNA、“誘餌”質(zhì)粒、來自cDNA 文庫的質(zhì)粒），將提取所得的總DNA 經(jīng)電穿孔法轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α并涂布于LB/Ampicillin平板上，僅有被來自cDNA 文庫（其攜帶cDNA 的載體為pACT2，該載體帶有AMPr）的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的細(xì)菌才能生長，因此，LB/Ampicillin 平板上能生長的質(zhì)粒即是來自cDNA 文庫的“獵物”質(zhì)粒。

1.7 pDsRed2-N1-caveolin 3 和pEGFP-N3-KCNA5質(zhì)粒的構(gòu)建

利用EcoR I/BamH I 從pMD18-T-caveolin 3 中切出caveolin3 的全長，將其連接到pDsRed2-N1，構(gòu)建成能表達(dá)紅色熒光素的pDsRed2-N1-caveolin 3 質(zhì)粒。從pcDNA3.1-KCNA5 表達(dá)載體中，通過Hind III/ Kpn I 將全長KCNA5 cDNA 插入表達(dá)綠色熒光素載體pEGFP-N3 的相應(yīng)位點(diǎn)上，構(gòu)建pEGFP-N3-KCNA5 表達(dá)載體。構(gòu)建載體時(shí)，確保載體pDSRed2-N1 中的“DsRed2“與caveolin3 在同一讀框、載體pEGFP-N3 中的“EGFP“與KCNA5 在同一讀框，分別能表達(dá)“caveolin3-DsRed2“和“KCNA5-EGFP“融合蛋白。將構(gòu)建的載體送往TaKaRa 公司測序，證明目標(biāo)質(zhì)粒構(gòu)建成功。

1.8 細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)化

在37℃、5%二氧化碳的溫箱中，用含10%胎牛血清的DMEM（Hyclone Laboratories）培養(yǎng)基培養(yǎng)HEK293 細(xì)胞。轉(zhuǎn)染前的1 d，將生長旺盛的HEK293 細(xì)胞接種于六孔板中，確保轉(zhuǎn)染當(dāng)天細(xì)胞的融合度達(dá)到90%～95%。應(yīng)用脂質(zhì)體2000（lipofectamine 2000）將pEGFP-N3-KCNA5 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HEK293 細(xì)胞以及質(zhì)粒pDsRed2-N1-caveolin 3和pEGFP-N3-KCNA5 共轉(zhuǎn)染HEK293 細(xì)胞。孵育6 h 后，將HEK293 細(xì)胞培養(yǎng)于24 孔培養(yǎng)板，加入不同濃度的G418（200、300、400、500、600、700、800 mg/L），根據(jù)培養(yǎng)基的顏色和細(xì)胞生長情況，每3～5 d 更換一次培養(yǎng)基，以2 周左右細(xì)胞全部死亡的濃度為篩選濃度。

1.9 免疫熒光細(xì)胞化學(xué)分析

質(zhì)粒pDSRed2-N1-caveolin 3 和pEGFP-N3-KCNA5 轉(zhuǎn)染HEK293 細(xì)胞24～48 h 后，用DAPI 與磷酸鹽緩沖液（PBS）按體積比1∶10 的比例配制，配置后復(fù)染細(xì)胞核孵育5 min，然后用磷酸鹽緩沖液清洗3 次，每次5 min。載玻片上加入抗淬滅劑DABCO 進(jìn)行封片，然后將載玻片放置倒置熒光顯微鏡下進(jìn)行觀察轉(zhuǎn)染細(xì)胞。

1.10 膜片鉗技術(shù)

