枸杞多糖的抗氧化作用在眼科的研究現(xiàn)狀

栗鎣，寇列玲，沈蘭珂

枸杞子，性味甘平，歸肝、腎兩經(jīng)，具有滋補(bǔ)肝腎、益精明目的功效，為藥食兩用之品。中醫(yī)古籍對于枸杞子的首次記載出現(xiàn)于《神農(nóng)本草經(jīng)》[1]。自此以后歷代醫(yī)家對于枸杞子的性味歸經(jīng)、功效主治等方面都有了很多論述和探究[2]。隨著科學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，現(xiàn)代醫(yī)學(xué)工作者從枸杞子中分離了很多種活性成分，如枸杞多糖（lycium bararum polysaccharides，LBP）、枸杞黃酮、枸杞色素、類蘿卜素等。目前對于眼部疾病來說最有效的成分是LBP 和類胡蘿卜素[3-4]。LBP 是從枸杞的干燥成熟果實中經(jīng)過脫脂、水提、反復(fù)醇沉所得，是目前枸杞子的生物結(jié)構(gòu)中最重要的成分之一，也是一種天然的抗氧化劑。本文將對LBP 抗氧化機(jī)制在眼科諸多疾病中的作用進(jìn)行整合綜述，從而為LBP 及其他相關(guān)物質(zhì)對眼科疾病的進(jìn)一步研究和臨床應(yīng)用提供一定的理論依據(jù)。

1 LBP 的抗氧化機(jī)制

機(jī)體在與外界不斷接觸的過程中，由于自然環(huán)境的污染、放射線照射等外界因素以及機(jī)體自身代謝因素都會使機(jī)體產(chǎn)生自由基。一般來說自由基的產(chǎn)生量與其清除量長期處于一種相對平衡的狀態(tài)，這種平衡的狀態(tài)有利于維持人體正常的生命活動。但是在某些異常情況下，當(dāng)自由基的產(chǎn)生量超過其清除量時就會打破這一穩(wěn)態(tài)，即為氧化應(yīng)激（oxidative stress，OS）。OS 會對人體的免疫系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)等各方面產(chǎn)生嚴(yán)重的影響而導(dǎo)致多種疾病的發(fā)生[5]。眼球作為一個視覺器官，長期接受光刺激且部分暴露于外界環(huán)境，在機(jī)體內(nèi)環(huán)境發(fā)生變化時極易出現(xiàn)氧化損傷，所以O(shè)S 與多種眼科疾病的發(fā)生發(fā)展均有著密切聯(lián)系[6-7]。通過提高機(jī)體抗氧化能力能夠在一定程度上對這些疾病起到預(yù)防及治療作用，所以尋找安全有效的抗氧化藥物對眼科疾病的防治尤為重要。LBP 的抗氧化作用是通過直接清除自由基、提高抗氧化酶活性以及調(diào)控凋亡相關(guān)基因表達(dá)等多方面實現(xiàn)的[8]。

1.1 直接清除自由基，防止過氧化反應(yīng)

活性氧自由基（reactive oxygen species，ROS）是機(jī)體自身在代謝過程中所產(chǎn)生的一種活性成分，包括超氧陰離子（superoxide radical，O2-）、羥自由基（hydroxyl free radical，-OH）以及過氧化氫（hydrogen peroxide，H2O2）。適量的ROS 既可以作為第二信使分子促進(jìn)正常的細(xì)胞分裂增殖、組織更新、介導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)信號的傳導(dǎo)，還可以清除體內(nèi)的病原體，對維持機(jī)體的正常生理活動有著重要作用。但是過量的ROS 會導(dǎo)致脂質(zhì)過氧化、DNA 斷裂以及蛋白質(zhì)變性等損害而發(fā)生過氧化反應(yīng)，致使細(xì)胞損傷和疾病的發(fā)生[9]。Zhang 等[10]在LBP 的體外抗氧化活性實驗中采用紫外分光光度法測定其清除自由基的能力，實驗結(jié)果表明，LBP 在一定程度上能夠清除O2-、-OH、二苯代苦味?；?,1-diphenyl-2-picryl-hydyazyl，DPPH）自由基和ABTs 自由基，并且其清除能力與LBP 的濃度呈正相關(guān)，但是當(dāng)濃度達(dá)到一定值時清除率達(dá)到平穩(wěn)的狀態(tài)則不再隨著濃度的增加而提高。

