連接蛋白43的磷酸化在惡性腫瘤發(fā)生機制中的研究進展

趙希偉 劉倩 滕飛 侯林義 張文凱

縫隙連接(gap junctions)是由一系列連接蛋白組成的膜通道，連接蛋白是跨膜蛋白家族，可以形成連接相鄰細胞的跨膜通道?？p隙連接蛋白(connexin，Cx)是組成縫隙連接通道的基礎(chǔ)和形成細胞內(nèi)外相互交流的重要條件[1]。連接蛋白是形成縫隙連接的亞基蛋白，六個連接蛋白齊聚形成半通道，兩個半連接蛋白碼頭形成一個完整的間隙連接細胞間通道，連接蛋白的不同排列組合形成不同的膜通道，使其縫隙連接通道具有不同的功能[2]。連接蛋白是由多基因家族編碼的包括多個成員的一類膜蛋白，Cx43是第一個發(fā)現(xiàn)的連接蛋白同時也是是表達最廣泛的連接蛋白[3]。Cx43的作用可以概況為縫隙連接組裝、門控、翻轉(zhuǎn)以及對粘附連接、細胞骨架、細胞增殖及基因調(diào)控等方面發(fā)揮作用[4]。相鄰細胞間發(fā)生信息的傳遞需要通過縫隙連接細胞間通信(gap junction intercellular communication，GJIC)。GJIC是指在相鄰細胞之間提供直接、高效的細胞內(nèi)外信息交換的過程。通過相鄰細胞之間的縫隙連接進行的細胞間通信有助于將細胞組織變成功能性組織[5]。Cx43功能障礙可以影響縫隙連接，從而也影響GJIC，并可以影響小分子的細胞間交換，如cAMP，cGMP和Ca2+等，也證明Cx43功能障礙與多種惡性腫瘤密切相關(guān)[6]。本文就Cx43的磷酸化與惡性腫瘤發(fā)生機制的關(guān)系進行綜述。

1 Cx43的磷酸化發(fā)生機制及作用

的研究顯示Cx43的功能主要通過內(nèi)化、磷酸化和降解來調(diào)節(jié)，但翻譯后進行的磷酸化對惡性腫瘤的發(fā)生起非常重要的作用[7]。Cx43的磷酸化需要通過信號通路傳遞，例如通過蛋白激酶A(protein kinase A，PKA)[8]、蛋白激酶C(Protein kinase C，PKC)[9]、酪蛋白激酶1(Casein kinase 1，CK1)[10]及絲裂原活化蛋白激酶(mitogen activated protein kinase MAPK)[11]等的信號通路。CX43的磷酸化改變了其結(jié)構(gòu)及數(shù)量，也改變了縫隙連接的功能，進而影響縫隙連接細胞間通信，而縫隙連接通道的活性可能與縫隙連接通道的結(jié)構(gòu)亞單位連接蛋白磷酸化狀態(tài)有關(guān)[12]。蛋白質(zhì)磷酸化被認(rèn)為可以在從基因表達到蛋白質(zhì)降解的幾個步驟中控制細胞縫隙連接通訊，包括連接蛋白的翻譯和翻譯后修飾以及組裝到質(zhì)膜中并從質(zhì)膜中移除，而大多數(shù)連接蛋白的磷酸化位點是在多個絲氨酸殘基上，并在C-末端被優(yōu)先識別[13]?？芍鞍踪|(zhì)磷酸化介導(dǎo)的細胞間通訊的改變可以影響細胞的結(jié)構(gòu)和生理功能的改變，嚴(yán)重者并可造成病理性改變?nèi)缒[瘤[6]。

可增加Cx43磷酸化的激酶包括蛋白激酶A(PKA)、蛋白激酶C(PKC)、酪蛋白激酶1(CK1)及絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)等[14,15]。研究表明，PKC激活劑可以促進腫瘤的發(fā)生，機制是在PKC信號通路中，佛波酯腫瘤啟動子TPA(PMA)刺激PKC，TPA通過誘導(dǎo)PKC對Cx43的磷酸化從而增加了Cx43磷酸化水平、降低了連接電導(dǎo)和增加了Cx43的周轉(zhuǎn)率但也下調(diào)了縫隙連接通道的數(shù)量，同時也指出ser368是PKC在Cx43較常見的結(jié)合位點[9,14,15]。

