釉基質(zhì)蛋白衍生物對牙周組織再生相關(guān)細(xì)胞的生物學(xué)作用及其成血管作用的研究進(jìn)展

莊齊翔，董家辰，束 蓉

上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院牙周病科，上海交通大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院，國家口腔醫(yī)學(xué)中心，國家口腔疾病臨床醫(yī)學(xué)研究中心，上海市口腔醫(yī)學(xué)重點實驗室，上海 200011

牙周病是口腔兩大疾病之一，可引起牙周支持組織不可逆的破壞，臨床表現(xiàn)為牙齦退縮、牙齒松動甚至出現(xiàn)牙列缺損或缺失。牙周病較理想的治療結(jié)果是牙周組織再生。引導(dǎo)性組織再生術(shù)（guided tissueregeneration，GTR）被認(rèn)為是臨床上牙周再生性手術(shù)的“金標(biāo)準(zhǔn)”［1］。早在1982年，GTR這一概念被Nyman等［2］提出。隨后，Ivanovski等［3］的研究發(fā)現(xiàn)該技術(shù)可通過膜性材料阻擋牙齦上皮在愈合期沿根面生長，提供空間引導(dǎo)牙周膜細(xì)胞優(yōu)先占領(lǐng)根面，進(jìn)而達(dá)到牙周組織的再生。同期，又有學(xué)者證實釉基質(zhì)蛋白（enamel matrix protein，EMP）在牙根發(fā)育中可發(fā)揮重要作用。而后，EMP被開發(fā)成釉基質(zhì)蛋白衍生物（enamel matrix derivative，EMD），研究［4］顯示在臨床上其可被直接植入牙槽骨缺損處，促進(jìn)病損區(qū)域牙周組織的再生；且20多年的臨床應(yīng)用成果表明，EMD是鮮少能夠促進(jìn)牙周組織再生的生物材料之一。

1 EMD概述

1982年Lindskog［5］對猴子發(fā)育過程中的牙根表面進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)了釉質(zhì)特異性蛋白。7年后，Slavkin等［6］在動物實驗中證實，此蛋白是上皮根鞘內(nèi)層細(xì)胞所分泌的EMP，同時還指出EMP與牙骨質(zhì)形成間可能存在關(guān)聯(lián)。采用放射自顯影及掃描電鏡的相關(guān)研究［7］證實，包繞牙根的上皮根鞘細(xì)胞會釋放EMP到牙根表面，牙囊的外胚間充質(zhì)細(xì)胞與根面接觸后可在EMP的誘導(dǎo)下分化為成牙骨質(zhì)細(xì)胞，由該細(xì)胞分泌的基質(zhì)可礦化形成牙骨質(zhì)，而這些新生的牙骨質(zhì)可誘導(dǎo)牙周膜及牙槽骨的形成［7］。

EMD是從牙齒發(fā)育期的釉質(zhì)中提取的蛋白質(zhì)混合物，主要活性成分為釉原蛋白（amelogenin，Am），占蛋白總量的90%；其他成分還包含釉蛋白及成釉蛋白等，且EMD的成分和生理功能與EMP相似［4，8-9］。由于人的牙胚不易獲取，且Am的基因序列在不同種屬來源間高度保守，因此研究者常采用酸提取法從豬的牙胚組織中獲得EMD，并與相應(yīng)載體結(jié)合后凍干保存。如瑞典Biora公司的Emdogain?，即是從豬的胚胎發(fā)育期釉質(zhì)中提取EMD后溶于載體丙二醇藻酸酯內(nèi)制成的針劑。臨床上該針劑可直接注射在牙周組織缺損處，主要應(yīng)用于垂直骨缺損、根分叉病變和牙齦退縮等治療［4，8-10］。