1.2 提高抗氧化酶活性，減少脂質(zhì)過氧化物產(chǎn)生

抗氧化酶包括超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GSHPx）、過氧化氫酶（catalase，CAT）等，可以減緩機(jī)體的氧化速度。GSH-Px 是機(jī)體內(nèi)廣泛存在的一種過氧化物分解酶，它可以將有毒的過氧化物還原成無毒的羥基化合物，是判斷機(jī)體抗過氧化能力的重要指標(biāo)之一[11]。SOD 是一類重要的氧化劑、清除劑，它可以催化超氧化物轉(zhuǎn)化為氧氣（O2）和H2O2，具有抵抗OS 的作用[12]。CAT 的抗氧化作用主要是通過催化分解H2O2生成H2O 和O2來實現(xiàn)的。這三種抗氧化酶均能夠清除組織中的過氧化物，降低氧化損傷對機(jī)體的傷害程度。LBP可以通過激活這些抗氧化酶來提高機(jī)體的抗氧化水平。Li 等[13]使用SD 大鼠，通過一次性腹腔注射鏈脲佐菌素（streptozotocin，STZ）（50 mg/kg）構(gòu)建糖尿病動物模型，實驗組給予LBP飲水喂養(yǎng)30 d，相較于對照組，其MDA 水平降低，SOD、CAT、GST 和GPx 酶活性提高，由此可見機(jī)體的抗氧化能力增強(qiáng)。

1.3 調(diào)控凋亡基因表達(dá)，減輕氧化損傷

細(xì)胞凋亡是氧化損傷過程中的一個重要環(huán)節(jié)。B 細(xì)胞淋巴瘤/白血病-2（B cell lymphoma/likenia-2，Bcl-2）是目前已知最強(qiáng)的凋亡抑制因子，可以阻礙凋亡基因信號的傳遞。B 細(xì)胞淋巴瘤-2 關(guān)聯(lián)性X 蛋白（Bcl-2 associated X protein，Bax）則屬于促凋亡因子，可以促進(jìn)凋亡基因信號的傳遞[14]。LBP 可通過調(diào)控凋亡途徑中相關(guān)基因的表達(dá)來發(fā)揮其抗氧化作用，通過上調(diào)Bcl-2 的表達(dá)和減少Bax 的表達(dá)以達(dá)到降低ROS 產(chǎn)生、提高抗氧化酶活性及糾正線粒體膜電位的作用，從而減輕機(jī)體氧化損傷[15]。半胱氨酸天冬氨酸特異性蛋白酶（caspase）家族也是凋亡的重要參與者，其中caspase-3 是其下游最關(guān)鍵的蛋白酶，是凋亡進(jìn)入不可逆階段的標(biāo)志。王海彬等[16]使用STZ 構(gòu)建大鼠糖尿病模型研究糖尿病視網(wǎng)膜病變（diabetic retinopathy，DR）時 發(fā) 現(xiàn)，LBP 能 增 加Bcl-2 的 表 達(dá) 和 降 低Bax、caspase-3 的表達(dá)，從而抑制視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞（retinal ganglion cells，RGCs）凋亡。

2 LBP 與眼科疾病

2.1 LBP 與年齡相關(guān)性黃斑變性

年齡相關(guān)性黃斑變性（age-related macular degeneration，AMD）是黃斑的衰老性改變，好發(fā)于50 歲及以上的中老年人，呈進(jìn)行性發(fā)展，可導(dǎo)致單眼或雙眼部分甚至完全性視力喪失，是老年人視力喪失的主要原因。其早期特征為玻璃膜疣（drusen）和視網(wǎng)膜色素上皮（retina pigment epithelium，RPE）細(xì)胞的改變。其確切病因尚不明確，可能與遺傳因素、環(huán)境影響、視網(wǎng)膜慢性光損傷、營養(yǎng)失調(diào)、代謝障礙等有關(guān)[17]。在此之前已有研究[18]表明，OS 作用在AMD 的形成發(fā)展中至關(guān)重要。