既往研究已表明HEK293 細(xì)胞中未表達(dá)內(nèi)源性caveolin，因此被選為我們的建模系統(tǒng)。將實(shí)驗(yàn)分為兩組。（1）對(duì)照組（Kv1.5 組）：將質(zhì)粒pEGFPN3-KCNA5轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞，使其單獨(dú)表達(dá)Kv1.5通道電流；（2）實(shí)驗(yàn)組（Kv1.5+caveolin 3組）：將質(zhì)粒pEGFP-N3-KCNA5 和pDSRed2-N1-caveolin 3 共轉(zhuǎn)染HEK293 細(xì)胞，使其同時(shí)表達(dá)caveolin 3 蛋白，以研究caveolin 3蛋白對(duì)Kv1.5通道功能的影響。每組記錄10 個(gè)細(xì)胞的Kv1.5 通道電流情況。在轉(zhuǎn)染后24 h，通過膜片鉗破壞細(xì)胞膜的脂筏，將Borcillica玻璃移液管拉至2～4 MΩ的電阻，在熒光顯微鏡（Nikon）下通過GFP和Red熒光鑒定細(xì)胞，記錄其對(duì)應(yīng)電流情況。本研究使用Axon 的MultiClamp 700B Commander和Molecular Devices的pCLAMP 10.2軟件（Axon Instruments，F(xiàn)oster City，California）進(jìn)行全細(xì)胞膜片鉗記錄。電極的電阻用KCl 20 mmol/L、MgCl21.0 mmol/L、HEPES 10.0 mmol/L、EGTA 5.0 mmol/L、GTP 0.1 mmol/L、門冬氨酸鉀110 mmol/L、磷酸肌酸鈉5 mmol/L、Mg2+-ATP 5 mmol/L，用KOH 調(diào)pH 至7.2。用細(xì)胞外液NaCl 140 mmol/L、KCl 5.0 mmol/L、MgCl21.0 mmol/L、KaH2PO40.33 mmol/L、HEPES 5.0 mmol/L、Glucose 10.0 mmol/L，用NaOH 調(diào)pH 至7.4。調(diào)制細(xì)胞鉗制在-80 mV 的條件下，予指令從-40～+60 mV 的電位，步階電壓為10 mV，波寬為200 ms，然后電壓保持在-40 mV，持續(xù)300 ms記錄Kv1.5 鉀電流。所有電生理實(shí)驗(yàn)均在室溫（23℃±1℃）下進(jìn)行。

1.11 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 19.0 統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。計(jì)量資料以（）表示，進(jìn)行Student′st檢驗(yàn)。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 “誘餌質(zhì)?！眕GBKT7-caveolin 3-NT的鑒定結(jié)果

將caveolin 3 基因的N 端全長caveolin 3-NT（aa 1-159）克隆進(jìn)誘餌載體pGBKT7 中。構(gòu)建載體時(shí)，確保載體pGBKT7 中的“GAL4 DNA-BD”和C-Myc 與caveolin 3-NT 在同一讀框，能表達(dá)融合蛋白“GAL4 DNA-BD-C-Myc-caveolin 3-NT”。將構(gòu)建好的pGBKT7-caveolin 3-NT 誘餌質(zhì)粒經(jīng)EcoRI和BamHI 雙酶切（圖1）及進(jìn)一步測序鑒定，結(jié)果證明caveolin 3-NT 和“GAL4 DNA-BD-C-Myc”在同一讀框，沒有PCR 引起的任何突變。

圖1 “誘餌質(zhì)?！眕GBKT7-caveolin 3-NT 酶切鑒定圖

2.2 Caveolin 3誘餌蛋白是否自我激活報(bào)告基因的檢測結(jié)果

在SD/-Trp/X-α-Gal 平板上，所有被轉(zhuǎn)化的AH109 均生長，這是因?yàn)閜GBKT7 自身帶有營養(yǎng)篩選標(biāo)記Trp，可以自身表達(dá)色氨酸，然而只有被陽性對(duì)照質(zhì)粒轉(zhuǎn)化者變成藍(lán)色，這表明誘餌蛋白caveolin 3-NT不能自我激活報(bào)告基因Mel1（圖2A）。在SD/-Trp/-Ade 平板上，只有被陽性對(duì)照質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的AH109 酵母菌可以生長，這表明誘餌蛋白caveolin 3-NT不能自我激活報(bào)告基因Ade2（圖2B）。在SD/-Trp/-His 平板上，被pGBKT7 和pGBKT7-caveolin 3-NT 轉(zhuǎn)化AH109 酵母菌有弱生長，這表明誘餌pGBKT7 可以弱激活報(bào)告基因His3，并表達(dá)一定水平的組氨酸（圖2C）。總之，誘餌蛋白caveolin 3-NT 未能夠自我激化報(bào)告基因Ade2、Mel1 和LacZ，弱激活報(bào)告基因His3。