與PKC和MAPK信號途徑相比，Cx43的磷酸化通過PKA信號傳導(dǎo)途徑使產(chǎn)生的效應(yīng)較差，通過提高細胞內(nèi)cAMP的濃度，可以明顯發(fā)現(xiàn)Cx43的磷酸化增強，也表示縫隙連接通訊加強。ser364是目前已知PKA途徑中較常用的磷酸結(jié)合位點，Ser364磷酸化突變可以改變CX43的門控作用，可導(dǎo)致縫隙連接門控通道異常，可能會產(chǎn)生異位癥的病變[8,14,15]。

Solan等[16]指出酪蛋白激酶1(CK1)的活性與Cx43半通道在縫隙連接斑塊中的組裝有關(guān)，CK1的抑制導(dǎo)致Cx43的增加和Triton-X-100不溶性縫隙連接的減少。CK1的磷酸化位點是Ser325、Ser328和Ser330[10]。而絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)的磷酸化位點Ser279和Ser282，該蛋白激酶的主要作用是加速縫隙連接通道的閉合[11,14,15]。

總之，可得出PKA可能通過提高連接蛋白的運輸和組裝加強縫隙連接通訊。CK1可能是通過促進縫隙連接通道的組裝從而加強縫隙連接通訊。而PKC可能是通過抑制縫隙連接組裝和通道的數(shù)量導(dǎo)致縫隙連接通訊被抑制。MAPK的作用可通過加速通道閉合來抑制Cx43的門控通道，抑制縫隙連接通訊。

2 Cx43的磷酸化與各種惡性腫瘤發(fā)生機制的關(guān)系

連接蛋白及GJIC與癌癥的發(fā)生和發(fā)展有關(guān)，并且通常起著抑癌作用。連接蛋白的抑癌作用是由于縫隙連接細胞間通訊(GJIC)的喪失和連接蛋白在腫瘤樣本中表達的降低。在大多數(shù)研究中形成的癌癥共識是GJIC在原發(fā)性腫瘤中出現(xiàn)了丟失，并且是腫瘤發(fā)生的重要驅(qū)動力。盡管在許多癌細胞中連接蛋白水平與GJIC之間存在相關(guān)性，但功能性的連接蛋白是通過翻譯后修飾以及通過蛋白激酶信號通路進行的磷酸化實現(xiàn)的。連接蛋白可以作為抑制腫瘤的藥物，但也可以促進腫瘤的生長和存活，特別是在晚期轉(zhuǎn)移性疾病中。同時連接蛋白也可作為癌癥的預(yù)后標(biāo)志物和治療癌癥靶標(biāo)的重要藥物[17-20]。

2.1 Cx43的磷酸化與肺部惡性腫瘤 肺癌是男性中很常見的惡性腫瘤，是腫瘤死亡的常見原因[21]。Cx43與肺癌的關(guān)系密切，在正常肺中，Cx43處于低磷酸化狀態(tài)，但在肺腫瘤中磷酸化的Cx43增加。Cx43調(diào)控肺癌時既可以是腫瘤抑制因子，也可以是腫瘤促進因子，因此肺癌中的Cx43磷酸化的表達既可以減少縫隙連接數(shù)量，也可以增加縫隙連接的數(shù)量，從而控制肺癌的疾病進程[17,22]。在肺癌中，通過PKC途徑的Cx43磷酸化研究比較熱門，Sun等[23]指出在肺癌中第二信使cAMP下游靶點cAMP(Epac1)的表達低于癌旁組織，而肺癌中的AKAP95(蛋白激酶A錨定蛋白95，通過與PKA的Ⅱ型R亞單位結(jié)合介導(dǎo)靶蛋白的磷酸化)明顯高于癌旁組織，肺癌組織中蛋白激酶C(PKC)的陽性表達低于癌旁正常組織。研究表明Epac可誘導(dǎo)PKC活化和Cx43磷酸化[24]，也指出了Epac可以通過PKC途徑導(dǎo)致的Cx43磷酸化狀態(tài)參與了肺癌增殖的調(diào)控。同時也指出AKAP95的磷酸化需要PKC信號通路的參與。而在非小細胞肺癌(NSCLC)中，癌癥相關(guān)成纖維細胞(CAFs)經(jīng)歷大量有氧糖酵解釋放大量ATP，激活了PI3K/Akt和MAPK/ERK信號通路，使Cx43氧化磷酸化增強，促進Cx43組裝不對稱的單向GJIC，促進了腫瘤的惡性進展[25]。而在另一條信號通路中，p38 MAPK的活性，連接蛋白的磷酸化和肺癌轉(zhuǎn)化之間存在著聯(lián)系，p38 MAPK的調(diào)節(jié)與Cx43的磷酸化變化有關(guān)，該激酶可直接使該蛋白磷酸化[26]。