RPE 細(xì)胞可以通過吸收多余的光從而防止視網(wǎng)膜受到光誘導(dǎo)損傷[19]，因此在視網(wǎng)膜光損傷的過程中RPE 細(xì)胞最先出現(xiàn)損傷最終導(dǎo)致AMD，二者密切相關(guān)[20]，所以常構(gòu)建RPE 細(xì)胞光損傷模型用來研究AMD。黃潔等[21]利用（16500±200）Lux 的LED 冷光燈光照細(xì)胞12 h，體外培養(yǎng)人RPE 細(xì)胞株（ARPE-19）建立光損傷模型，使用不同劑量的LBP 對細(xì)胞模型進(jìn)行處理后發(fā)現(xiàn)，LBP 高、低劑量組較對照組SOD 表達(dá)增高和ROS、MDA 表達(dá)降低，說明LBP 可以增強(qiáng)ARPE 細(xì)胞的抗氧化能力，在光誘導(dǎo)損傷時對其起到一定的保護(hù)作用。趙芳芳等[22]用原代兔RPE 細(xì)胞株體外培養(yǎng)構(gòu)建細(xì)胞光損傷模型，分別用低、中、高不同濃度的LBP 進(jìn)行干預(yù)后發(fā)現(xiàn)，LBP可以有效抑制Cyt-C、Caspase-9、Caspase-3 的表達(dá)，并且以LBP 高濃度組的抑制效果最為明顯。由此可以看出，LBP 可能通過線粒體信號通路抑制細(xì)胞凋亡以減輕機(jī)體氧化損傷。

2.2 LBP 與糖尿病視網(wǎng)膜病變

DR 是糖尿病最為常見的眼部并發(fā)癥。由于持續(xù)的高血糖狀態(tài)使得小血管受到破壞導(dǎo)致視網(wǎng)膜出現(xiàn)微血管瘤、滲出、出血等病理性改變，是一種常見的視網(wǎng)膜微血管病變。

DR 的發(fā)病機(jī)制可能主要與多元醇代謝通路的異常、蛋白質(zhì)非酶糖基化產(chǎn)物的堆積、蛋白激酶C（PKC）的活化、血管緊張素轉(zhuǎn)換酶系統(tǒng)的作用等有關(guān)[23]。糖尿病患者早期的視網(wǎng)膜病變主要表現(xiàn)在RGCs 的凋亡以及神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的活化[24-25]。由于長期處于高血糖狀態(tài)，高血糖的毒性不僅能引起視網(wǎng)膜微血管的病變還可以增加ROS 的產(chǎn)生而引起氧化損傷，最終導(dǎo)致DR 的發(fā)生，所以O(shè)S 在DR 的發(fā)病機(jī)制中起著至關(guān)重要的作用。GUO 等[26]使用LBP 對SD 大鼠DR 模型進(jìn)行灌胃處理后觀察其視網(wǎng)膜超微結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)，LBP 治療組大鼠的RGCs、光感受器細(xì)胞等未見明顯異常，雙極細(xì)胞和Müller 細(xì)胞的胞漿中較DR 模型組僅可見少量、輕度的線粒體改變。由此可見，LBP 可以通過發(fā)揮其抗氧化能力明顯減輕線粒體的病理改變，阻止神經(jīng)細(xì)胞凋亡。核轉(zhuǎn)錄因子NFE2 相關(guān)因子（nuclear factor erythroid-2 related factor，Nrf2）是細(xì)胞OS 反應(yīng)中的關(guān)鍵因子，Nrf2 能夠與抗氧化反應(yīng)元件（anti-oxidative response element，ARE）相互作用，誘導(dǎo)抗氧化蛋白的表達(dá)，降低ROS 的 水 平[27]。Pan H 等[28]利 用LBP 干 預(yù)SD 大 鼠DR 模型，檢測體重、血糖、ROS、Nrf2 和血紅素加氧酶-1（heme oxygenase-1，HO-1）的蛋白表達(dá)，發(fā)現(xiàn)LBP 不僅可以使SD 大鼠體重升高、血糖降低，還可以通過激活Nrf2/HO-1 信號通路來降低ROS 的表達(dá)。由此可見，LBP 可以改善糖尿病鼠視網(wǎng)膜的OS 狀態(tài)，有望將其應(yīng)用于DR 的早期防治。

2.3 LBP 與青光眼

青光眼是以進(jìn)行性、特征性視神經(jīng)損害，最終導(dǎo)致視野缺損、視力喪失為特征的一類眼病。它是第1 位不可逆的致盲性眼病，也是全球?qū)е率鞯牡诙蟛∫騕29]。青光眼的發(fā)病原因極其復(fù)雜，目前研究[30]表明，RGCs 的進(jìn)行性凋亡及視神經(jīng)纖維的丟失是青光眼進(jìn)展的病理基礎(chǔ)，而OS 廣泛參與青光眼的發(fā)生發(fā)展。

