七氟醚調(diào)控miR-4458影響胃癌SNU-1細胞的增殖、遷移和凋亡

封雪 王詠強 趙濱濱

胃癌發(fā)病率和死亡率分別高居全球惡性腫瘤排行榜第四位和第二位，已成為一種全球性重大健康問題[1]。隨著胃癌綜合診斷和治療手段不斷進展，胃癌患者預后得到改善，但由于胃癌細胞的異常存活和惡性遷移、侵襲，胃癌患者的長期生存率仍較低[2]。手術是臨床胃癌治療重要手段之一，研究顯示圍手術期麻醉藥的應用可能影響腫瘤細胞和免疫細胞的行為，與癌癥的不良結局有關[3]。七氟醚是臨床常用麻醉藥之一，具有用藥劑量小、對血液動力學影響輕微、蘇醒快等優(yōu)勢。最近研究表明，七氟醚通過調(diào)節(jié)微小RNA(miRNA)表達對結直腸癌、乳腺癌、膠質(zhì)瘤的增殖、遷移和侵襲具有顯著抑制作用[4-6]。miR-4458是一種乳腺癌、非小細胞肺癌抑癌基因，上調(diào)miR-4458表達對癌細胞的增殖、遷移和侵襲有顯著抑制作用[7,8]。異丙酚對肝癌細胞生長和轉(zhuǎn)移的抑制作用亦與上調(diào)miR-4458表達有關[9]。但miR-4458在胃癌中的作用、七氟醚是否調(diào)控miR-4458表達發(fā)揮抗腫瘤作用。本研究重點探討了七氟醚對胃癌細胞SNU-1增殖和凋亡的影響，并探討其機制是否與調(diào)控miR-4458表達有關。

1 材料與方法

1.1 材料 SNU-1細胞、GES細胞購于武漢普諾賽生命科技公司；七氟醚購于上海恒瑞醫(yī)藥有限公司；miRNA模擬物(mimics)、抑制物(anti-miRNA)購于北京華大基因公司；四甲基偶氮唑藍(methyl thiazolyl tetrazolium)MTT試劑盒、總RNA提取試劑盒、Annexin V-FITC/PI凋亡檢測試劑盒購于北京索萊寶生物公司；Transwell小室購于美國密理博公司；兔源β-actin(β-肌動蛋白)、細胞周期蛋白D1(CyclinD1)、裂解的半胱氨酸蛋白酶3(Cleaved-caspase-3)、機制金屬蛋白酶2(MMP-2)、MMP-9抗體等一抗以及羊抗兔IgG二抗購于美國CST公司；miRNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、miRNA定量PCR試劑盒購于美國GeneCopoeia公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)：SNU-1細胞采用含10%胎牛血清、1%青鏈霉素雙抗的RPMI-1640培養(yǎng)基在37℃、CO2體積分數(shù)為5%的濕潤培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。按照1∶4比例進行傳代培養(yǎng)，換液頻率為每周2～3次，選取第3次對數(shù)期細胞進行后續(xù)實驗。將細胞培養(yǎng)板置于密閉培養(yǎng)箱中，進氣口、出氣口分別連接麻醉氣體揮發(fā)罐(5% CO2、21% O2、74% N2)、氣體分析儀。將混合氣體瓶連接麻醉機，打開混合氣體瓶預充氣3 min，隨后調(diào)整氣流為0.5 L/min。隨后打開麻醉揮發(fā)罐，維持適當麻醉氣體濃度，37℃處理6 h，取出平板常規(guī)培養(yǎng)24 h[10]，隨后測定細胞活力、遷移和凋亡情況。