2 EMD與牙周組織再生技術(shù)的發(fā)展

傳統(tǒng)的牙周治療可通過清除病原體和壞死組織以控制疾病的發(fā)展，但只有少量的牙周組織可在治療部位再生［11］。為進(jìn)一步提升牙周病的治療效果，在菌斑控制的基礎(chǔ)上獲得牙周缺損組織的再生是牙周病治療的理想目標(biāo)。Wennstr?m等［12］比較了28例受試者的深牙周袋在翻瓣清創(chuàng)后植入EMD（實驗組）或丙二醇藻酸酯（對照組）的術(shù)后情況，結(jié)果顯示在為期3周的臨床試驗中，實驗組受試者的探診深度和牙齦指數(shù)在第1周就有明顯好轉(zhuǎn)，在2周后的探診深度均小于4 mm、牙齦指數(shù)均為0，且實驗組受試者的術(shù)后反應(yīng)也小于對照組；提示EMD有助于牙周組織的愈合。另有多中心研究［11］指出，發(fā)生牙齦退縮的患牙可采用EMD聯(lián)合冠向復(fù)位瓣（coronally advanced flap，CAF）及結(jié)締組織移植術(shù)（connective tissue graft，CTG）進(jìn)行修復(fù)，以提高患牙的根面覆蓋率；該研究的組織學(xué)證據(jù)顯示，CAF＋EMD組的患牙根面有新生牙骨質(zhì)的形成，而CAF＋CTG組則無新生牙骨質(zhì)形成（組織學(xué)表現(xiàn)為長結(jié)合上皮愈合）；提示EMD可促進(jìn)牙周組織的再生。除了上述臨床文獻(xiàn)外，以往研究發(fā)現(xiàn)EMD有良好的牙周缺損修復(fù)效果，不僅可促進(jìn)無細(xì)胞牙骨質(zhì)再生及牙周膜細(xì)胞的增殖和分化，還能在組織學(xué)上呈現(xiàn)出真正的牙周組織再生［4，10］。

3 EMD對牙周組織再生相關(guān)細(xì)胞的作用

近年來，隨著組織工程和干細(xì)胞再生技術(shù)的日趨成熟，結(jié)合種子細(xì)胞、生長因子及支架材料的牙周組織工程已成為該領(lǐng)域研究中的新興熱點。也正是基于上述研究結(jié)果，EMD成為了生長因子的最佳選擇之一，許多著重于EMD對牙周組織相關(guān)細(xì)胞作用的研究也相繼增多［10，13-16］。

牙齦成纖維細(xì)胞（gingival fibroblast，GF）是牙齦固有層的主要細(xì)胞，具有分泌膠原纖維、維持及改建牙齦結(jié)締組織的功能。Sakoda等［17］的實驗結(jié)果顯示，一定劑量的EMD可刺激人牙齦成纖維細(xì)胞（human gingival fibroblast，HGF）分泌轉(zhuǎn)化生長因子-β1（transforming growth factorβ1，TGF-β1）和堿性成纖維細(xì)胞生長因子（basic fibroblast growth factor，bFGF），而該2個因子又可通過胞外信號調(diào)節(jié)激酶（extracellular signal-regulated kinase，ERK）、p38絲裂原活化蛋白激酶（p38 mitogenactivated protein kinases，p38MAPK）和磷脂酰肌醇-3-激酶/絲蘇氨酸蛋白激酶（phosphatidyl-inositol 3-kinase/AKT serine-threonine kinase，PI3K/AKT）等通路刺激HGF分泌血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）。Wang等［18］的研究表明一定劑量的EMD能促進(jìn)HGF的增殖和遷移，同時還可上調(diào)HGF中Ⅰ型膠原纖維和VEGF-A的表達(dá)水平。Wyganowska-Swiatkowska等［19］的研究指出EMD不僅可刺激HGF的增殖，還可促進(jìn)HGF分泌透明質(zhì)酸和蛋白聚糖。綜合上述文獻(xiàn)我們發(fā)現(xiàn)，EMD能夠促進(jìn)HGF的增殖，提高胞外基質(zhì)蛋白的合成，調(diào)節(jié)組織的炎癥反應(yīng)，促進(jìn)新生血管形成及組織的修復(fù)和再生。