近年來，H2O2誘導(dǎo)的細(xì)胞模型被廣泛應(yīng)用于OS 的各類研究[31]。李貞等[32]用H2O2誘導(dǎo)視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞-5（retinal ganglion cells-5，RGC-5）建立青光眼模型后使用LBP 進(jìn)行干預(yù)，用DAPI 染色法觀察其形態(tài)學(xué)表現(xiàn)，H2O2組可見典型的細(xì)胞凋亡特征：不同程度的染色質(zhì)固縮、聚集、邊緣化，表現(xiàn)為濃染致密的藍(lán)色熒光。而H2O2+LBP 組RGC-5 細(xì)胞核基本完整，僅可見少量的細(xì)胞染色質(zhì)濃縮現(xiàn)象，說明LBP 能夠保護(hù)OS 損傷狀態(tài)下的RGCs。另一方面，LBP 抑制了Caspase-3、Bax 和c-Myc 的表達(dá)，上調(diào)了Bcl-2 的表達(dá)，從而減少RGCs的凋亡。Liu 等[33]用LBP（0.5 mg/ml）對氯化鈷誘導(dǎo)RGC-5 氧化損傷模型進(jìn)行預(yù)處理后發(fā)現(xiàn)，LBP 可以通過降低線粒體膜電位和減少活性氧的產(chǎn)生，從而發(fā)揮對RGC-5 細(xì)胞的保護(hù)作用。

2.4 LBP 與視網(wǎng)膜色素變性

視網(wǎng)膜色素變性（retinitis pigmentosa，RP）是一種最常見的遺傳性視網(wǎng)膜疾病，以感光細(xì)胞和RPE 共同發(fā)生的退行性病變?yōu)橹饕卣鳌Ｄ壳?，RP 的遺傳方式有3 種，主要包括常染色體顯性遺傳、常染色體隱性遺傳、X 連鎖隱性遺傳，臨床上也偶可見散發(fā)[34]。在常染色體隱性遺傳性RP 基因中與編碼磷酸二酯酶6（Pde6）復(fù)合體相關(guān)的2 個基因突變，即編碼磷酸二酯酶6A（Pde6a）和編碼磷酸二酯酶6B（Pde6b）是常染色體隱性遺傳性RP 的第二常見病因。研究[35]發(fā)現(xiàn)，rd 小鼠也是由于Pde6b 基因突變所致，與原發(fā)性RP 常染色體隱性遺傳病的人類具有同樣的基因變異以及相似的基因表型，所以rd 小鼠常用來作為RP 的動物模型。

Wang 等[36]用rd 10 小鼠建立RP 動物模型給予LBP 干預(yù)，發(fā)現(xiàn)LBP 對小鼠視網(wǎng)膜形態(tài)具有保護(hù)作用。另外，GSH、氧化型谷胱甘肽（glutathione oxidized，GSSG）的比值（GSH/GSSG）是OS 水平的一個常用檢測指標(biāo)，LBP 可增加GSH/GSSG 的表達(dá)以提高機(jī)體抗氧化能力[37]。缺氧誘導(dǎo)因子[38]（hypoxia inducible factor-1α，HIF-1α）可以激活P53 的轉(zhuǎn)錄，從而促進(jìn)Bax、caspase-3/7 等凋亡蛋白的轉(zhuǎn)錄。而LBP 可以使在光感受器變性過程中本來增加的HIF-1α 和caspase-3/7 表達(dá)降低，從而延緩光感受器細(xì)胞的凋亡。

2.5 LBP 與其他眼科疾病

枸杞子作為一味清肝明目的藥材，其多糖提取物對多種眼科疾病皆具有良好的保護(hù)作用。劉求紅等[39]研究發(fā)現(xiàn)，LBP可能通過提高晶狀體的抗氧化作用和促進(jìn)晶狀體上皮細(xì)胞HSP27 表達(dá)來降低糖尿病性白內(nèi)障大鼠晶狀體混濁度，另外還可以改善體重降低和高血糖的情況。LBP 的抗氧化作用對于年齡相關(guān)性白內(nèi)障[40]、急性高眼壓癥[41]、慢性高眼壓癥[42]等方面也有一些研究。

3 小結(jié)

綜上所述，LBP 可以通過直接清除ROS、提高SOD 等抗氧化酶類活性、調(diào)控Bcl-2/Bax 相關(guān)凋亡蛋白等發(fā)揮抗氧化作用。在Nrf2/HO-1 通路、Cyt-C/Caspase-9/Caspase-3 等通路上有大量的研究，但對其他的靶點和通路仍缺乏更為全面及系統(tǒng)的認(rèn)識。此外，LBP 還具有抗腫瘤、抗氧化、抗衰老等多種生物活性，對多種類型的疾病都有一定的治療作用。但這些研究成果基本都只是停留在動物實驗或者細(xì)胞實驗層面上，所以對于LBP 在眼科疾病及其他疾病的臨床應(yīng)用中仍需要進(jìn)一步探索。