1.2.2 實驗分組：將SNU-1細胞分為正常對照(NC)組：進充入混合氣體；1.7%給藥組：七氟醚濃度為1.7%；3.4%給藥組：七氟醚濃度為3.4%；5.1%給藥組：七氟醚濃度為5.1%。為證實miR-4458對SNU-1細胞生物學行為的影響，利用脂質(zhì)體法將miR-NC、miR-4458 mimics、anti-miR-NC、anti-miR-4458瞬時轉(zhuǎn)染至SNU-1，依次記為miR-NC組、miR-4458 mimics組、anti-miR-NC組、anti-miR-4458組，收集轉(zhuǎn)染48 h細胞進行后續(xù)分析。為證實七氟醚是通過調(diào)控miR-4458表達進而影響SNU-1細胞生物學行為，對轉(zhuǎn)染anti-miR-NC、anti-miR-4458的SNU-1細胞(轉(zhuǎn)染48 h)進行七氟醚處理6 h，依次記為5.1%給藥+anti-miR-NC組、5.1%給藥+anti-miR-4458組，常規(guī)培養(yǎng)24 h進行后續(xù)分析。人正常胃黏膜細胞(GES1)組：正常培養(yǎng)的GES1細胞；GES1(5.1%給藥組)：七氟醚濃度為5.1%。

1.2.3 MTT法檢測細胞活力:將各組SNU-1細胞接種到96孔板上，培養(yǎng)24 h后，每孔加入20 μl的MTT溶液在37℃下孵育4 h。之后，棄去培養(yǎng)基，并向每個孔中加入150 μl的二甲基亞砜以溶解晶體。酶標儀測量570 nm波長的吸光度(A)來確定細胞活力。

1.2.4 流式細胞術檢測細胞凋亡:Annexin V結合緩沖液重懸各組細胞，向100 μl細胞懸液中加入5 μl的Annexin V-FITC和5 μl的PI暗室孵育15 min。流式細胞儀分析細胞凋亡。

1.2.5 Transwell實驗檢測細胞遷移:將各組細胞重懸在不含胎牛血清的培養(yǎng)液中，分別200 μl加入Transwell上室中，而下室中加入500 μl含有10%的胎牛血清的培養(yǎng)基。37℃下孵育12 h后，用無菌棉擦去上室內(nèi)未遷移細胞，4%多聚甲醛固定Transwell膜下表面遷移細胞10 min，室溫下用0.5%結晶紫染色10 min。顯微鏡下隨機選擇3個視野進行細胞計數(shù)，以平均值表示細胞遷移數(shù)量。

1.2.6 蛋白質(zhì)印跡法(Western blot)檢測CyclinD1、Cleaved-caspase-3、MMP-2、MMP-9蛋白表達:放射免疫沉淀測定(RIPA)緩沖液裂解各組細胞，BCA分析試劑盒測量蛋白濃度。100℃變性5 min，隨后取等量變性蛋白進行聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)。蛋白轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上后，將膜與5%脫脂牛奶室溫下孵育1 h，再將膜與特異性一抗(均1∶1 000稀釋)4℃孵育過夜。然后將膜與相應二抗室溫下孵育2 h。用增強型化學發(fā)光試劑盒檢測蛋白條帶，凝膠成像系統(tǒng)分析灰度值，目的蛋白和內(nèi)參β-actin灰度值比值為目的蛋白相對表達量。

1.2.7 實時定量PCR(RT-qPCR)檢測miR-4458表達:總RNA提取試劑盒分別提取各組細胞總RNA，用miRNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA，再采用miRNA qPCR試劑盒進行定量分析。2-ΔΔCt方法計算miR-4458表達量。miR-4458上游引物5’-AGAGGTAGGTGTGG

AAGAA-3’，下游引物5’-GCGAGCACAGAATTAATAC

GA C-3’；U6上游引物5’-CTCGCTTCGGCAGCACA-3’，下游引物5’-AACGCTTCACGAATTT GCGT-3’。

2 結果

2.1 不同濃度七氟醚對胃癌細胞SNU-1細胞增殖、凋亡及遷移的影響 不同劑量七氟醚處理后SNU-1細胞活力、遷移細胞數(shù)顯著降低，而凋亡率顯著升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。七氟醚(5.1%)處理后GES1細胞活力、遷移細胞數(shù)、凋亡率無顯著變化。見圖1，表1。