圖2 “誘餌蛋白”caveolin 3 自激活報(bào)告基因圖

2.3 內(nèi)源性His3 表達(dá)檢測結(jié)果

在誘餌蛋白自我激活報(bào)告基因的檢測中，發(fā)現(xiàn)被pGBKT7 載體AH109 菌可以弱激活報(bào)告基因His3，表達(dá)一定水平的組氨酸。為抑制酵母菌內(nèi)源性組氨酸表達(dá)，本研究可以通過在培養(yǎng)基上加入3-氨基-1，2，4-三唑（3-AT）抑制這種的表達(dá)。為使3-AT 的濃度最優(yōu)化，將被pGBKT7-caveolin 3-NT 質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的酵母菌AH109 分別涂布于含有不同濃度3-AT（0、2.5、5、7.5、10 mmol/L）的SD/-Trp/-His 平板上30℃培養(yǎng)1～2 周，生長情況如圖3所示。該結(jié)果表明3-AT 抑制內(nèi)源性組氨酸的最適合濃度為10 mmol/L。

圖3 pGBKT7-caveolin 3-NT、pGBKT7 vector、陽性對(duì)照組、AH109 酵母菌在含有不同濃度3-AT（0、2.5、5、7.5、10 mmol/L）的SD/-Trp/-His 平板上的生長情況

2.4 誘餌蛋白caveolin 3-NT 篩選心臟文庫

本實(shí)驗(yàn)對(duì)caveolin 3-NT 進(jìn)行酵母雙雜交篩選時(shí)，共篩選了6.82×107個(gè)克隆，在最初的含10 mmol/L 3-AT 的QDO 板上共長出的158 個(gè)克隆，再經(jīng)過多次的篩選得到30 個(gè)克隆。將這30 個(gè)克隆的“獵物”質(zhì)粒送往測序，將測序所得到的DNA 序列輸入美國國立醫(yī)學(xué)圖書館的BLAST 數(shù)據(jù)庫（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/）進(jìn)行分析，共得到KCNA5、CDH13（T-cadherin）、MYBPC3（cardiac myosin binding protein C）等16 種蛋白質(zhì)（有的克隆重復(fù)多次為KCNA5）。

2.5 質(zhì)粒pDSRed2-N1-caveolin 3 和pEGFP-N3-KCNA5 的鑒定結(jié)果

將構(gòu)建好的質(zhì)粒pDSRed2-N1-caveolin 3 和pEGFP-N3-KCNA5 經(jīng)測序鑒定，結(jié)果證明DsRed2與caveolin 3、EGFP 與KCNA5 在同一讀框，且沒有PCR 引起的任何突變。

2.6 Caveolin3 和KCNA5 共定位

應(yīng)用免疫熒光細(xì)胞化學(xué)分析方法研究caveolin 3 蛋白和KCNA5 蛋白在細(xì)胞內(nèi)的亞定位情況。將質(zhì)粒pDSRed2-N1-caveolin 3 和pEGFP-N3-KCNA5利用脂質(zhì)體2000共轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞，用G418處理篩選出表達(dá)載體的轉(zhuǎn)染細(xì)胞，再進(jìn)行細(xì)胞爬片固定，應(yīng)用倒置熒光顯微鏡進(jìn)行觀察。熒光顯微鏡顯示KCNA5 蛋白定位于細(xì)胞膜上，顯示為綠色信號(hào)，caveolin 3 蛋白也定位于細(xì)胞膜上，顯示為紅色信號(hào)；紅色信號(hào)和綠色信號(hào)重疊處意味caveolin 3 蛋白和KCNA5 蛋白的細(xì)胞共定位的位置，則顯示為黃色信號(hào)（如圖4）。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，caveolin 3 蛋白和KCNA5蛋白在細(xì)胞內(nèi)共定位于細(xì)胞膜上。

圖4 KCNA5 與caveolin 3 蛋白的細(xì)胞共定位圖像［綠色信號(hào)為KCNA5 蛋白信號(hào)（A），紅色信號(hào)為caveolin 3 蛋白信號(hào)（B），黃色信號(hào)為紅色信號(hào)和綠色信號(hào)重疊信號(hào)（C），提示cavoiln 3 蛋白和KCNA5 蛋白的細(xì)胞共定位的位置］