牙周膜成纖維細(xì)胞（periodontal ligament cell，PDLC）是牙周膜中數(shù)量最多、功能最重要的細(xì)胞，不僅能夠高效率地合成及分解胞外基質(zhì)的膠原蛋白，還具備分化為成骨細(xì)胞和成牙骨質(zhì)細(xì)胞的潛能，可參與牙周組織的改建、更新及修復(fù)。Miron等［20］研究發(fā)現(xiàn)，人牙周膜成纖維細(xì)胞（human periodontal ligament cell，hPDLC）受EMD刺激一定時間后，可下調(diào)白介素-1β（interleukin 1β，IL-1β）、IL-6、IL-8和環(huán)氧化酶-2（cyclooxygenase-2，COX-2）的表達(dá)。Qi等［21］研究顯示，病變的牙骨質(zhì)可刺激體外hPDLC表達(dá)牙骨質(zhì)附著蛋白（cementum attachment protein，CAP）和牙骨質(zhì)蛋白-1（cementum protein-1，CEMP1）；同時，該研究還發(fā)現(xiàn)EMD在體內(nèi)實驗中可促進(jìn)這一行為，在牙骨質(zhì)表面形成新生牙骨質(zhì)樣結(jié)構(gòu)。Villa等［22］的研究發(fā)現(xiàn)EMD的不同成分可對hPDLC揮發(fā)不同作用，其中相對分子質(zhì)量大于20 000的成分可促進(jìn)VEGF和IL-6的分泌，相對分子質(zhì)量在5 000左右的成分可促進(jìn)IL-4、IL-8和單核細(xì)胞趨化因子-1（monocyte chemoattractant protein-1，MCP-1）的 分 泌。Heng等［23］的研究表明，EMD可上調(diào)hPDLC對結(jié)締組織生長因子（connective tissue growth factor，CTGF）和TGF-β的分泌。綜合上述文獻(xiàn)可知，EMD能夠促進(jìn)hPDLC的增殖，下調(diào)炎癥相關(guān)細(xì)胞因子的表達(dá)，上調(diào)牙骨質(zhì)和成血管相關(guān)基因的表達(dá)，有利于牙周組織的再生。

牙周膜干細(xì)胞（periodontal ligament stem cell，PDLSC）存在于牙周膜中，屬于牙源性間充質(zhì)干細(xì)胞的成員之一，具有自我更新及多向分化的潛能［24-25］。Wang等［26］的研究表明，EMD能促進(jìn)人牙周膜干細(xì)胞（human periodontal ligament stem cell，hPDLSC）的增殖，上調(diào)Ⅰ型膠原纖維、成骨細(xì)胞特異因子-2（periostin，POSTN）、RUNX2（runt-related transcription factor 2）、骨橋 蛋 白（osteopontin，OPN）、骨 鈣 素（osteocalcin，OCN）和CAP的基因表達(dá)水平，上調(diào)堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）和CAP的蛋白表達(dá)水平；繼而提示，EMD能夠上調(diào)hPDLSC對牙骨質(zhì)和成骨相關(guān)基因的表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞分化為成牙骨質(zhì)細(xì)胞和成骨細(xì)胞，生成新的牙骨質(zhì)和牙槽骨。

除上述細(xì)胞外，Miron等［20］的研究發(fā)現(xiàn)EMD可上調(diào)成骨細(xì)胞表達(dá)核因子κB受體活化因子配體（receptor activator of nuclear factorκB ligand，RANKL），進(jìn)而促進(jìn)成骨細(xì)胞的增殖。Miron等［27］的另一項研究也表明，EMD可上調(diào)成骨細(xì)胞中TGF-β1、ALP和Ⅰ型膠原纖維的基因表達(dá)水平，下調(diào)IL-1β的基因表達(dá)水平。上述文獻(xiàn)均提示，EMD能夠促進(jìn)成骨細(xì)胞的增殖和分化，上調(diào)成骨相關(guān)基因的表達(dá)，下調(diào)炎癥相關(guān)基因的表達(dá)，從而促進(jìn)牙槽骨再生。另外，Wyganowska-Swiatkowska等［28］的研究顯示，一定濃度的重組豬釉原蛋白（recombinant porcine amelogenin，rPAm）可抑制人舌鱗癌細(xì)胞（SCC-25）的增殖和遷移，提示EMD中的蛋白質(zhì)成分可防止上皮細(xì)胞過早定植于缺損區(qū)，給予再生相關(guān)細(xì)胞（如PDLC等）充足的時間來分化、增殖并遷移到組織缺損處，從而增進(jìn)牙周組織的再生。