近年，研究的熱點開始轉(zhuǎn)向了解Cx43與肺癌干細胞的關(guān)系。Ruch等[27]指出Cx43在肺癌中可以抑制癌癥干細胞(CSCs)的表達同時降低其含量，故若上調(diào)Cx43的表達也可以改善肺癌的病情進展。但Cx43磷酸化與肺癌干細胞的關(guān)系研究并不多見，這也可以為肺癌的治療提供一個研究的方向。

研究Cx43的磷酸化與肺癌的具體機制目的就是可以為治療肺癌提供更加高效的措施。在目前肺癌死亡率居高不下，可以嘗試通過研究信號通路的機制治療腫瘤，例如通過對PKC信號通路的抑制導(dǎo)致Cx43磷酸化的減少從而影響腫瘤的生長。同時，也可以通過CX43磷酸化抑制肺癌干細胞達到治療肺癌的目的，提高肺癌患者的生存率。

2.2 Cx43的磷酸化與胃部惡性腫瘤的關(guān)系 胃癌是消化系統(tǒng)常見的惡性腫瘤，死亡率在惡性腫瘤中較高[28]。Ezrin的磷酸化作用通過信號通路可以影響Cx43的磷酸化進程，從而可以對胃癌產(chǎn)生影響[29]。因此我們首先了解研究Ezrin與胃癌的關(guān)系，Ezrin是Ezrin/radixin/moesin(ERM)家族的一員，參與了細胞膜和肌動蛋白細胞骨架之間的連接作用，也參與信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑[30]。而與磷脂酰肌醇4,5-二磷酸(PIP 2)的結(jié)合和蘇氨酸567(T567)的磷酸化是Ezrin發(fā)生正確的空間構(gòu)像變化的主要條件[31]。上述的兩個條件產(chǎn)生的磷酸化也導(dǎo)致Ezrin激活，從而參與了各種正常生理過程和疾病的生理過程的調(diào)節(jié)。Bal等[32]指出在胃癌中幽門螺桿菌的狀態(tài)與Ezrin的表達呈正相關(guān)，幽門螺桿菌感染的胃癌細胞中有更多的Ezrin表達。Tobo等[33]指出Ezrin的磷酸化作用可以參與胃癌的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，而且具有高度的侵襲性。隨著越來越多的研究證明Ezrin在胃癌中表現(xiàn)出高表達，同時也有高度的侵襲性和參與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。Tang等[34]指出Cx43在胃癌組織中的表達比在癌旁正常組織中的表達明顯減少，同時也指出Cx43的表達增多可能有助于胃癌的淋巴轉(zhuǎn)移。Cx43在胃癌中的表達缺失會造成縫隙連接的數(shù)量和門控通道性質(zhì)發(fā)生改變，導(dǎo)致縫隙連接通訊異常[35]。通過進一步的研究發(fā)現(xiàn)P-Ezrin和Cx43在胃癌中的表達呈負(fù)相關(guān)的表現(xiàn)，Cx43在胃癌中表達降低，而P-Ezrin在胃癌中表達增加，這可能是淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和預(yù)后差的原因之一[29,36]。通過上述分析可得出磷酸化的Ezrin通過信號通路可能會導(dǎo)致Cx43磷酸化抑制了縫隙連接的通訊功能，導(dǎo)致細胞內(nèi)外信息傳達障礙。這也可能是胃癌發(fā)生的一個機制，也可以為今后的胃癌治療提供藥物靶點。