圖1 不同濃度七氟醚對胃癌細胞SNU-1細胞凋亡的影響

表1 不同濃度七氟醚對胃癌細胞SNU-1細胞增殖、凋亡及遷移的影響

2.2 不同濃度七氟醚對胃癌細胞SNU-1中CyclinD1、Cleaved-caspase-3、MMP2、MMP9蛋白表達的影響 不同劑量七氟醚處理后SNU-1細胞中CyclinD1、MMP-2和MMP-9蛋白表達量顯著降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，而Cleaved-caspase-3蛋白表達量顯著升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見圖2，表2。

圖2 七氟醚對胃癌細胞SNU-1中CyclinD1、Cleaved-caspase-3、MMP-2、MMP-9蛋白表達的影響

表2 七氟醚對胃癌細胞SNU-1中CyclinD1、Cleaved-caspase-3、MMP-2、MMP-9蛋白表達的影響

2.3 不同濃度七氟醚對miR-4458表達的影響 不同劑量七氟醚處理后SNU-1細胞中miR-4458表達量顯著升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表3。

2.4 miR-4458對胃癌細胞SNU-1細胞增殖、凋亡及遷移的影響 與miR-NC組比較，miR-4458組SNU-1細胞miR-4458表達量顯著升高(P<0.05)，細胞活力、細胞遷移數(shù)量、CyclinD1、MMP-2以及MMP-9蛋白

表3 七氟醚對miR-4458表達的影響

表達量顯著降低(P<0.05)，凋亡率、Cleaved-caspase-3蛋白表達量顯著升高(P<0.05)。與anti-miR-4458組比較，anti-miR-4458組SNU-1細胞miR-4458表達量顯著降低(P<0.05)，細胞活力、細胞遷移數(shù)量、CyclinD1、MMP-2以及MMP-9蛋白表達量顯著升高(P<0.05)，凋亡率、Cleaved-caspase-3蛋白表達量顯著降低(P<0.05)。見表4，圖3。

表4 miR-4458對胃癌細胞SNU-1細胞增殖、凋亡及遷移的影響

圖3 Western Blot檢測CyclinD1、Cleaved-caspase-3、MMP-2、MMP-9蛋白的表達

2.5 抑制miR-4458表達逆轉(zhuǎn)七氟醚對胃癌細胞SNU-1細胞增殖、凋亡及遷移的影響 與5.1%給藥+anti-miR-NC組比較，5.1%給藥+anti-miR-4458組SNU-1細胞miR-4458表達量顯著降低(P<0.05)，細胞活力、細胞遷移數(shù)量、CyclinD1、MMP-2以及MMP-9蛋白表達量顯著升高(P<0.05)，凋亡率、Cleaved-caspase-3蛋白表達量顯著降低(P<0.05)。見圖4，表5。