2.7 Caveoiln 3 和Kv1.5 鉀通道功能的影響

對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞所記錄到的Kv1.5 通道電流，如圖5A、5B 記錄所示。結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組（Kv1.5+caveolin 3 組）明顯減少了HEK293 細(xì)胞中Kv1.5 的電流情況（如表1 所示）。與對(duì)照組相比，在脈沖電壓從-10 mV 到60 mV 時(shí)，caveolin 3 表達(dá)組的電流振幅和電流密度均顯著的改變（P＜0.05）（如表1、圖6AB所示）；其中，在電壓+60 mV時(shí)，Kv1.5+caveolin 3 組的Kv1.5 電流振幅明顯低于HEK293/Kv1.5 組的Kv1.5 電流振幅，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義［（896.69±145.12）pAvs.（3 303.77±779.27），P＜0.001，n=10］（如圖6A）。同時(shí)，在電壓+60 mV 時(shí)，Kv1.5+caveolin 3 組的Kv1.5 電流密度比亦明顯低于Kv1.5組的Kv1.5電流密度比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義［（30.99±5.46）pA/pFvs.（95.13±13.46）pA/pF，P＜0.001，n=10］（如圖6B）。因此，可以認(rèn)為caveolin 3 的表達(dá)影響并降低了Kv1.5 的電流振幅及電流密度比，caveolin 3 蛋白對(duì)心臟Kv1.5 鉀通道具有負(fù)性調(diào)控作用。

3 討論

本研究首次利用酵母雙雜交技術(shù)篩查出與caveolin 3相關(guān)蛋白有KCNA5、CDH13（T-cadherin）、MYBPC3（cardiac myosin binding protein C）等16 種蛋白質(zhì)，其中克隆重復(fù)多次、備受關(guān)注的是KCNA5。KCNA5 基因（potassium voltage-gated channel，shaker-related subfamily，member 5）為Kv1.5 鉀通道的編碼基因，是Ikur 的主要分子基礎(chǔ)，編碼了Kv1.5 鉀電流，此電流只在心房中特異性表達(dá)［5，7］。caveolin 3 是細(xì)胞質(zhì)膜上的特異性囊狀小凹結(jié)構(gòu)，具有心肌特異性，從caveolin 3 N 端篩選出心臟文庫中KCNA5 基因，我們初步推測caveolin 3 蛋白質(zhì)可能對(duì)Kv1.5 鉀電流的正常定位、復(fù)合體形成、功能調(diào)控等具有重要意義。

表1 兩組細(xì)胞在不同電壓時(shí)Kv1.5電流振幅和電流密度比的比較 ［n=10，］

表1 兩組細(xì)胞在不同電壓時(shí)Kv1.5電流振幅和電流密度比的比較 ［n=10，］

圖5 Caveolin 3 蛋白對(duì)Kv1.5 通道電流的影響的電流圖（A：HEK293 細(xì)胞中單獨(dú)表達(dá)KCNA5 蛋白的Kv1.5 通道電流；B：共同表達(dá)KCNA5 和caveolin 3 的細(xì)胞所記錄到的Kv1.5 鉀通道電流）

圖6 Caveolin 3蛋白對(duì)Kv1.5通道電流影響的曲線圖［A：對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組，Kv1.5 鉀通道的電流與電壓關(guān)系（I-V 曲線）；B：對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組，Kv1.5 鉀通道的電流密度比與電壓的曲線關(guān)系（n=10，P＜0.05）］

本實(shí)驗(yàn)將caveolin 3 蛋白N 端（caveolin3-NT，aa 1-159）克隆進(jìn)入誘餌載體pGBKT7。pGBKT7為酵母表達(dá)載體，具有核定位序列，該載體表達(dá)的caveolin 3-NT 融合蛋白通過該核定位序列而進(jìn)入核內(nèi)。然而，此技術(shù)未能確定完整的caveolin 3蛋白正常定位是否與Kv1.5 鉀電流存在共定位。因此，我們將caveolin 3 蛋白和KCNA5 蛋白轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞，通過熒光免疫化學(xué)分析發(fā)現(xiàn)KCAN5 和caveolin 3 蛋白共定位于細(xì)胞膜上。Ravi 等［4］研究利用共聚焦成像證明了Kir2.1和caveolin 3的共定位，并發(fā)現(xiàn)caveolin 3蛋白與Kir2.1形成復(fù)合體，修飾并調(diào)控Kir2.1 電流密度表達(dá)。Caveolin 3 蛋白和KCNA5蛋白共定位提示，caveolin 3 蛋白很可能也相似參與了Kv1.5 鉀通道的功能調(diào)控。