Cx43與PI3K在胃癌中的表達呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)的關(guān)系[37]。PI3K-Akt信號通路是細胞內(nèi)進行信號傳導(dǎo)的重要通路,在腫瘤發(fā)生發(fā)展中起著重要的作用[38]。磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3K)是一種脂質(zhì)激酶，其特征在于它們能夠磷酸化肌醇磷脂中的肌醇環(huán)3’-OH基團以生成第二信使磷脂酰肌醇-3,4,5-三磷酸(PI(3，4，5)P3)，PI(3、4、5)P3是Akt轉(zhuǎn)運至質(zhì)膜所必需的第二信使，在該處其被磷酸肌醇依賴性激酶(PDK)1和PDK2磷酸化并激活，Akt的激活通過磷酸化各種底物，活化的Akt可以抑制細胞凋亡、促進細胞增殖和血管生成[38,39]。PI3K-Akt信號通路也是胃癌中的重要細胞內(nèi)信號通路，通過實驗證明在胃癌組織中PI3K呈現(xiàn)高表達狀態(tài)也表明可能參與胃癌的形成[40]。Batra等[41]指出通過流體剪切應(yīng)力(FFSS)的機械刺激PI3K，導(dǎo)致其下游的靶點Akt被磷酸化，通過PI3K-Akt信號通路直接刺激Cx43產(chǎn)生磷酸化的作用。由此也可推斷出Cx43通過PI3K-Akt信號通路被磷酸化，導(dǎo)致Cx43的減少使縫隙連接通道的數(shù)量和結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，無法傳遞細胞內(nèi)和細胞外的信號，從而無法抑制癌癥細胞的過度增殖而形成胃癌[37]。綜上所述，了解胃癌的發(fā)病機制可以為胃癌提供更加精確的治療方法。

2.3 Cx43的磷酸化與肝部惡性腫瘤的關(guān)系 肝癌是世界上最常見的惡性腫瘤之一，其中肝細胞癌(hepatocellular carcinoma HCC)占原發(fā)性肝癌的90%，也是死亡率較高的惡性腫瘤[21]。肝細胞中表達的主要縫隙連接蛋白是Cx32和Cx43，Cx32和Cx43的表達減少和異常定位可能與肝癌的發(fā)生密切相關(guān)，其中連接蛋白翻譯后的磷酸化，與GJIC的功能破壞有關(guān)[42]。我們已知肝細胞癌可能與Cx43的磷酸化模式變化和重新分布有關(guān)，進而影響GJIC功能，為此在這里進一步討論兩者如何相互影響。

Cx43在肝細胞癌組織中的表達明顯降低且存在分布異常，通過免疫熒光法得出縫隙連接在肝細胞癌的數(shù)量減少導(dǎo)致縫隙連接功能的缺失[43]。Ogawa等[44]指出通過小鼠體內(nèi)體外實驗Cx43高表達的情況下出現(xiàn)體外、體內(nèi)轉(zhuǎn)移、腫瘤具有高度的侵襲性。在蛋白的研究水平已經(jīng)證明了Cx43在肝細胞癌中的作用，但通過在基因水平上的研究發(fā)現(xiàn)Cx43的mRNA水平無明顯變化[45,45]。Cx43蛋白的明顯降低和Cx43的mRNA無變化可分析出兩種情況，分別是在轉(zhuǎn)錄后翻譯出現(xiàn)差錯或者在翻譯后的蛋白質(zhì)的加工修飾出現(xiàn)異常[46]。Lonta等[47]表示在大鼠的肝癌細胞中發(fā)現(xiàn)Cx43主要呈現(xiàn)的是磷酸化形式，也就證明了主要起作用的是翻譯后的蛋白質(zhì)加工過程出現(xiàn)了磷酸化。通過更進一步具體的研究發(fā)現(xiàn)在肝細胞癌中Cx43蛋白是由酪氨酸磷酸化轉(zhuǎn)導(dǎo)信號通路進行表達同時出現(xiàn)縫隙連接通訊功能的缺失[42,48]。綜上所述，Cx43的磷酸化在肝細胞癌的進程中起者重要的作用。隨著研究Cx43磷酸化在肝細胞癌中作用機制的深入，將來有可能為肝細胞癌的臨床治療提供新的思路。

2.4 Cx43的磷酸化與乳腺癌的關(guān)系 乳腺癌是全世界女性中最常見的惡性腫瘤之一，也是女性死亡的第二大原因(僅次于肺癌)。乳腺癌患者死亡最重要原因是發(fā)生腫瘤遠處轉(zhuǎn)移和侵襲[49,50]。在正常乳腺中，有3個常見的連接蛋白(即Cx43，Cx26和Cx32)，Cx43主要在腔上皮和肌上皮細胞中表達，特別是在肌上皮細胞(MEC)中更加明顯，而Cx26的表達僅限于腔上皮細胞中，其中Cx43在乳腺實質(zhì)中占主導(dǎo)作用。Cx43在正常乳腺組織中起著抑癌作用，它的表達減少或和定位不準(zhǔn)確可能會進一步促進乳腺癌的發(fā)生，而且它在乳腺癌中的高水平表達可作為良好的預(yù)后標(biāo)志物，而其在腫瘤后期的重新表達則有助于表明癌癥發(fā)生了侵襲和轉(zhuǎn)移。由于Cx43與乳腺癌患者疾病預(yù)后的改善呈正相關(guān)，因此Cx43也被認(rèn)為是獨立的預(yù)后因素[18-20]。Tishvhenko等[51]提出，Cx43既可調(diào)節(jié)這幾個關(guān)鍵的癌癥信號通路包括RhoA激酶(ROCK)，蛋白激酶A(PKA)，粘著斑激酶(FAK)和p38等，同時信號通路也可調(diào)節(jié)Cx43的磷酸化過程。