圖4 Western Blot檢測CyclinD1、Cleaved-caspase-3、MMP-2、MMP-9蛋白的表達

表5 anti-miR-4458逆轉(zhuǎn)七氟醚對胃癌細胞SNU-1細胞增殖、凋亡及遷移的影響

3 討論

癌細胞的異常遷移和侵襲在胃癌復發(fā)中具有重要作用。已有研究顯示麻醉藥的使用可影響癌癥患者的臨床結局。七氟醚是臨床常用吸入性麻醉劑，已被證實在肺癌、乳腺癌等多種實體腫瘤中具有抗增殖、抗轉(zhuǎn)移和促凋亡作用[11]。Yang等[12]研究顯示七氟醚可能通過抑制ERK信號通路參與結腸癌上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化調(diào)控抑癌細胞增殖和轉(zhuǎn)移，并誘導細胞凋亡和自噬。Kang等[13]報道七氟醚調(diào)控絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)信號通路以劑量依賴的方式抑制了卵巢癌細胞的增殖、遷移和侵襲，并促進細胞凋亡。與上述研究類似，本研究中七氟醚處理后SNU-1細胞活力、侵襲數(shù)量顯著降低，而細胞凋亡率顯著增加，并呈劑量依賴效應。CyclinD1是細胞周期調(diào)控重要參與者，其通過促進周期向S期推進具有抗增殖作用，研究指出川芎嗪通過下調(diào)CyclinD1表達誘導G1期阻滯具有顯著的抗腫瘤作用[14]。MMP-2和MMP-9能夠消化細胞外基質(zhì)和基底膜從而提高腫瘤細胞的運動能力進而促進腫瘤細胞轉(zhuǎn)移、擴散，降低MMP-2和MMP-9表達量可有效胃癌細胞的遷移和侵襲[15]。本研究中七氟醚以劑量依賴方式降低CyclinD1、MMP-2以及MMP-9表達水平，與其抗增殖、抗遷移作用相吻合。此外，本研究發(fā)現(xiàn)七氟醚處理還可降低凋亡執(zhí)行蛋白Cleaved-caspase-3表達水平。以上研究表明，七氟醚通過調(diào)控增殖、遷移和凋亡相關蛋白表達抑制胃癌細胞SNU-1增殖、遷移并誘導細胞凋亡。

miRNA通過與靶mRNA結合在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因表達進而調(diào)節(jié)腫瘤細胞多種生物學過程參與癌癥發(fā)生發(fā)展。研究表明miR-4458表達降低與肝癌患者預后差呈正相關[16]。血管瘤中過表達miR-4458顯著抑制細胞增殖、誘導細胞周期阻滯，而抑制miR-4458表達可逆轉(zhuǎn)G0/G1期阻滯和細胞凋亡[17]。此外，敲減Circ_0000337顯著促進miR-4458表達降低骨肉瘤細胞的增殖和侵襲能力從而抑制骨肉瘤進展[18]。本研究中轉(zhuǎn)染miR-4458 mimics發(fā)現(xiàn)，過表達miR-4458顯著降低SNU-1細胞活力和遷移能力，下調(diào)CyclinD1、MMP-2以及MMP-9表達，上調(diào)Cleaved-caspase-3，并促進細胞凋亡，而轉(zhuǎn)染anti-miR-4458抑制miR-4458表達則促進SNU-1細胞增殖和遷移，抑制細胞凋亡，這提示miR-4458在胃癌中具有抑癌作用。

近年來多項研究指出七氟醚通過調(diào)節(jié)miRNA表達對癌細胞發(fā)揮作用[17-20]。如七氟醚通過上調(diào)miR-124-3p表達抑制Rho相關的卷曲蛋白激酶(ROCK1)信號通路進而抑制膠質(zhì)瘤細胞增殖和轉(zhuǎn)移[19]。結腸癌中七氟醚通過調(diào)節(jié)miR-203表達抑制細胞外信號調(diào)節(jié)激酶(ERK)/MMP-9通路抑制癌細胞遷移和侵襲[20]。本研究中七氟醚處理后SNU-1細胞中miR-4458表達呈以劑量依賴方式增加，提示七氟醚在胃癌中抗腫瘤作用與誘導miR-4458表達增加有關。深入研究顯示，抑制miR-4458表達還可逆轉(zhuǎn)七氟醚對SNU-1細胞增殖、遷移、凋亡以及相關蛋白表達的影響，恢復SNU-1細胞增殖、遷移能力以及凋亡水平。以上研究提示七氟醚通過上調(diào)SNU-1細胞中miR-4458水平發(fā)揮其抗增殖、抗侵襲和促凋亡作用。

綜上所述，本研究證實七氟醚通可抑制胃癌SNU-1細胞增殖和遷移，并誘導細胞凋亡，其機制與過上調(diào)miR-4458表達有關。這些發(fā)現(xiàn)有助于全面了解七氟醚的藥理作用，為胃癌患者選擇更合理的麻醉藥提供實驗依據(jù)。