眾多研究證實(shí)KCNA5 基因參與了心房顫動(dòng)的心肌重構(gòu)［8］，心房顫動(dòng)時(shí)動(dòng)作電位中復(fù)極化過程的改變與Kv1.5 的mRNA 表達(dá)改變有關(guān)［9］。此外，Christophersen 研究者發(fā)現(xiàn)，KCNA5 基因的突變，擾亂酪氨酸激酶信號(hào)通道傳導(dǎo)，引起Ikur 電流密度的增強(qiáng)或減弱，動(dòng)作電位持續(xù)時(shí)間和有效不應(yīng)期（ERP）的延長，增加早期復(fù)極化的可能，進(jìn)而誘發(fā)心房顫動(dòng)［10］。Kv1.5 鉀電流參與動(dòng)作電位持續(xù)時(shí)間復(fù)極化過程，而未影響心室肌復(fù)極化過程發(fā)揮作用，使其成為新的治療心房顫動(dòng)藥物研究熱點(diǎn)［5］。人們?cè)诓粩嗟靥剿鬟x擇性抑制Kv1.5 通道延長心房有效不應(yīng)期，而不引起室性心律失常的危險(xiǎn)，研發(fā)選擇性抗心律失常藥物靶點(diǎn)［8，11-12］。假設(shè)caveolin 3 蛋白與Kv1.5 鉀通道形成復(fù)合體，修飾并調(diào)控電流密度的表達(dá)，那么，caveolin 3 蛋白可成為治療心房顫動(dòng)的藥物靶點(diǎn)。

以往的研究顯示，caveolin 3蛋白與心臟Kir2.1［2］、Nav1.5［13］、Kv1.3［14］、KCa1.1［15］、cyclicnucleotidegated（HCN）［16］等多種離子通道存在相互作用并調(diào)控該通道蛋白的表達(dá)、轉(zhuǎn)運(yùn)及功能。本研究利用膜片鉗技術(shù)，記錄到caveolin 3 蛋白的表達(dá)，降低了Kv1.5 鉀通道的電流振幅和電流密度，首次發(fā)現(xiàn)caveolin 3 蛋白對(duì)Kv1.5 鉀通道的電流具有負(fù)性調(diào)控作用。然而，其具體調(diào)控機(jī)制需進(jìn)一步的探索。先前研究已經(jīng)證實(shí)，caveolin 區(qū)域的改變會(huì)顯著影響心臟HCN4，Kv1.5，Cav1.2 和Nav1.5 等通道的特性［13，15-17］。Caveolin 3 基因的突變與先天性長QT綜合征（LQT9）有關(guān)，其T63S，T78M，A85T，L79R，C78W 的點(diǎn)突變?cè)黾油砥阝c電流、延長動(dòng)作電位持續(xù)時(shí)間從而誘發(fā)LQT9 的發(fā)生［16］。F97C 和S141R點(diǎn)突變，增加了Cav1.2 編碼的L 型Ca2+通道電流的增加，降低了介導(dǎo)瞬時(shí)外向鉀電流（Ito）的Kv4.2 和Kv4.3通道電流［17］。此外，Vaidyanathan、Vatta等［13，18］研究發(fā)現(xiàn)，caveolin 3 可通過影響Kir2.1、Nav1.5 通道誘發(fā)LQT7、LQT3 發(fā)生；而caveolin 3 影響Kir2.1的另一種機(jī)制包括通道亞硝基化，Nedd4-2 誘導(dǎo)的快速降解或通過與4，5-二磷酸磷脂酰肌醇（PIP2）相互作用改變門控特性［18］。因此，改變小窩蛋白的微結(jié)構(gòu)可調(diào)控多種通道蛋白的表達(dá)、轉(zhuǎn)運(yùn)及功能。調(diào)控caveolin 3 功能或表達(dá)水平有時(shí)候可起到治療在多種心血管相關(guān)疾病的作用，例如過渡表達(dá)caveolin 3 蛋白可通過抑制T 型Ca2+電流來對(duì)抗心臟肥大［15］。

Caveolin 3 作為信號(hào)分子的支架和調(diào)節(jié)蛋白，其調(diào)控離子通道特別是Kv1.5 電流通道的病理生理機(jī)制，尚未明了，需要進(jìn)一步的研究探索。本研究首次發(fā)現(xiàn)caveolin 3 蛋白對(duì)Kv1.5 電流具有負(fù)性調(diào)節(jié)機(jī)制，為研發(fā)安全有效的心房顫動(dòng)藥物提供一個(gè)潛在的靶點(diǎn)和新的研究思路。