在乳腺癌中，Cx43磷酸化的發(fā)生主要通過各種信號通路實現(xiàn)。有研究通過應(yīng)用一種特異性抗血清(SA226P)來檢測正常乳腺、纖維囊性疾病(FCD)、乳腺癌中的原位癌和浸潤性癌的連接蛋白43磷酸化形式(p-Cx43)的情況，我們發(fā)現(xiàn)，在原位癌中的MEC的p-Cx43出現(xiàn)了升高，但在浸潤性癌中明顯升高。在該實驗中Cx43主要通過p44/42絲裂原激活的蛋白激酶(MAPK)信號通路在Cx43羧基末端的磷酸化位點Ser279和Ser282處被磷酸化[20,52]。乳腺癌的轉(zhuǎn)移同樣會引起Cx43磷酸化的改變，Bodenstine等[53]提出了新觀點認(rèn)為在乳腺癌發(fā)生轉(zhuǎn)移過程中，細胞的縫隙Cx43含量水平不變的情況下，Cx43從胞漿到質(zhì)膜的重新定位，以及通過PKA信號通路實現(xiàn)磷酸化后可以導(dǎo)致GJIC相應(yīng)降低，也就表明癌細胞中的連接蛋白可能不是表達的下調(diào)而是通過改變與連接蛋白功能和或定位有關(guān)的調(diào)控途徑來降低GJIC。乳腺癌細胞(BCC)容易向骨髓基質(zhì)轉(zhuǎn)移，故兩者之間形成的GJIC的趨化性降低，外源性CXCL12在此過程中發(fā)揮重要作用。BCC之間相互聯(lián)系并形成GJIC，CXCL12水平與Cx43表達之間存在反比關(guān)系即較高濃度的CXCL12情況下，Cx43表達量降低和Cx43磷酸化水平降低。也充分證明了外源性CXCL12作用于第二信使激活PKC信號通路導(dǎo)致Cx43的磷酸化，從而增加了細胞間的通訊[54]。Gakhar等[55]研究表明有機氯化合物TCDD對乳腺癌細胞的縫隙連接活性有抑制作用，同時Cx43和PKCα的磷酸化形式增加，因此TCDD通過PKCα信號通路磷酸化Cx43從而降低乳腺癌胞的GJIC。也由此得知在乳腺癌細胞中的Cx43羧基末端的磷酸化位點Ser368處可被PKC信號通路磷酸化，實現(xiàn)對GJIC的調(diào)節(jié)。有研究表明在乳腺癌中，PKC和細胞外信號調(diào)節(jié)激酶1和2(ERK1/2)信號通路之間存在相互調(diào)節(jié)的關(guān)系。Cx43的磷酸化一方面可由PKC活化的ERK1/2信號通路實現(xiàn)，另一方面也可有PKC信號通路直接進行磷酸化[56]。在乳腺癌中，Cx43可作為預(yù)后的獨立預(yù)測因子，通過對其信號通路磷酸化過程進行精準(zhǔn)的調(diào)節(jié)，為治療乳腺癌及其轉(zhuǎn)移提供理論依據(jù)。

綜上所述，Cx43在各個腫瘤的表達情況不一定相同，既可以作為腫瘤抑制因子，也可以作為癌基因[6]。Cx43表達的缺失引起縫隙連接功能異常，Cx43的缺失是主要通過蛋白質(zhì)翻譯后的加工修飾中磷酸化的作用實現(xiàn)的，加速了腫瘤的進展。因此，通過研究Cx43與各個信號通路的發(fā)生機制和探索各個信號通路的相互關(guān)系，進行更深入的研究，尋找治療癌癥的高效靶點，有益于新型治療腫瘤藥物的研發(fā)。