4 EMD的成血管作用

成血管作用（angiogenesis）是從既有血管延伸產(chǎn)生新生血管的過程，可在組織再生過程中發(fā)揮重要作用。血管內(nèi)皮細(xì)胞是參與成血管作用的主要細(xì)胞，需歷經(jīng)脫離基底膜、細(xì)胞遷移、細(xì)胞增殖和生成管狀樣結(jié)構(gòu)等一系列步驟實現(xiàn)血管新生。血管內(nèi)皮細(xì)胞的成血管作用是由TGF-β、肝細(xì)胞生長因子（hepatocyte growth factor，HGF）、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factorα，TNFα）、血管生成素-2（angiopoietin-2，ANG-2）、IL-8、bFGF、血小板衍生生長因子（platelet derived growth factor，PDGF）和VEGF等多種細(xì)胞因子共同作用的結(jié)果。Aspriello等［29］對比了28例受試者的深牙周袋在翻瓣清創(chuàng)后植入EMD（實驗組）或丙二醇藻酸酯（對照組）的術(shù)后情況，于術(shù)后48 h行牙齦組織活檢，免疫組織化學(xué)的檢測結(jié)果顯示試驗組受試者的內(nèi)皮細(xì)胞來源的VEGF濃度和組織微血管密度（microvessel density，MVD）均較對照組升高。Amin等［30］的研究表明，EMD及富含酪氨酸的釉原蛋白多肽（tyrosine-rich amelogenin peptide，TRAP）可促進(jìn)hPDLC分化成血管內(nèi)皮細(xì)胞，其中TRAP又可上調(diào)hPDLC對血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子受體2（vascular endothelial growth factor receptor 2，VEGFR2）、酪氨酸激酶含免疫球蛋白樣和EGF樣域1（tyrosine kinase with immunoglobulin-like and EGF-like domains 1，TIE1）、血管生成素-1受體和血管內(nèi)皮細(xì)胞鈣黏蛋白（vascular endothelial cadherin，VE-cadherin）的基因表達(dá)水平。Miron等［20］的研究指出，EMD可促進(jìn)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（human umbilical vein endothelial cell，HUVEC）的增殖和遷移，上調(diào)HUVEC中細(xì)胞間黏附分子-1（intercellular adhesion molecule 1，ICAM-1）、E-選擇素（E-selectin）和ANG-2的基因表達(dá)水平。Andrukhov等［31］的研究顯示，EMD可提高HUVEC中E-選擇素的基因表達(dá)水平，其中相對分子質(zhì)量小于8 000的成分還可上調(diào)ICAM-1、血管性血友病因子（von Willebrand factor，vWF）、VEGFR1和VEGFR2的表達(dá)。同樣地，Jonke等［32］的研究發(fā)現(xiàn)EMD和TRAP可提高HUVEC中ICAM-1、E-選擇素、vWF、VEGFR1和VEGFR2的表達(dá)水平，且在體外成血管實驗中刺激HUVEC形成血管樣結(jié)構(gòu)。Park等［33］的實驗顯示，EMD可促進(jìn)HUVEC的增殖和黏附。

5 總結(jié)與展望

綜上所述，EMD可通過促進(jìn)牙周組織再生相關(guān)細(xì)胞的增殖和遷移、上調(diào)成骨和成牙骨質(zhì)相關(guān)基因的表達(dá)、下調(diào)炎癥相關(guān)細(xì)胞因子的分泌、刺激成血管相關(guān)膜蛋白的表達(dá)及細(xì)胞因子的分泌，促進(jìn)牙周組織的再生。此外，EMD的成血管作用不是僅針對血管內(nèi)皮細(xì)胞，而是對整體牙周再生相關(guān)細(xì)胞進(jìn)行刺激后的結(jié)果。血管內(nèi)皮細(xì)胞是成血管作用中的基礎(chǔ)細(xì)胞，EMD在促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖的同時，還可刺激hPDLC分化成血管內(nèi)皮細(xì)胞。EMD可刺激GF和PDLC分泌VEGF和TGF-β，而后兩者可作為血管內(nèi)皮細(xì)胞的趨化因子，同時EMD也可上調(diào)血管內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)VEGFR1和VEGFR2，在上述2個過程的共同作用下促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞向組織缺損區(qū)遷移。GF和PDLC分泌的VEGF可誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞在組織缺損區(qū)組建成血管樣結(jié)構(gòu)，同時EMD可刺激血管內(nèi)皮細(xì)胞分泌ANG-2，進(jìn)而促使血管樣結(jié)構(gòu)成熟為新生血管。另外，EMD對炎癥因子、炎癥細(xì)胞及血小板的調(diào)節(jié)也能夠促進(jìn)組織愈合和血管新生。EMD對整體牙周組織再生相關(guān)細(xì)胞的作用增強(qiáng)了牙周組織成血管化的效應(yīng)，但目前有關(guān)牙周組織血管化再生的具體機(jī)制尚不清楚，且不同EMD成分的作用也不盡相同，不同成分間的交互作用還有待厘清，因此這都將是今后的重點研究方向。

參·考·文·獻(xiàn)

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